XXIX. Základní a aplikovaný výzkum v onkologii

XXIX/ 187. Cirkulující myeloidní supresorové buňky a jejich úloha v nádorové imunologii

Pilátová K.^1,2, Budinská E.¹, Bencsiková B.^1,3, Nenutil R.^1,4, Šefr R.^1,5, Fědorová L.^1,2, Hanáková B.¹, Brychtová V.¹, Zdražilová Dubská L.^1,2

¹ RECAMO, MOÚ, Brno, ² Oddělení laboratorní medicíny, MOÚ, Brno, ³ Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ, Brno, ⁴ Oddělení onkologické patologie, MOÚ, Brno, ⁵ Klinika operační onkologie, MOÚ, Brno

Východiska: Myeloidní supresorové buňky (MDSC) jsou heterogenní populací multipotentních progenitorových buněk myeloidního původu. Vzhledem k jejich imunosupresivnímu účinku se podílejí na úniku nádoru imunitnímu dohledu. K nádorovému růstu přispívají i dalšími mechanizmy, jako jsou podpora nádorové angiogeneze a metastazování. Membránové markery lidských MDSC jsou znaky myeloidních buněk CD11b a CD33, dále jsou HLA-Dr^low/ –  a dle exprese znaků CD15 nebo CD14 je lze rozlišit na skupinu granulocytárních (Gr-MDSC) a monocytárních (Mo-MDSC) MDSC. Soubor pacientů a metody: Zastoupení Mo-MDSC v periferní krvi jsme stanovili u kontrolní populace (bez nádorového onemocnění) (n = 61), u pacientů se zhoubným novotvarem prsu (n = 39) a kolorektálním karcinomem (n = 52). Mo-MDSC byly detekovány na průtokovém cytometru jako buňky s imunofenotypem CD45⁺CD11b⁺CD33⁺HLA-Dr^low/ –CD14⁺. Výsledky: Průměrný počet cirkulujících Mo-MDSC v kontrolní populaci byl 1,09 % z celkových leukocytů, tj. 0,073 × 10⁹/ l a nezávisel na věku a pohlaví. U pacientek s karcinomem prsu byl průměrný počet Mo-MDSC vyšší než u kontrolní populace: 3,57 % a 0,229 × 10⁹/ l (p < 0,001) a po podání růstových faktorů granulopoézy byl pozorován jejich významný nárůst (p = 0,043). Pacienti s kolorektálním karcinomem měli vyšší průměrný počet cirkulujících Mo-MDSC ve srovnání s kontrolní populací v době stanovení diagnózy: 1,71 % a 0,125 × 10⁹/ l (p = 0,003) a jejich počet nekoreloval s klinicko- patologickým stadiem, lokalizací (kolon vs. rektum), umístěním (levostranné vs. pravostranné) a mikrosatelitovou nestabilitou nádoru. Závěr: Zvýšený počet MDSC v cirkulaci a nádorovém mikroprostředí je asociován s imunosupresí a progresí nádorového onemocnění. U pacientů s kolorektálním karcinomem jsme detekovali zvýšený počet Mo-MDSC v periferní krvi v době diagnózy, což může být odrazem imunosupresivního mikroprostředí nádoru, a dále je nutné vyhodnotit jejich počet v kontextu s vývojem onemocnění. Rekombinantní růstové faktory granulopoézy zvyšují počet MDSC v cirkulaci a vliv tohoto aspektu na prognózu nádorového onemocnění je potřeba dále objasnit.

XXIX/ 190. Vliv diabetického mikroprostředí na vznik a rozvoj nádorů

Pácal L.¹, Chalásová K.¹, Müller P.², Hrstka R.², Kaňková K.¹

¹ Masarykova univerzita, Brno, ² RECAMO, MOÚ, Brno

Východiska: Epidemiologické studie prokázaly, že diabetes mellitus 2. typu je spojený s vyšším rizikem vzniku kolorektálního karcinomu (CRC). Průběh onemocnění ovlivňuje antidiabetikum první volby metformin, který zlepšuje prognózu diabetiků s CRC a zvyšuje účinnost standardní chemoterapeutické léčby. Molekulární mechanizmy protinádorového účinku metforminu nejsou zatím plně objasněny. Jednou ze známých drah je aktivace enzymu AMP-aktivované proteinové kinázy (AMPK). Vzhledem k pleiotropním efektům AMPK zahrnujícím zástavu buněčného cyklu, indukci autofagie a event. apoptózy, ale rovněž aktivaci „survival“ metabolických drah, můžeme předpokládat, že výsledný efekt závisí mimo jiné i na funkčnosti p53 jako klíčového bodu většiny z těchto adaptací. Jakým způsobem ovlivňuje tuto dráhu hyperglykemie, není zatím známo. Cílem práce bylo studovat efekt diabetického mikroprostředí, antidiabetika metforminu a cytostatika 5-fluorouracilu na AMPK signalizaci v in vitro modelu CRC s definovaným statusem p53. Materiál a metody: Nádorová buněčná linie HCT116 s a bez přítomnosti p53 (p53+/ + a p53– / – ) byla kultivována 30 hod za podmínek simulujících normo- (glukóza v médiu v koncentraci 7,5 mmol/ l) nebo hyperglykemií (25 mmol/ l glukóza) s přídavkem metforminu (500 µmol/ l) nebo 5-fluorouracilu (5 µmol/ l) a jejich kombinace. Viabilita buněk byla hodnocena pomocí resazurinu. Aktivaci AMPKα jsme sledovali pomocí Western blottingu s fosforylačně-specifickou protilátkou proti threoninu 172 (Cell Signaling Technology). Výsledky: Bez ohledu na v literatuře běžně používané milimolární koncentrace metforminu v in vitro experimentech, nejprve jsme stanovili IC50 pro metformin (a 5-fluorouracil), protože fyziologicky relevantní koncentrace metforminu se pohybují v desítkách µmol/ l. Koncentrace IC50 500 µmol/ l metforminu a 5 µmol/ l i 5-fluorouracilu byly následně použity ve všech experimentech u nádorové linie HCT116. Prokázali jsme, že metformin snižuje viabilitu buněk HCT116 p53– / –  významně více ve srovnání s +/ + už za normoglykemie. Dále jsme potvrdili aktivaci AMPKα metforminem, a to opět významnější u HCT116 p53– / –  buněk. Závěr: Potvrdili jsme výraznější efekt metforminu na viabilitu a aktivaci AMPKα u nádorových buněk bez funkční p53. Kombinace metabolického/ energetického stresu a expozice cytotoxickým látkám (5-fluorouracil jako typické chemoterapeutikum 1. linie léčby CRC) může představovat potenciálně efektivní přístup k léčbě p53 deficientních nádorů.

