XXXIII. Základní, aplikovaný a klinický výzkum v onkologii

XXXIII/ 51. MikroRNA jako potenciální prognostické a prediktivní bio­markery u pacientů s atypickým meningeomem

Al Tukmachi D.1, Naar O.1, Fadrus P.2, Vybíhal V.2, Slabý O.1,3,4 Šána J.1,3,4

1 CEITEC, MU Brno, 2 Neurochirurgická klinika LF MU a FN Brno, 3 Ústav patologie, FN Brno, 4 Klinika komplexní onkologické péče LF MU a MOÚ Brno

Východiska: Meningeomy jsou nejčastější primární intrakraniální nádory a jsou rozděleny do tří patologických stupňů. Přestože se většina těchto nádorů vyznačuje mírným průběhem a má relativně příznivou prognózu, meningeomy klasifikované Světovou zdravotnickou organizací jako stupeň 2 (atypické) a stupeň 3 (anaplastické) vykazují znaky invazivity a jsou často spojeny s vyšší pravděpodobností relapsu. Management agresivnějších tumorů vyššího stupně zůstává i nadále výzvou. Atypické meningeomy (AM) recidivují až u 40 % pacientů do 5 let od chirurgického zákroku, a to i přes totální resekci. Adjuvantní radioterapie (ART) je standardní léčbou anaplastických meningeomů, u AM však v současné době konsenzus neexistuje a je obtížné identifikovat radiorezistentní pacienty v klinické praxi. Je proto nutné najít prognostické a prediktivní bio­markery, které by byly schopny pacienty odlišit. Velmi slibnou skupinu bio­markerů představují mikroRNA (miRNA). Tyto krátké nekódující RNA regulují většinu bio­logických procesů vč. buněčné proliferace, diferenciace a apoptózy. Předchozí výzkum popsal významnou dysregulaci miRNA v nádorových tkáních meningeomů a také prokázal jejich zapojení do nádorové radiorezistence. Cílem studie je identifikovat tkáňové miRNA schopné predikovat pacienty s AM, kteří by mohli mít prospěch z ART. Dále předpokládáme, že existují miRNA se schopností předpovídat riziko recidivy nezávisle na stupni meningeomu a stupni resekce dle Simpsona. Materiál a metody: Studie zahrnuje 80 pacientů s meningeomem v explorativní fázi a 400 pacientů ve validační fázi. Globální profil exprese miRNA byl vytvořen pomocí TaqMan Array Human MicroRNA Cards. Výsledky a závěr: Studie identifikovala významně dysregulované miRNA u pacientů s AM, u kterých nastal a nenastal relaps (p < 0,01). Byl také detekován dysregulovaný expresní profil miRNA u pacientů s AM s indikovanou ART, u kterých došlo a nedošlo k rekurenci (p < 0,01). Výsledky mohou pomoci přesněji předpovědět prognózu chirurgicky intervenovaných pacientů a určit, kteří pacienti mohou těžit z ART.

Tento výzkum je podpořen grantem AZV Ministerstva zdravotnictví ČR (reg. č. NV19-03-00559).

XXXIII/ 291. Právní aspekty ekonomicko-sociálních podmínek chronicky nemocných pacientů

Tobiášová A.

