XXXIV. Biologie nádorů

XXXIV/ 46. Nádorové stroma u glioblastomů a mozkových metastáz – patogenetický význam a strategie specifického cílení pro dia­gnostiku a léčbu

Bušek P.1, Balážiová E.1, Výmola P.1, Zubal M.1, Výmolová B.1, Šimková A.2, Šácha P.2, Kučka J.3, Hrubý M.3, Šedo A.1

1 1. LF UK Praha, 2 Ústav organické chemie a bio­chemie, AV ČR, v. v. i., Praha, 3 Ústav makromolekulární chemie, AV ČR, v. v. i., Praha

Východiska: Glioblastomy a mozkové metastázy patří mezi maligní nádory s mimořádně špatnou prognózou a omezenými léčebnými možnostmi. Podobně jako u jiných malignit představují různé typy nenádorových stromálních buněk jejich důležitou součást, která může přispívat k ustanovení protumorigenního nádorového mikroprostředí. Zároveň však tyto stromální buňky představují možný cíl protinádorové léčby. Cíl: Cílem našich studií je určit možný patogenetický význam stromálních mezenchymálních buněk v glioblastomech a mozkových metastázách a vyvinout látky umožňující jejich zacílení. Výsledky: V glioblastomech a mozkových metastázách různého původu jsme prokázali zvýšenou expresi fibroblastového aktivačního proteinu (FAP), membránové proteázy jen minimálně přítomné ve zdravých tkáních, která je typickým znakem stromálních mezenchymálních buněk. Přestože byl FAP u části nádorů exprimován i na maligních buňkách, ve většině případů byl přítomen především na buňkách stromatu s charakteristikami nádorově asociovaných fibroblastů. V glioblastomech korelovalo množství FAP pozitivních stromálních buněk s vaskularizací a in vitro a in vivo experimenty prokázaly, že tyto buňky mohou prostřednictvím solubilních mediátorů podporovat růst a migraci gliomových buněk a angiogenní pučení. Naše předběžná data dále prokazují jejich možný vliv na ustanovení imunosupresivního nádorového mikroprostředí. V současné době vyvíjíme a testujeme proprietární látky nesoucí dia­gnostické a terapeutické radionuklidy a využívající specifické nízkomolekulární inhibitory FAP jako cílící ligandy. Závěr: V glioblastomech a mozkových metastázách jsou přítomny stromální buňky, které exprimují FAP. Tyto FAP pozitivní stromální buňky se mohou podílet na patogenezi mozkových nádorů zvýšením růstu a migrace nádorových buněk, podporou angiogeneze a zřejmě též potlačením protinádorové imunitní odpovědi. Přítomnost FAP na těchto buňkách spolu s jeho minimální expresí v nenádorové tkáni nabízí možnost specifického zacílení nádorového mikroprostředí.

Podpořeno projektem „Centrum nádorové ekologie – výzkum nádorového mikroprostředí v organizmu podporujícího růst a šíření nádoru“ (reg. č. CZ.02.1.01/ 0.0/ 0.0/ 16_019/ 0000785), AZV NU22-03-00318 a LM2015064 EATRIS-CZ.

XXXIV/ 250. Biological dose assessment of two types of teletherapy and two types of brachytherapy

Kocsis Z.1, Ágoston P.2, Farkas G.1, Sándor G.1, Székely G.1, Kliton J.2, Gesztesi L.2, Major T.2, Pesznyák C.2, Herein A.2, Stelczer G.2, Polgár C.2, Jurányi Z.1,3

1 Department of Radiobio­logy and Dia­gnostic Onco-Cytogenetics, Center of Radiotherapy, National Institute of Oncology, Budapest, Hungary, 2 Center of Radiotherapy, National Institute of Oncology, Budapest, Hungary, 3 Department of Oncology, Semmelweis University, Budapest, Hungary