Práce byla podpořena grantem GA ČR č. GA16-14829S.

XXIX/ 335. MicroRNA expression pattern predicts time to progression in head and neck cancer patients

Ahmad P.¹, Šána J.^1,2, Slávik M.³, Šlampa P.³, Smilek P.⁴, Hermanová M.⁵, Slabý O.^1,2

¹ CEITEC –  Central European Institute of Technology, Masaryk University, Brno, ² Department of Comprehensive Cancer Care, Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno, ³ Department of Radiation Oncology, Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno, ⁴ Department of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery, St. Anne’s University Hospital in Brno, ⁵ Department of Pathological Anatomy, St. Anne’s University Hospital in Brno

Introduction: Head and neck cancers are the sixth most common cancers worldwide mainly represented by the squamous cell carcinoma (HNSCC). The most important part of post-surgical treatment of HNSCC is radiotherapy (RT). Unfortunately, many patients show poor response to this treatment because of common resistance of HNSCC to the RT. It would be highly beneficial to find some markers predicting a response of HNSCC patients to RT. In this respect, microRNAs (miRNAs) seem to be promising biomarkers. These molecules are short endogenous RNAs that modulate gene expression and their deregulated expression has been observed in many tumors including HNSCC. Specific expression patterns of miRNAs have also been shown to predict prognosis and therapeutic response in HNSCC. Main goal of our study was to analyze global expression of miRNAs in HNSCC samples and reveal set of miRNAs capable of predict a disease-free survival of HNSCC patients who underwent adjuvant RT. Materials and methods: We have analyzed global miRNA expression profiles in 47 FFPE HNSCC samples which were obtained from 25 early- and 22 later-progressed patients (median 5 months (min. = 1, max. = 19); 61 (51.99), resp.). This analysis has been performed using the hybridization technology GeneChip miRNA 4.0 array (Affymetrix). The validation analysis was carried out by RT qPCR technology using the miRNA-specific RT stem-loop primers according to the Taq-Man MicroRNA Assay protocol (Thermo Fisher Scientific). Results: Subsequent statistical analysis revealed 16 miRNAs (let-7c-5p, let-7d-5p, miR-15b-5p, miR-138-5p, miR-191-3p, miR-193a-3p, miR-301a-3p, miR-512-5p, miR-1183, miR-513c-3p, miR-1910-5p, miR-4431, miR-4527, miR-6754-5p, miR-6817-3p, and miR-7160-5p), based on which calculated Risk Score was able to stratify patients with early and later progression after RT (p < 5.21 × 10^– 13, logrank test; p < 2.229 × 10^– 8, HR = 2.7183; 95% CI (1.809– 4.084), Cox regression model). Selected miRNAs were subsequently validated on an independent retrospective set of 75 FFPE HNSCC samples and the results are currently statistically evaluated. Conclusion: Taken together, our data suggest that above miRNAs seem to be very promising molecules able to predict time to progression in HNSCC patients who underwent adjuvant RT.

This work was financially supported by the Czech Ministry of Health, Grant no. 15-31627A, Project MZ CR –  RVO (MOU, 00209805), and by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic under Project CEITEC 2020 (LQ1601).