Advokátní kancelář Brno

Rovnost všech lidských bytostí jako subjektů základních práv a svobod je obsahem v zásadě všech dokumentů chránících lidská práva. Jde mimo jiné i o praktické poznání a uznání hodnoty každého člověka jako takového, bez ohledu na jeho schopnosti, znalosti a „užitečnost“ či prospěšnost pro celek. Diskriminací se obecně rozumí odlišné zacházení ve srovnatelných situacích bez rozumného odůvodnění. Nestačí se však diskriminovaným pouze cítit – za diskriminaci se považuje pouze jednání popsané a zakázané zákonem. Zákaz diskriminace je v českém právním řádu upraven především v antidiskriminačním zákoně. Mnoho lidí po úspěšné léčbě nejen onkologických chorob vnímá nerovnost přístupu v ekonomické a sociální oblasti. Zvláště bankovní instituce a pojišťovny považují pacienty v remisi nadále za klienty s vysokým pojistným rizikem. Mnohdy tak nejsou naplňovány jejich životní potřeby a svou situaci mohou někdy oprávněně vnímat jako diskriminační. Dokončit vzdělání, uspět v zaměstnání, pořídit si bydlení, či zabezpečit rodinu je výzvou pro každého. Lidé, kteří trpí ně­kte­rým z vážných chronických onemocnění, se vedle obtíží způsobených nemocí mohou navíc potýkat s diskriminací či skrytými překážkami. V únoru 2022 došlo ke schválení usnesení Evropského parlamentu o komplexním přístupu EU v boji proti rakovině. Podle něj by pacienti v EU měli mít po ukončení léčby právo na to, aby se na jejich nemoc „zapomnělo“ a nebylo tedy možné k prodělané rakovině přihlížet např. při rozhodování o pojištění nebo úvěrech. Nejpozději 10 let po prodělání nádorového onemocnění by proto měl být příslušný záznam odstraněn ze zdravotní dokumentace, a pokud byl nádor dia­gnostikován před dosažením věku 18 let, pak po 5 letech. Problematiku již ně­kte­ré země EU legislativně vyřešily a další se jí intenzivně zabývají. Pilotní průzkum pořádaný Lékařskou fakultou Masarykovy univerzity a 1. lékařskou fakultou Univerzity Karlovy si klade za cíl odhalit problémy, kterým pacienti čelí v přístupu k veřejným i soukromým službám. Průběžné výsledky byly prezentovány na odborném fóru Právo na stejné podmínky pořádaném Masarykovým onkologickým ústavem spolu s uvedenými lékařskými fakultami v červnu tohoto roku a následně využity pro další výzkumné aktivity v oblasti práv pacientů. Cílem našeho sdělení je upozornit na ekonomicko-sociální problémy, kterým chroničtí pacienti či pacienti se zdravotním postižením čelí v přístupu k veřejným i soukromým službám a nastínit možná východiska v kontextu právního řádu ČR i EU.

XXXIII/ 351. Sekvenování mikroRNA v mozkových metastázách  jako nový dia­gnostický nástroj

Večeřa M.1, Radová L.1, Siegl F.1, Smrčka M.2, Jančálek R.3, Hermanová M.4, Hendrych M.4, Křen L.5, Šána J.1,6, Slabý O.1,7

1 CEITEC, MU Brno, 2 Neurochirurgická klinika LF MU a FN Brno, 3 Neurochirurgická klinika LF MU a FN u sv. Anny Brno, 4 I. ústav patologie LF MU a FN u sv. Anny Brno, 5 Ústav patologie, LF MU a FN Brno, 6 Klinika komplexní onkologické péče LF MU a MOÚ Brno, 7 Biologický ústav, MU Brno

Východiska: Mozkové metastázy (BM) jsou nejčastější intrakraniální nádory u dospělých onkologických pacientů. Zatímco dříve byly BM léčeny pouze symptomaticky, přístup k terapii se mění v důsledku zvyšující se incidence vyplývající z efektivnější léčby primárních nádorů a časnějšího záchytu malých asymptomatických BM. Protože prognóza pacientů s BM je vysoce variabilní, bylo by užitečné zlepšit dia­gnostické a prognostické nástroje začleněním nových výkonných bio­markerů. MikroRNA (miRNA) jsou v tomto ohledu slibné a díky jejich vysoké stabilitě vhodné jak pro sekvenování (RNA-Seq), tak pro retrospektivní analýzy v tkáních fixovaných formalinem a zalitých v parafinu (FFPE). Materiál a metody: Celková RNA obohacená o miRNA byla izolována ze 71 čerstvě zmrazených, histopatologicky potvrzených tkání BM s původem v pěti typech nádorů (karcinom plic 37 %, melanom 23 %, karcinom prsu18 %, renální karcinom 15 %, kolorektální karcinom 7 %). Před léčbou byl od každého pacienta získán informovaný souhlas schválený místní etickou komisí. Z RNA byly připraveny knihovny pro sekvenování na platformě NextSeq 500 (Illumina). Mapování čtení na referenci bylo provedeno pomocí miraligner a miRBase a diferenciální analýza pro 2 437 maturovaných miRNA byla provedena pomocí limma. Molekuly miRNA ze vzorků celkové RNA izolovaných z retrospektivního souboru 119 FFPE tkání byly reverzně transkribovány a exprese vybraných diferenciálně exprimovaných miRNA (miR-122-5p, miR-141-3p, miR-146a-5p, miR-194-5p, miR-200c-3p, miR-211-3p, miR-215-5p, miR-514b-3p, miR-934, miR-1270) byla validována pomocí qPCR. Výsledky: Diferenciální analýzou bylo identifikováno 373 miRNA s významně odlišnou expresí mezi pěti skupinami BM (p < 0,001). Následnou pilotní validací byla ověřena významně odlišná exprese vybraných miRNA v pěti skupinách BM. Závěr: Prezentované výsledky potvrzují důležitost studia dysregulované exprese miRNA v BM a dia­gnostický potenciál validovaných miRNA.