We recruited 251 prostate cancer patients. They received seed brachytherapy (69 patients), high dose rate (HDR) brachytherapy (52 patients), conventional teletherapy (55 patients) and cyberknife teletherapy (65 patients). These four radiotherapy modalities have not been ever compared in the same cohort. The overall survival at 3 years was between 97.4% (cyberknife group) and 89.9% (teletherapy group). The local relapse free survival was 98.1 ± 1.9%, 100%, 96.7 ± 2.3% and 100% in the cyberknife, HDR, seed, and conventional teletherapy groups, respectively. We observed at least 82.7 ± 5.8% bio­chemical relapse free survival (HDR brachytherapy group). The maximum was 93.8 ± 3.0% in the seed brachytherapy group. The late urinary side effects were the least frequent in case of HDR therapy and cyberknife teletherapy. However, grade 3 severe side effects emerged in similar frequencies in all treatment groups (2.4–3.3%). There were few and mild late gastrointestinal side effects. There was no grade 3 toxicity and most patients (69.0–94.7%) have not suffered any intestinal symptom. As the physical dose is modified by the sensitivity of different tissues and individual radiosensitivity, the bio­logical dose should also be analysed to assess the effects of radiotherapy. The CA technique is the gold standard of bio­logical dosimetry, which measures the absorbed dose and the individual sensitivity together. We found that the chromosome aberrations were the highest near 3 months after the radiotherapy. The teletherapy regimens caused significantly more aberrations than the brachytherapy technics. For example, the maximum total aberration value (/ 100 cells) was 17.94 ± 1.9 for conventional teletherapy; 13.98 ± 2.4 for cyberknife; 7.2 ± 0.5 for seed and 6.1 ± 1.0 for HDR brachytherapy. After 12 months the chromosome aberrations decreased but in case of conventional teletherapy and seed brachytherapy it did not reach the initial value or the 5 aberration / 100 cells baseline. The explanation can be, that damaged lymphocytes – which can have a long lifespan – can be stored in the lymph nodes and getting back to the circulation years later. These findings can be important in the light of emergence of immunotherapies. The lymphocytes, which are induced to kill tumor cells are already damaged and not restored completely after certain radiotherapy regimens. The aberrant cell values show us that there can be 13% damaged T-lymphocytes 3 months after conventional teletherapy. Furthermore, we found that CAs shortly after radiotherapy correlated significantly with cumulative late side effects, predicting them: directly after seed brachytherapy total aberrations, aberrant cell frequency and chromatid breaks correlated with late genitourinary side effects (r = 0.25, 0.26 and 0.34, respectively). In summary, we showed the ability of chromosome aberration technique to predict side effects and its possible use as a bio­marker to modify tumor therapy in case of radiation sensitive patients.

XXXIV/ 251. Identification of gene expression patterns associated with epithelial-mesenchymal transition in lung cancer cellular model

Martišová A.1, Sommerová L.2, Selingerová I.1, Krejčí A.1, Kolářová T.1, Zavadil Kokáš F.1, Hrstka R.1

1 MOÚ Brno, 2 RECAMO, MOÚ Brno

One of the key processes in tumour progression and metastasis development is the epithelial mesenchymal transition (EMT), where TGF-b signalling plays an important role resulting in an enhanced transcription of EMT drivers. Recently, AGR2 protein emerged as a crucial component of the cellular machinery responsible for maintaining epithelial phenotype, hence interfering with the TGF-b pathway. We performed transcriptomic profiling of A549 lung cancer cell line with CRISPR-Cas9 mediated AGR2 knockout together with and without TGF-b treatment. The obtained results were subjected to PANTHER and DAVID analysis. Significant changes were identified in transcripts associated predominantly with focal adhesion and arachidonic acid metabolism. To support and independently validate our RNAseq data, RT-qPCR was performed to analyze the expression changes on six representative genes linked with focal adhesion pathway (COL4A1, COL4A2, FLNA, VAV3, VEGFA and VINC) and on three genes involved in arachidonic acid metabolism (GPX2, PTGS2, PLA2G4A). Moreover, immunofluorescent staining showed induced formation of stress fibers containing vinculin foci in cells without AGR2 and in response to TGF-b treatment. Transcripts associated with arachidonic acid metabolism showed decreased levels after both AGR2 gene knockout and exposure to TGF-b. Since prostaglandin E2 (PGE2) is a product of arachidonic metabolism, its lowered concentration in media after AGR2 gene knockout and TGF-b treatment was confirmed by ELISA. In contrast, the addition of exogenous PGE2 significantly elevated AGR2 protein level in lung A549 and colorectal HT29 cancer cell lines. Together, our extensive dataset provides a complex insight into the transcriptome of A549 cell line after manipulation of AGR2 expression and/ or TGF-b treatment. Furthermore, the results imply that AGR2 downregulation and TGF-b have an essential role in focal adhesion formation; moreover, we have newly identified AGR2 as an important component of the arachidonic acid metabolic pathway, possibly filling a gap in understanding the way in which AGR2 is applied in inflammatory processes.