XXIX/ 336. Evaluation of plasma microRNAs as diagnostic biomarker in pancreatic cancer

Gabło N.¹, Procházka V.², Macháčková T.¹, Vencovská E.¹, Vychytilová-Faltejsková P.¹, Kala Z.², Karásek P.³, Slabý O.^1,3

¹ CEITEC –  Central European Institute of Technology, Masaryk University, Brno, ² Department of Surgery, Institutions shared with the Faculty Hospital Brno, ³ Department of Comprehensive Cancer Care, Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno

Background: Czech Republic is ranked among those countries with the highest pancreatic cancer (PC) incidence in Europe and worldwide. PC is usually diagnosed at the time when the disease has already advanced and the prognosis of patients is poor. That is mainly due to the lack of effective diagnosis at an early stage of tumor development. Moreover, differential diagnosis remains challenging without invasive procedures, especially to differentiate pancreatic ductal adenocarcinoma from other tumors, benign lesions or chronic pancreatitis. No effective screening tool have been identified to date. The aim of our study wasanalysis of selected microRNAs expression in PC patients plasma and their diagnostic potential evaluation. Material and Methods: Using quantitative real time PCR were analysed 6 microRNAs (miR-17-5p, miR155-5p, miR-126-5p, miR-21-5p, miR-375, miR-1290) in blood plasma of 25 patients with pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), 8 pancreatic neuroendocrine tumors (PNET), 8 chronic pancreatitis (CHP), 10 bile duct carcinoma (BDC), 8 vater papilla cancer (VPC). Moreover 24 healthy subjects (HS) were enrolled to this study. To evaluate diagnostic potential we used Man-Whitney U-test and ROC analysis. Results: We found that all of these microRNAs were upregulated in comparison to healthy control. All microRNAs showed promising results toward distinguishing PDAC and VPC from HS with AUC ranging from 0.73 to 0.992 for PDAC vs. HS, and AUC from 0.755 to 0.995 for VPC vs. HS. Five other microRNAs, namely miR-17-5p, miR155-5p, miR-126-5p, miR-21-5p, miR-375 exhibited diagnostic value in comparison PNET with HS with AUC 0.797, 0.844, 0.859, 0.969, 0.906, resp. Whereas miR-17-5p, miR155-5p, miR-126-5p, miR-21-5p was shown to have AUC ranging from 0.833 to 0.995 when compare CHP with HS. miR-126-5p and miR-21-5p were upregulated in BDC when compared to healthy controls with AUC = 0.817 and AUC = 0.879. The ROC analyses also indicated that miR-21-5p may discern patients with BDC from CHP (AUC = 0.788) and VPC (AUC = 0.788). Moreover, we found that miR-375 reached an area under curve (AUC) value of 0.760 for NET versus PDAC patients and AUC = 0.813 NET vs. BDC patients. Conclusion: In conclusion, our results provide additional evidence supporting the use serum microRNAs as reliable diagnostic biomarker in pancreatic cancer management.

This work was supported by the Czech Ministry of Health grant number 16-31314A, and by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic under the project CEITEC 2020 (LQ1601).

XXIX/ 337. Analýza exprese lncRNA u multiformního glioblastomu pomocí sekvenování nové generace

Večeřa M.¹, Šána J.¹, Bútová R.¹, Reguli Š.², Hermanová M.³, Křen L.⁴, Lipina R.², Smrčka M.⁵, Slabý O.⁶

¹ CEITEC –  Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ² Neurochirurgická klinika LF UO a FN Ostrava, ³ I. patologicko-anatomický ústav, LF MU a FN u sv. Anny v Brně, ⁴ Ústav patologie, LF MU a FN Brno, ⁵ Neurochirurgická klinika LF MU a FN Brno, ⁶ CEITEC –  Středoevropský technologický institut, MU, Brno

Východiska: Multiformní glioblastom (GBM) je nejčastější primární nádor mozku astrocytárního původu vyznačující se velmi nepříznivou prognózou. Navzdory konvenční léčbě, která se skládá z maximální chirurgické resekce následované konkomitantní chemoradioterapií s temozolomidem a adjuvantní monoterapií s temozolomidem, je medián přežití pouze 12– 16 měsíců od stanovení diagnózy. Z tohoto důvodu je investováno mnoho úsilí a finančních prostředků do výzkumu nových terapeutických přístupů, které by mohly prodloužit přežití pacientů. Dlouhé nekódující RNA (lncRNA) jsou relativně novou třídou nekódujících regulátorů genové exprese hrajících klíčovou roli v biologii mnoha nádorů vč. GBM. LncRNA se z tohoto hlediska zdají být vhodnými terapeutickými cíli při léčbě GBM. Materiál a metody: Pomocí sekvenovaní nové generace (NGS) jsme provedli expresní analýzu čerstvě zmražených histopatologicky potvrzených 45 GBM tkání a 5 nenádorových mozkových tkání získaných během chirurgické resekce pacientů s intraktabilní epilepsií z nedominantních předních temporálních kortexů, které nevykazovaly známky dysplastických změn. Informovaný souhlas schválený lokální etickou komisí byl obdržen od pacientů před započetím léčby. rRNA deplece a příprava cDNA knihoven byly provedeny pomocí GeneRead rRNA Depletion Kit (Qiagen) a NEXTflex Rapid Directional qRNA-Seq Kit (Bioo Scientific). K sekvenování byly využity NextSeq 500 High Output Kit a NextSeq 500 (oba Illumina). Statistickou analýzou bylo poté vyhodnoceno 24 087 protein kódujících (mRNA) a 8 414 lncRNA a jejich sekvenčních variant s nenulovým RPKM (počet čtení genu na kilobázi délky jeho transkriptu na milión mapovaných čtení) alespoň v jednom vzorku. Pro mapování sekvencí na referenční genom a součet čtení připadajících na cílovou sekvenci byl použit CLC genomic workbench. Výsledky: Z výše uvedeného počtu hodnocených molekul bylo statistickou analýzou objeveno 274 (p < 1 × 10^– 2) dysregulovaných lncRNA ve vzorcích GBM v porovnání s nenádorovými mozkovými tkáněmi. Výsledky sekvenování taktéž odhalily 489 dysregulovaných mRNA s p < 1 × 10^– 3 a 26 mRNA s p < 1 × 10^– 6. Závěr: Uvedené výsledky potvrdily statisticky významnou dysregulaci lncRNA a mRNA v GBM v porovnání s nenádorovými mozkovými tkáněmi. Tyto RNA tak mají značný potenciál stát se vhodnými terapeutickými či diagnostickými biomarkery u GBM. Výsledky bude ovšem nutné ověřit na širším nezávislém souboru GBM vzorků.