Studie byla zpracována s grantovou podporou Ministerstva zdravotnictví ČR – grant č. NV18-03-00398.

XXXIII/ 365. Využití tkáňových mikroRNA k odlišení indolentního a agresivního karcinomu prostaty

Juráček J.1, Madrzyk M.1, Trachtová K.1, Ručková M.1, Staník M.2, Slabý O.1

1 CEITEC, MU Brno, 2 Oddělení urologické onkologie, MOÚ Brno

Východiska: Karcinom prostaty (KP) představuje z bio­logického hlediska heterogenní onemocnění, které se může vyskytovat ve formě jak pomalu rostoucích indolentních karcinomů nepředstavujících ohrožení života, tak agresivních karcinomů s vysokou mírou progrese a metastatickým potenciálem. Přestože globální screening prostatického specifického antigenu (PSA) zvýšil záchyt onemocnění, a tím pomohl snížit mortalitu, tento marker není zejména při nižších hladinách dostatečně specifický. To vede buď k opožděné dia­gnostice klinicky relevantních tumorů, nebo naopak k detekci indolentních KP, u kterých dochází ke zbytečným dia­gnostickým a terapeutickým výkonům způsobujícím pacientům psychickou i fyzickou újmu. Vhodný molekulární bio­marker schopný odlišit jednotlivé formy KP by tak mohl identifikovat pacienty, kteří by více těžili z aktivního sledování namísto systémové terapie. V této studii jsme se zaměřili na mikroRNA (miRNA), skupinu krátkých nekódujících RNA, které hrají důležitou roli v patofyziologii KP, kde byly asociovány s časnou detekcí i prognózou onemocnění. Materiál a metody: Za použití miRCURY LNA miRNA miRNome PCR panelů (Qiagen) jsme analyzovali expresi 752 miRNA v FFPE tkáni 20 pacientů s indolentním (ISUP grade 1) a 20 pacientů s agresivním (ISUP grade 3–5) karcinomem prostaty. Schopnost vybraných miRNA odlišit jednotlivé formy karcinomu prostaty byla ověřena na nezávislé validační kohortě 140 pacientů pomocí specifických miRNA primerů (ThermoFisher) a metody RT-qPCR. Výsledky: Statistická analýza v rámci explorativní fáze studie odhalila 149 miRNA významně dysregulovaných u agresivního KP ve srovnání s indolentním (p ≤ 0,01). Na základě sledovaných parametrů byla do následné validace vybrána miR 103a 3p, u které byla potvrzena významně zvýšená hladina exprese u agresivních KP (ISUP 3–5) jak ve srovnání s indolentními (ISUP 1; p = 0,0001), tak s karcinomy středně pokročilými (ISUP 2; 0,03). Vyšší hladina miR-103a-3p byla také asociována s významně nižším přežitím bez bio­chemické progrese (p = 0,03). Hladina exprese miR-103a-3p byla poté kombinována s hladinou sérového PSA, přičemž vzniklé prognostické skóre vykazovalo při odlišení pacientů s indolentním a agresivním KP významně lepší statistické parametry (p < 0,0001, FC = 1,75, AUC = 0,8282) než jednotlivé markery. Závěr: Úspěšně jsme identifikovali a validovali miRNA rozdílně exprimované mezi indolentními a agresivními KP. Naše pilotní studie naznačuje, že miRNA mohou být asociovány s agresivitou tohoto onemocnění a při kombinaci s vhodnými markery by mohly napomoci k výběru terapeutického přístupu.