This work was supported by the European Structural and Investment Funds – Project „Mobility in MMCI“ (No. CZ.02.2.69/ 0.0/ 0.0/ 18_053/ 0017836), National Institute for Cancer Research (Programme EXCELES, ID Project No. LX22NPO5102) funded by the European Union – Next Generation EU, and by the Ministry of Health, Czech Republic – conceptual development of research organization (MMCI, 00209805).

XXXIV/ 252. Mass spectrometry analysis of extracellular vesicles from malignant ascites highlights the role of tumor microenvironment in progression of ovarian cancer

Hlaváčková Pospíchalová V.1, Vyhlídalová Kotrbová A.1, Gömöryová K.1, Potěšil D.2, Bednaříková M.3, Hausnerová J.4,  Minář L.5, Weinberger V.5, Crha I.5, Bryja V.1

1 Ústav experimentální bio­logie, PřF MU Brno, 2 Oddělení proteomiky, CEITEC, MU Brno, 3 Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno, 4 Ústav patologie LF MU a FN Brno, 5 Gynekologicko-porodnická klinika LF MU a FN Brno

Ovarian cancer (OC) ranks among the deadliest cancers in women. Lack of clear symptoms, rapid spread of metastases and common chemoresistance all contribute to unfortunate fate of majority of ovarian cancer patients, especially those having the high-grade serous carcinoma of the ovary, fallopian tube and peritoneum (HGSC), the most common type of OC. Many of HGSC patients have excess fluid in the peritoneum at the stage of dia­gnosis called ascites. Ascites is basically a tumor microenvironment in the liquid form containing various cells, proteins and other molecules and also extracellular vesicles (EVs). EVs are small membrane-bound particles that convey proteins, lipids and nucleic acids between cells and their cargo reflects the cell of the origin. EVs play important role in cancerogenesis and hold a great promise as disease bio­markers as well as potential therapeutic targets. Small size and polydispersity of EVs brings various challenges to their isolation, including method-dependent contaminants. We isolated EVs from ascites by two different methods and analyzed them by advanced mass spectrometry; only proteins identified in both preparations for each patient were further considered. We identified “true ascitic EV proteome” consisting of 2,418 proteins, which contains typical EV markers, is devoid of proteins routinely contaminating EV isolates, and covers interpatient heterogeneity. Next, we compared this proteome with EVs from related control fluids and found 74 proteins present only on EVs from HGSC patients. We believe that this list of proteins contain both important players of HGSC progression as well as potential bio­markers. Then, using scRNA sequencing data, we mapped the origin of EVs to different types of cells present in malignant ascites. Our results suggest that EVs in ascites do not come predominantly from tumor cells as was expected, but rather from a variety of non-malignant cell types including cancer-associated fibroblasts and tumor-associated macrophages. This emphasizes the recently appreciated role of tumor microenvironment in the progression of HGSC and lays foundations for further experiments.

This work was supported by Czech health research council, project number: NU21-03-00306. CIISB, Instruct-CZ Centre of Instruct-ERIC EU consortium, funded by MEYS CR infrastructure project LM2018127, is gratefully acknowledged for the financial support of the measurements at the CEITEC Proteomics Core Facility.