Tato práce byla podpořena MZ ČR grantem 15-33158A a projektem RVO (MOÚ, 00209805), a MŠMT ČR projektem CEITEC 2020 (LQ1601).

XXIX/ 338. Deregulace vybraných mikroRNA u dlaždicobuněčného sinonazálního karcinomu –  hledání potenciálních prognostických biomarkerů

Kovaříková H.¹, Bubancová I.¹, Laco J.², Vošmik M.³, Dundr P.⁴, Němejcová K.⁴, Michálek J.⁵, Palička V.¹, Chmelařová M.¹

¹ Ústav klinické biochemie a diagnostiky, LF UK a FN Hradec Králové, ² Fingerlandův ústav patologie, LF UK a FN Hradec Králové, ³ Klinika onkologie a radioterapie LF UK a FN Hradec Králové, ⁴ Ústav patologie, 1. LF UK a VFN v Praze, ⁵ Ústav klinické a molekulární patologie, LF UP a FN Olomouc

Východiska: Karcinomy dutiny nosní a vedlejších nosních dutin (SNC) tvoří 3 % všech maligních onemocnění vyskytujících se v oblasti hlavy a krku. I přes použití agresivní kombinované léčby je medián přežití u SNC méně než 18 měsíců a po dobu 5 let přežívá pouze 20 % pacientů. Sinonazální karcinom dlaždicového epitelu je nejčastějším typem těchto nádorů. Mezi rizikové faktory SNC patří kouření cigaret, HPV infekce a profesní vystavení některým karcinogenním látkám. MikroRNA (miRNA) jsou krátké (~ 22 nukleotidů) nekódující molekuly RNA, které se účastní regulace genové exprese. Jejich primární role spočívá v negativní regulaci translace jako součást komplexu RISC (RNA-induced silencing complex). Materiál a metody: V rámci studie bylo analyzováno 46 vzorků dlaždicobuněčného SNC a 17 vzorků normální sinonazální tkáně. Relativní exprese miR-9, miR-21, miR-99a, miR-137, miR-143, miR-145 a miR-484 byla určena pomocí metody real-time PCR se specifickými TaqMan^® Advanced miRNA Assays a ΔΔCt analýzou. Pro porovnání mezi úrovní exprese miRNA a klinickopatologickými daty byla použita jednofaktorová analýza rozptylu a korelační analýza. Za použití Kaplan-Maierovy metody a log-rank testu byla určena míra přežití. Výsledky: Výsledky real-time PCR analýzy ukazují u vzorků SNC významnou upregulaci miR-21 (p < 0,001) a miR-9 (p < 0,001) oproti kontrolám. Naopak miR-145 byla u nádorových vzorků oproti kontrolám statisticky významně down regulována (p < 0,001). Kaplan-Maierova analýza přežití ukázala, že skupiny pacientů s vyšší upregulací miR-21 (p = 0,063), nižší upregulací miR-9 (0,026), nižší expresí miR-99a (0,068) a vyšší expresí miR-137 (0,0278) se vyznačovaly kratší celkovou dobou přežití (obr. 1). Po porovnání relativní exprese jednotlivých miRNA s klinickopatologickými byla zjištěna korelace mezi expresí miR-21 a lokalizací nádorů (dutina nosní × čelistní; p = 0,026), expresí miR-145 a angioinvazí (p = 0,037), miR-99a a perineurálním šířením (p = 0,0055), miR-137 a přítomností lokální recidivy (p = 0,045), miR-9 a přítomností regionální recidivy (p = 0,045) a nakonec jsme identifikovali korelaci mezi expresí miR-145 a miR-484 a přítomností HPV infekce (p = 0,019, resp. p = 0,016). Závěr: Naše data ukazují, že zkoumané miRNA by mohly být důležitými regulačními molekulami zapojenými do vývoje a postupu dlaždicobuněčných nádorů sinonazální oblasti. Deregulované miRNA (miR-21, miR-9 a miR-145) by mohly být potenciálně využity jako prognostické biomarkery tohoto onemocnění.