Studie byla vypracována s grantovou podporou Ministerstva zdravotnictví České republiky, grant č. NV18-03-00360. Všechna práva vyhrazena.

XXXIII/ 367. Profil exprese exozomálních mikroRNA v periferní krvi pacientů s extramedulárním onemocněním

Vlachová M.1, Gregorová J.1, Dostálová A.1, Radová L.2, Jarkovský J.3, Říhová L.4, Almáši M.4, Štork M.5, Pour L.5, Ševčíková S.1

1 Babákova myelomová skupina, Ústav patologické fyziologie, LF MU Brno, 2 CEITEC, MU Brno, 3 Institut bio­statistiky a analýz, LF MU Brno, 4 Oddělení klinické hematologie, FN Brno, 5 Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno

Mnohočetný myelom (MM) je hematoonkologické onemocnění, při němž dochází k infiltraci kostní dřeně plazmatickými buňkami. V případě, že buňky infiltrují také orgány či měkké tkáně, je stav označován jako extramedulární onemocnění (EMD). MikroRNA (miRNA) jsou krátké jednořetězcové nekódující RNA, které regulací genové exprese prokazatelně ovlivňují spektrum fyziologických i patologických procesů; v kontextu nádorových onemocnění se podílejí např. na rozvoji relapsu či rezistence. Jsou přítomny ve tkáních i v tělních tekutinách (mateřské mléko, moč aj.), také jako součást exozomů, tedy extracelulárních vezikulů o velikosti 30–100 nm. Předchozí výsledky nejen naší výzkumné skupiny naznačují, že miRNA by v budoucnu mohly být využity jako minimálně invazivní bio­markery u těchto dvou onemocnění, která stále zůstávají obtížně léčitelná. Je však nezbytné podpořit praktické využití miRNA dalším výzkumem. Cílem práce bylo zjistit, jaký je rozdíl v expresi miRNA ve vzorcích séra periferní krve získaného od pacientů s MM a EMD, a k analýze využít sekvenování nové generace (8 MM, 8 EMD) a RT-qPCR (69 MM, 39 EMD). Ze séra periferní krve pacientů jsme izolovali nejdříve exozomy (qEVoriginal, Izon Science) a poté celkovou RNA obohacenou o krátké RNA vč. miRNA (miRNeasy Serum/ Plasma Kit, Qiagen). Následně jsme z části takto zpracovaných vzorků připravili knihovny, které byly osekvenovány (NGS na platformě Illumina; CleanTag Small RNA Library Preparation Kit + NextSeq 500/ 550 v2 Kit). Kandidátní miRNA jsme validovali na větší, nezávislé kohortě metodou RT-qPCR (TaqMan Advanced miRNA Assays, Applied Biosystems). S využitím sekvenování byly identifikovány odlišně exprimované miRNA a z nich byly následně miRNA s nejvyšším rozdílem v expresi zvoleny k validaci, kromě toho byla také hodnocena korelace mezi relativní expresí a dostupnými klinickými parametry.

Výzkum byl podpořen grantem NU21-03-00076.

XXXIII/ 375. Detekcia onkomarkerov pomocou aptamérov a mikroskopických techník

Poturnayová A.1, Domšicová M.1, Macková K.1, Buríková M.2, Bábelová A.2, Ebner A.3

1 Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky, Centrum Biovied SAV Bratislava, Slovenská republika, 2 Ústav experimentálnej onkológie, Biomedicínske centrum SAV, Bratislava, Slovenská republika, 3 Institute of Biophysics, Johannes Kepler University, Linz, Austria