XXXIV/ 368. Sekvenování dlouhých nekódujících RNA v exozomech u pacientů s kolorektálním karcinomem

Madrzyk M.1, Macháčková T.1, Trachtová K.1, Catela Ivković T.1, Součková K.1, Kotouček J.2, Mašek J.2, Loja T.1, Šachlová M.3, Slabý O.1

1 CEITEC, MU Brno, 2 Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i., Brno, 3 Gastroenterologické oddělení, MOÚ Brno

Východiska: Prognóza pacientů s karcinomem kolorekta (CRC) závisí především na rozsahu onemocnění v době dia­gnózy, proto je brzký záchyt jedním z hlavních předpokladů úspěšné léčby. Současný výzkum ukazuje, že exozomální dlouhé nekódující RNA (lncRNA) jsou spojeny s rozvojem nádorových onemocnění. Jelikož jsou lncRNA často tkáňově specifické, jejich kvantifikace v exozomech se nabízí jako neinvazivní metoda pro včasnou detekci CRC. V naší práci jsme se zaměřili na optimalizaci protokolu pro analýzu exozomálních lncRNA z krevního séra pacientů s CRC jako potenciálních dia­gnostických bio­markerů. Materiál a metody: Exozomy byly izolovány pomocí gelové chromatografie ze 150 μl séra pacientů s CRC a zdravých dárců. Jejich kvalita a kvantita byla potvrzena elektronovou mikroskopií a DLS analýzou a proteinové markery byly detekovány metodou Western blot. Po izolaci RNA byly ze vzorků připraveny cDNA knihovny, které byly sekvenovány pomocí NextSeq 550. Výsledky: Úspěšně jsme izolovali exozomy a ověřili jsme jejich vlastnosti několika různými metodami. Knihovny byly připraveny ze všech vzorků i přes velmi nízký objem výchozího materiálu. Sekvenační data potvrzují přítomnost protein kódující (50 %) i nekódující RNA, kterou tvoří především lncRNA (28,2 %), pseudogeny (15,2 %) a další typy RNA (6,5 %). Výsledky dále ukázaly významně změněné hladiny ně­kte­rých lncRNA, na základě jejichž exprese bylo možné odlišit vzorky od pacientů s CRC od vzorků zdravých kontrol. Pomocí GSEA analýzy jsme pozorovali značně obohacené třídy genů, které souvisejí s opravami DNA nebo regulací buněčného cyklu. Závěr: Naše pilotní data naznačují, že lncRNA představují významnou část RNA přítomné v exozomech a jejich rozdílné hladiny mají schopnost odlišit CRC pacienty od zdravých kontrol. Analýza obohacených genů zároveň prokázala významné zastoupení lncRNA podílejících se na regulaci buněčného cyklu a oprav DNA, což naznačuje jejich možné zapojení do procesů kancerogeneze. Výsledky je však třeba ověřit na větším souboru pacientů.

Tato práce byla podpořena projekty GA20-18889S, MZE-RO0518, BBMRI-CZ LM2018125 a CZ.02.1.01/ 0.0/ 0.0/ 15_003/ 0000495.

XXXIV/ 374. Charakterizace monoklonálních protilátek proti proteinu MDMX

Kučeríková M., Haroníková L., Vojtěšek B., Bonzcek O.

RECAMO, MOÚ Brno

Onkogenní protein MDMX známý také jako MDM4 je jedním z kritických regulátorů nádorového supresoru p53. Společně s proteinem MDM2, se kterým sdílí strukturní homologii, inhibují aktivitu p53, čímž přispívají k udržování homeostázy a regulaci buněčného cyklu. Amplifikace genu MDM4 byla pozorována u různých typů nádorů, např. u melanomu, prsního karcinomu nebo gliomu, a jeho zvýšená produkce přispívá k nádorové progresi [1]. Dosud bylo na buněčné úrovni popsáno sedm různých izoforem proteinu MDMX. Metodami in silico byly predikovány další varianty a ně­kte­ré z nich byly ověřeny i na experimentální úrovni [2]. Avšak pro komplexnější pochopení významu a funkce těchto zkrácených forem, nejen v procesech nádorového bujení, je nezbytný další výzkum. Zaměřili jsme se na charakterizaci různých monoklonálních protilátek proti proteinu MDMX. Pomocí rekombinantních proteinových konstruktů různé délky jsme charakterizovali vazební místo protilátek. Následně jsme tyto protilátky využili k detekci proteinu v rozličných typech nádorových linií a zkoumali jsme také vliv protinádorových léčiv na změny hladiny a forem proteinu MDMX. S využitím phage display přesně určíme místo vazby monoklonálních protilátek. Důkladná charakterizace protilátek a jejich využití v analýze umožní přesnější pochopení funkce MDMX a jeho různých forem.