XXIX/ 339. Analýza mikroRNA v mozkomíšním moku u pacientů s gliomy

Kopková A.¹, Šána J.^1,2, Večeřa M.¹, Juráček J.¹, Fadrus P.³, Smrčka M.³, Slabý O.¹

¹ CEITEC –  Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ² Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ, Brno, ³ Neurochirurgická klinika LF MU a FN Brno

Východiska: Gliomy jsou rozdělovány podle histopatologických znaků do dvou hlavních skupin a to na gliomy nižšího (LGG) a vyššího (HGG) stupně malignity. Tyto dvě skupiny se značně liší v prognóze, terapii a průměrné době přežívání pacientů, proto její indikace velmi záleží na diagnóze. Nicméně současné diagnostické přístupy jsou u gliomů v mnoha případech limitovány jak lokalizací, tak buněčnou heterogenitou. MikroRNA (miRNA) tvoří skupinu krátkých nekódujících RNA, jež jsou zapojeny do patogeneze mnoha nádorových onemocnění. Pozměněné hladiny miRNA asociovanými s některými typy mozkových nádorů byly navíc pozorovány v mozkomíšním moku (CSF). Tyto skutečnosti naznačují, že by analýza miRNA v CSF pacientů postižených gliomem mohla vést k vytvoření nové diagnostické platformy umožňující přesnější stanovení diagnózy. Materiál a metody: Ve fázi optimalizace izolace RNA z CSF bylo porovnáváno několik komerčně dostupných kitů s různými modifikacemi v protokolu. Jako nejvhodnější byl vyhodnocen Urine microRNA Purification Kit (Norgen). Následná vysokokapacitní analýza miRNA v CSF byla provedena na souboru 36 HGG, 3 LGG a 19 nenádorových vzorků. Všechny vzorky byly analyzovány pomocí technologie sekvenování nové generace (NGS) na přístroji NextSeq 500 (Illumina), s využitím CleanTag small RNA Library Preparation Kitu (Trilink, Biotechnologies) pro přípravu knihovny a NextSeq 500/ 550 High Output Kit v2, 75 cyklů (Illumina) pro vlastní sekvenaci. Výsledky: Následná statistická analýza odhalila 13 rozdílně exprimovaných miRNA mezi CSF odebranými od pacientů s GBM a nenádorovými vzorky (přizpůsobená hodnota p < 1 × 10^–6; miR-499a-5p, miR-30b-5p, miR-4454, miR-4284, miR-5100, miR-4791, miR-490-5p, miR-3607-3p, miR-196a-5p, miR-30c-5, miR-10a-5p, miR-199b-3p a miR-7641). Zároveň bylo odhaleno 9 miRNA, které byly statisticky významně rozdílně exprimovány mezi HGG a LGG (přizpůsobená p hodnota < 0,025; miR-126-3p, miR-144-5p, miR-4454, miR-208b-3p, miR-133b, miR-452-5p, miR-511-5p, miR-944 a miR-133a-3p). Závěr: Na základě výsledků se domníváme, že expresní analýza zmíněných miRNA v CSF by mohla být užitečným diagnostickým nástrojem vedoucím ke zpřesnění diagnózy pacientů s gliomy zejména v případech, kdy v současné době užívanými diagnostickými přístupy dochází k přehlédnutí drobných ložisek s vyšším stupněm malignity, a tedy podhodnocení stupně malignity celého nádoru. Výsledky však ještě musejí být ověřeny na širším a nezávislém souboru vzorků.

Tato práce byla podpořena MZ ČR grantem 15-34553A a projektem RVO MOÚ, 00209805, a MŠMT ČR projektem CEITEC 2020 LQ1601.

XXIX/ 340. Analýza mikroRNA u epiteliálního karcinomu vaječníku

Sommerová L., Ďuríková H., Podhorec J., Hrstka R.

RECAMO, MOÚ, Brno

Východiska: Karcinom vaječníku je nádorové onemocnění s vysokou mortalitou, které bývá diagnostikováno v pozdních stadiích, což potvrzuje nutnost identifikace nových neinvazivních biomarkerů umožňujících detekci onemocnění v raném stadiu. Jednou z potenciálních možností se ukazují být mikroRNA (miRNA). MiRNA jsou malé nekódující molekuly RNA regulující genovou expresi a podílející se na mnohých buněčných procesech vč. karcinogeneze. Soubor pacientů a metody: Celková RNA byla izolována ze sér devíti žen s diagnostikovaným karcinomem vaječníku, které byly léčeny na Masarykově onkologickém ústavu. Jako kontrolní vzorky sloužila séra šesti žen bez prokazatelného onkologického onemocnění. Získaná RNA byla pomocí reverzní transkriptázy přepsána do cDNA, která byla podrobena preamplifikaci. Exprese miRNA byla stanovena pomocí TaqMan MikroRNA testů. Ke statistické analýze byl použit neparametrický Mann-Whitneyův U test. Výsledky: Hladiny miRNA miR-30a-5p a miR-26b byly identifikovány jako statisticky významně zvýšené v séru pacientek s karcinomem vaječníku. Další miRNA vykazující zřetelně zvýšenou hladinu byly miR-628-5p, 520c-3p, miR-486 a let-7b. Naopak miR-596 vykazovala výrazně sníženou hladinu v séru pacientek s karcinomem vaječníku. Závěr: Byla prokázána signifikantně odlišná exprese nejméně dvou miRNA (miR-30a-5p a miR-26b) v sérech pacientek s karcinomem vaječníku v porovnání se séry odebranými od zdravých žen. Tyto miRNA by mohly být v budoucnu využity jako účinný diagnostický nástroj k detekci přítomnosti karcinomu vaječníku právě v rámci odběru tzv. tekutých biopsií.

Práce byla podpořena grantem MŠMT –  NPU I –  LO1413.

XXIX/ 341. Ascitická tekutina u nádoru vaječníků může poskytnou informace vhodné pro diagnostiku

Stuchlíková E., Zahradníková M., Nenutil R., Valík D., Vojtěšek B., Novotný M., Hernychová L.