Mikroskopy boli vždy jedným zo základných nástrojov pre výskum v oblasti bio­medicíny. Svetelné či elektrónové mikroskopy sa stali bežnou súčasťou laboratória a veľkou mierou prispievajú k vedeckým poznatkom. V posledných rokoch digitálne prístroje stále zvyšujú svoju výkonnosť a umožňujú rozširovanie hraníc vedeckého bádania. Avšak, nástup skenovacej sondovej mikroskopie a to najmä mikroskopu atomárnych síl (AFM) otvára novú perspektívu pri vyšetrovaní rôznych typov vzoriek. Vďaka najnovším výskumom onkologických ochorení a pokrokom v oblasti bio­technológie je jednou z možností aj použitie aptamérov, ktoré boli vytvorené pre špecifické rozpoznávanie bio­markerov na povrchu buniek. Aptaméry sú jednovláknové DNA alebo RNA oligonukleotidy či peptidy, ktoré sa špecificky a s vysokou afinitou viažu na cieľové molekuly alebo bunky. Aptaméry v roztoku vytvárajú jedinečné sekundárne a terciálne štruktúry, ktoré obsahujú väzobné miesto pre vybrané molekuly, ako napr. onkomarkery. V predkladanej práci sme sa zaoberali sledovaním interakcií DNA aptamérov (HB5) s HER2 proteínmi, ktoré sú exprimované na bunkových líniách karcinómu prsníka. Použitím jednomolekulovej silovej spektroskopie (SMFS) sme sledovali špecifické a nešpecifické interakcie v reálnom čase, čo umožnilo určiť niektoré kinetické parametre väzby medzi HB5 aptamérom a HER2 receptormi. Vizualizáciu interakcií pomocou fluorescenčne značených aptamérov sme potvrdili konfokálnou mikroskopiou. Pochopením mechanizmu interakcií DNA aptamérov s receptormi na molekulovej úrovni je možné získať dôležité poznatky v záujme vývoja dia­gnostickej sondy pre včasnú detekciu karcinómu prsníka.

Práca bola podporená grantovou agentúrou VEGA (2/ 0160/ 21).

XXXIII/ 377. Alterations in N-glycans in sera of patients with lung cancer

Ježková P.1, Skřičková J.2, Wimmer G.3, Zdráhal Z.1, Lattová E.1

1 CEITEC, MU Brno, Czech Republic, 2 Department of Respiratory Diseases and TB, University Hospital Brno, Czech Republic, 3 Institute of Measurement Science, Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovak Republic

Lung cancer is one of the most serious types of malignancy with the highest mortality rate of all carcinomas. Late dia­gnosis is one of the major causes of poor survival rates. The availability of a more reliable marker(s) for early detection of cancer can increase chances of survival considerably. Glycosylation is one of the most common modes of protein posttranslational modifications and changes in glycans are well recognized to associate with carcinogenesis. In our study we profiled N-glycans in sera of patients with lung cancer (128 men and 50 women) and compared with sera from healthy donors (19 men and 24 women). Serum samples of patients during or after treatment were also involved for this study. N-glycans enzymatically released from sera were first modified to stabilize sialylated glycans through alkyl esterification and all glycans following one step labeling with phenylhydrazine were analyzed by means of mass spectrometry (MALDI, UltrafleXtreme^TM, Bruker) [1,2]. Detected glycan peaks were evaluated performing a one-way analysis-of-variance and investigated from a mathematical/ statistical point of view. Sex, age, and smoking status (smoker, non-smoker) were assigned to each subject. More than 100 glycan peaks were evaluated. As expected, the replicates did not influence the final measured data. The comparison of data between healthy donors and patients with cancer without any other explanatory variables indicated significant difference for 70 glycans. The most significant changes between samples were observed, for example, in increased levels of tri and tetra antennary sialylated glycans with arm fucose/ s in cancerous sera. Other changes pointed to differences detected for sialylated triantennary glycans which displayed branching on the 3-arm and presence of 2,3-linked Neu5Ac unit on one of its antennae. Our results indicate that some of detected serum glycans can be used as potential markers for rapid recognition of malignant disease.

Literature: [1] Lattová E, Skřičková J, Hausnerová J et al. N-Glycan profiling of lung adenocarcinoma in patients at different stages of disease. Modern Pathology 2020; 33(6): 1146–1156. doi: 10.1038/ s41379-019-0441-3. [2] Jezkova P, Skřičková J, Wimmer G et al. Differentiation of sialyl linkages using a combination of alkyl esterification and phenylhydrazine derivatization: Application for N-glycan profiling in sera of patients with lung cancer. Anal Chem 2022; 94(18): 6736–6744. doi: 10.1021/ acs.analchem.2c00105.