Podpořeno projekty GAČR 19-18177Y, Evropským fondem pro regionální rozvoj – projekt ENOCH (reg. č. CZ.02.1.01/ 0.0/ 0.0/ 16_019/ 0000868) a MZ ČR - RVO (MOÚ, 00209805).

Literatura: [1] Yu DH, Xu ZY, Mo S et al. Targeting MDMX for Cancer Therapy: Rationale, Strategies, and Challenges. Front Oncol 2020; 10: 1389. doi: 10.3389/ fonc.2020.01389. [2] Mancini F, Di Conza G, Moretti F. MDM4 (MDMX) and its transcript variants. Curr Genomics 2009; 10(1): 42–50. doi: 10.2174/ 138920209787581280.

XXXIV/ 376. Vytvorenie 3D bunkového modelu in vitro pre štúdium obrovskobunkového  nádoru kosti

Chomová A.1, Mahdal M.2, Neradil J.1

1 Laboratoř nádorové bio­logie, Ústav experimentální bio­logie, PřF MU Brno, 2 1. ortopedická klinika LF MU a FN u sv. Anny Brno

Obrovskobunkový nádor kosti (giant cell tumor of bone – GCTB) je benígny kostný nádor postihujúci najmä meta-epifázy dlhých kostí u dospelých nad 25 rokov. U 10–25 % pacientov nastáva relaps nádoru na rovnakom mieste, pričom v prípade 1–5 % nastáva aj metastázovanie do pľúc. Úmrtnosť v dôsledku GCTB dosahuje približne 4 %. V rámci nádoru je možné detekovať dva základné bunečné typy podieľajúce sa na tvorbe nádorovej masy: obrovské viacjadrové bunky typu osteoklastov a neoplastické stromálne mononukleárne bunky. Neoplastické bunky exprimujú RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand), ktorým komunikujú s osteoklastovými prekurzormi exprimujúcimi RANK (receptor activator of nuclear factor kappa-B) a stimulujú ich diferenciáciu na osteoklasty. Liečba zahŕňajúca aplikáciu monoklonálnej protilátky proti RANKL (denosumab) vedie k vymiznutiu osteoklastov, neoplastické bunky však v nádorovom ložisku pretrvávajú. Vhodným nástrojom pre štúdium vzájomnej komunikácie medzi bunkami a odhalenie potencionálnych cieľov liečby sa javí príprava funkčného modelu GCTB in vitro. Pre vytvorenie modelu boli využité komerčne dostupné bunky monocytárnej línie THP-1. Bunky boli diferenciované pomocou PMA (phorbol-12-myristate-13-acetate) po dobu 6 dní, pri čom bola dosiahnutá diferenciácia buniek do štádia makrofágov. Následne diferenciácia pokračovala po dobu 8 dní s aplikáciou M-CSF (macrophage colony-stimulating factor) a RANKL. U takto získaných osteklastov bola overená identita pomocou qRT-PCR a prietokovej cytometrie, kde bola pozorovaná expresia markerov RANK, TRAP, CD11b, CD14 a CD33. Osteoklasty boli následne ko-kultivované v neadherentných podmienkach so stromálnymi bunkami derivovanými z nádorového tkaniva za účelom vytvorenia agregátov. Úspešnosť pripraveného modelu GCTB in vitro bola overená detekciou expresie špecifických markerov potvrdzujúcich prítomnosť oboch typov buniek.

Štúdia bola podporená projektmi MZČR NU-22-10-00054 a MUNI/ C/ 0059/ 2022.