RECAMO, MOÚ, Brno

Východiska: Rakovina vaječníků je onkogynekologické onemocnění s nejvyšší úmrtností, téměř 80 % pacientek podlehne onemocnění do 5 let od diagnózy. Vysoká úmrtnost je způsobena především nespecifickými příznaky, diagnózou v pozdních stadiích a absencí specifického biomarkeru. V současné době jsou nejčastěji využívanými diagnostickými biomarkery membránový glykoprotein Cancer Antigen 125 (CA 125), Human Epididymal Protein 4 (HE4) a Carcinoembryonic Antigen (CAE). Žádný z těchto biomarkerů není specifický pouze pro rakovinu vaječníků, zvýšené hodnoty mohou být vyvolány i jinými onemocněními, proto se současné výzkumy zaměřují na hledání nových biomarkerů pro diagnostiku a prognostiku rakoviny vaječníků. Zajímavým klinickým materiálem se stává ascites, tekutina hromadící se v dutině břišní, která je typická pro rakovinu vaječníků a vyskytuje se téměř v 90 % případů III. a IV. stadia onemocnění. Materiál a metody: Pro studii byly použity vzorky ascitických tekutin od pacientek s benigním a maligním nádorem vaječníku. Pro kompletní glykomickou a proteomickou analýzu bylo použito 5 µl ascitické tekutiny. Glykanové struktury byly odštěpeny z proteinů pomocí enzymu PNGáza F, proteiny byly následně štěpeny na peptidy pomocí trypsinu. Vzorky byly purifikovány a měřeny pomocí hmotnostního spektrometru. Výsledky: Ve studii byly porovnávány glykanové a proteinové profily pacientek s benigním a maligním nádorem vaječníku. U pacientky s benigním nádorem byly zvýšeny jednodušší glykany s nízkým m/ z, naopak u pacientky s maligním nádorem byly zvýšeny vyšší, komplexní glykany. U maligního nádoru bylo identifikováno 127 unikátních proteinů, především proteiny rodiny annexinů, mucinů a peroxiredoxinů. Závěr: Práce je pilotní studií zabývající se srovnáním glykanového a proteinového složení ascitické tekutiny mezi pacientkou s benigním a maligním nádorovým onemocněním vaječníků. Na glykanové i proteinové úrovni byly patrné signifikantně významné rozdíly. Výsledky budou ověřeny na větším souboru pacientek a porovnány se sadou kontrolních vzorků.

XXIX/ 342. The prognostic role of CTCs/ DTCs in non-small cell lung cancer

Řehulková A.¹, Prokopová A.¹, Vahalíková M.¹, Chudáček J.², škarda J.³, Klein J.^4,5, Grygarková I.⁶, Vrbková J.¹, Srovnal J.¹, Hajdúch M.¹

¹ Institute of Molecular and Translational Medicine, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University and University Hospital in Olomouc, ² Department of Surgery, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University and University Hospital in Olomouc, ³ Institute of Clinical and Molecular Pathology, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University and University Hospital in Olomouc, ⁴ Department of Oncology, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University and University Hospital in Olomouc, ⁵ Tomas Bata Regional Hospital, Zlin, ⁶ Department of Tuberculosis and Respiratory Disease, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University and University Hospital in Olomouc

Purpose: The role of circulating tumor cells is one of main topics in cancer research during last years. It was established that elevated levels of circulating tumor cells decrease survival rate of patients with epithelial cancer. However, CTCs rarity in early stages complicates their detection. Improved sensitivity in pulmonary blood and bone marrow was described. We have analyzed CTCs/ DTCs presence simultaneous in blood samples from peripheral and pulmonary vein and bone marrow for more robust results. Materials and Methods: The patients with non-metastatic NSCLC without previous treatment were enrolled in the study. Quantitative real-time reverse transcriptase PCR was performed for CTCs/ DTCs detection. CEA, EGFR, LunX, c-met, EpCAM mRNA expression were detected in peripheral blood (PB), tumor-draining blood (TDB) and bone marrow (BM) before start of treatment. Software R, ver. 3.2.3 and additional R packages was used for statistical analysis. The Kruskal-Wallis/ ANOVA tests, Wilcoxon exact rank/ Student’s t-tests, Bonferroni, Kaplan-Meier method, log-rank tests were used. Results: A cut-off estimation were calculated for each marker according to disease-free survival. CTCs/ DTCs-positivity was detected in PB, TDB and BM using CEA (26.3%, 30.4%, 42.6%, resp.), EGFR (17.8%, 27.7%, 30.4%), LunX (27.1%, 11.6%, 34.8%, resp.), c-met (21.2%, 12.5%, 49.6%, resp.) and EpCAM (27.1%, 22.3%, 42.6%, resp.) as CTCs/ DTCs biomarker. CTCs/ DTCs were specified as factor independent from clinical-morphological parameters of tumors. Correlation with tobacco-smoking status was established using EGFR and EpCAM as CTCs biomarker. We have established that the presence of CEA and EpCAM mRNA-positive cells in tumor-draining blood and bone marrow predict poor prognosis. We found no statistically significant results in survival analysis of EGFR, LunX and c-met mRNA-positive group. Conclusion: The CTCs/ DTCs presence in liquid biopsies of cancer patients will help in the future more precisely predict the subsequent behavior of tumor diseases and better understanding necessity of the systemic treatment.

The work was supported by grants IGA LF UP 2017_013, TACR TE02000058 and NPU LO1304.

XXIX/ 343. Analýza cirkulujících plazmatických buněk u pacientů s mnohočetným myelomem

Sedlaříková L.¹, Bezděková R.², Říhová L.², Almáši M.², Kubaczková V.¹, Radová L.³, Penka M.², Štork M.⁴, Pour L.⁴, Ševčíková S.^1,2

¹ Babákova myelomová skupina, Ústav patologické fyziologie, LF MU, Brno, ² Oddělení klinické hematologie, FN Brno, ³ CEITEC –  Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ⁴ Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno

Východiska: Mnohočetný myelom (MM) je hematoonkologické onemocnění charakterizované infiltrací kostní dřeně (KD) monoklonálními plazmatickými buňkami (PC). Ty se obvykle v periferní krvi (PK) nevyskytují, avšak někdy expandují z KD do PK a jedná se o tzv. cirkulující plazmatické buňky (cPC). Jejich přítomnost je považována jako negativní prognostický znak a je asociována s kratším přežitím MM pacientů. MikroRNA (miRNA) jsou krátké nekódující jednořetězcové molekuly RNA, které regulují genovou expresi a jsou zapojeny do patofyziologie MM. Cílem práce bylo porovnat expresi miRNA a povrchových znaků u PC z KD s cPC v PK u pacientů s MM. Materiál a metody: Do studie bylo zařazeno osm párových vzorků MM pacientů (KD a PK) v době diagnózy. Detekce PC byla provedena pomocí znaků CD38, CD45 a CD138. Pro další analýzu PC byly využity: CD19 k odlišení reziduálních normálních PC (N-PC), CD56 pro detekci abnormálních PC (A-PC) a CD20 k odlišení populace plazmablastů (prekurzorů PC) a k detekci A-PC. Izolace cPC byla provedena magnetickou separací pomocí Plasma Cell Isolation Kit II na autoMACSpro (Miltenyi Biotech). Pro miRNA analýzy bylo vybráno šest párových vzorků cPC, kdy miRNA byly izolovány pomocí miRNeasy Mini Kit (Qiagen) a analýza exprese byla provedena pomocí miRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I, V4.R (Exiqon) dle doporučení výrobce. Pomocí lineárních modelů jsme párovým testem ověřili statisticky signifikantní rozdíl exprese miRNA a výsledné p hodnoty párových testů adjustovali Benjamini-Hochberg korekcí pro mnohonásobné porovnání. Výsledky: Bylo identifikováno osm MM pacientů s adekvátním počtem cPC vhodných k následnému zpracování (nutná flow cytometrická detekce > 1 % cPC ze všech leukocytů). V PK byl zjištěn medián cPC 1,76 % (rozsah 1,28– 3,55). Souběžně s PK byla u daných pacientů analyzována i KD s mediánem 23,95 % (rozsah 10,8– 69,9) PC v KD, kdy přítomnost cPC bylo možno sledovat u pacientů s vyšší infiltrací PC v KD. Znak CD56 byl s obdobnou mírou exprimován u většiny pacientů (6/ 8) v PK i KD, CD19 byl na patologických PC exprimován zřídka (2/ 8) a CD20⁺ PC nebyly v analyzovaných vzorcích identifikovány. Výsledná analýza profilu miRNA odhalila 19 miRNA, které jsou signifikantně méně exprimovány ve vzorcích cPC oproti PC z KD (p < 0,05). Závěr: Prvotní analýza ukázala, že exprese vybraných znaků na cPC je ve všech případech shodná s nálezem v KD. Profilování exprese miRNA u párových vzorků odhalila 19 rozdílně exprimovaných miRNA, které by mohly mít vliv na vycestování PC mimo KD.

Práce byla podpořena grantem MZ ČR –  RVO (FNBr, 65269705).

XXIX/ 344. Identification of three distinct molecular subtypes in meningioma samples using microarrays for copy-number variants

Srovnal J.¹, Balík V.², Houdová Megová M.¹, Ehrmann J.³, Vaverka M.², Hrabálek L.², Trojanec R.¹, Staffová K.¹,Vrbková J.¹, Hajdúch M.¹

¹ Institute of Molecular and Translational Medicine, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University and University Hospital Olomouc, ² Department of Neurosurgery, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University and University Hospital Olomouc, ³ Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University and University Hospital Olomouc

Background: Meningioma represents one of the most com­mon intracranial tumors. They are generally thought to progress from low to high-grade lesions. However, the molecular mechanisms underly­ing their pathogenesis remain still uncertain. Identification of meningioma molecular subgroups may have significant potential to improve clinical management, through molecular disease risk stratification strategies and the identification of patients who could benefit from targeted molecular therapeutics. Patients and Methods: Formalin-fixed paraffin embedded tumor samples were obtained from 45 meningioma patients and 5 healthy controls (dura mater). Comprehensive clinical-pathological data were mined. There were 15 males and 30 females; median age was 54 years, range 28– 99 years. Total DNA was purified from FFPE samples after pathological verification using proteinase K treatment followed by QIAmp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen). Microarray analysis was performed using the OncoScan FFPE Assay Kit (Affymetrix), raw data were obtained using Chromosome Analysis Suite (Affymetrix) in default manner. Results: Our results confirm that chromosome 22 deletion and del(1p) are the most common (55%, resp. 47% of cases) deletions in meningioma. We revealed chromosomal gains not as rare as was published previously while the dup(3q) was present in 31% of cases. Three meningioma molecular patterns were identified based on CNV profiling –  normal-like profile, deletion profile and complex profile. Deletion profile was characterized by loss of 1p and monosomy of chromosomes 6, 10, 14, 18 and 22. The complex profiles combined gains (3q, 8q, chromosomes 12, 15 and 20) and losses (1p, chromosomes 13, 21 and 22). The primary tumor samples of patients with meningioma recurrence (20 patients) had different CNV profile in comparison with patients without recurrence (25 patients). Recurrent tumors had statistically significant higher frequencies of losses on chromosomes 1, 9, 10, 11, 13 and 21 and gains on chromosomes 12, 19 and 20. Conclusion: We have identified three distinct meningioma molecular patterns –  normal-like profile, deletion profile and complex profile. Chromosome 22 deletion, del(1p) and dup(3q) are the most common CNV (55%, 47%, resp. 31% of cases) in meningioma. Potential CNV changes in recurrent meningioma were identified. However, it will require further validation using FISH.

This work was financially supported by Ministry of Health of the Czech Republic, grant No. 15-29021A, IGA UP LF 2016_010 and NPU LO1304.

XXIX/ 345. Vliv nádorové exprese kanabinoidních receptorů 1 a 2 na přežití pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic

Vahalíková M.¹, Srovnal J.¹, Berta E.¹, Prokopová A.¹, Gurská S.¹, Řehulková A.¹, Vrbková J.¹, Prášil P.², Klein J.^3,4, Hajdúch M.⁵

¹ Ústav molekulární a translační medicíny, LF UP a FN Olomouc, ² Klinika anesteziologie, resuscitace a intenzivní medicíny LF UP a FN Olomouc, ³ Onkologická klinika LF UP a FN Olomouc, ⁴ Krajská nemocnice T. Bati, Zlín, ⁵ Ústav molekulární a translační medicíny, LF UP a FN Olomouc

Úvod: Karcinom plic je jednou z nejčastějších příčin úmrtí na nádorová onemocnění na světě. Růst nádoru a přežití pacientů jsou závislé na mnoha faktorech, mimo jiné na expresi receptorů a růstových faktorů, aktivaci onkogenů apod. U karcinomu plic často dochází k overexpresi nebo mutaci receptoru pro epidermální růstový faktor (EGFR). V současné době je EGFR dráha jedním z hlavních cílů léčby nádorových onemocnění. Bylo zjištěno, že některé kanabinoidy regulují EGFR dráhu prostřednictvím downregulace ERK, STAT3 a AKT signálních drah, které souvisejí s proliferací, migrací a invazí nádorových buněk. V této studii jsme se zabývali expresí  CNR1 a CNR2 receptorů v nádorové tkáni pacientů s NSCLC a analyzovali jsme vztah mezi genovou expresí těchto receptorů a přežitím pacientů. Materiál a metody: Exprese genů CNR1 a CNR2 byla analyzována v nádorové tkáni 98 pacientů s NSCLC fixované v RNALateru (Ambion). RNA byla izolována pomocí precipitační metody (TRIreagent, MRC). Z RNA byla pomocí reverzní transkripce získána cDNA. Exprese CNR1 a CNR2 byla měřena pomocí real-time PCR na přístroji LC1536 (Roche). Pro normalizaci genové exprese byla použita exprese β-actinu. Pro každý marker byly ze zkoumaného souboru pacientů spočítány specifické cut-off hodnoty pomocí funkce Maxstat v softwaru R, verze 3.3.1. Vztah mezi expresí CNR1 a CNR2 v nádorové tkáni a přežitím pacientů byl analyzován pomocí Coxovy regrese, Waldova testu, Firthovy metody, Kruskal-Wallis/ ANOVA testu a Kaplan-Meierovy metody. Výsledky a závěr: Expresi kanabinoidních receptorů jsme vyšetřovali u 98 pacientů s NSCLC (31 žen a 67 mužů) v klinickém stadiu IA– IIIA. Pacienti byli rozděleni do tří skupin podle histologického typu (38,8 % adenokarcionom, 8,2 % adeno-like typ a 53 % pacientů non-adeno karcinom). Exprese CNR1 byla detekována celkově u 50 % pacientů, u 14,3 % pacientů byla exprese nad a u 85,7 % pod cut-off hodnotou. Exprese CNR2 byla detekována u všech testovaných pacientů, 20,4 % pacientů mělo expresi vyšší a 79,6 % nižší než cut-off hodnotu. Zjistili jsme, že pacienti s vyšší expresí CNR1 a CNR2 mají signifikantně lepší cancer-specific survival (p = 0,018; resp. p < 0,001) a disease-free survival (p = 0,049, resp. p < 0,001) než pacienti s nízkou expresí kanabinoidních receptorů. Pacienti pozitivní na expresi CNR2 mají významně delší celkové přežití (p < 0,001), než pacienti s nulovou expresí CNR2. Vliv kanabinoidních receptorů na přežití pacientů může být způsoben jejich působením na dráhu EGFR.

Práce byla podpořena granty IGA LF UP 2017_013, TACR TE02000058 a NPU LO1304.

XXIX/ 346. Asociácia polymorfizmov v géne FGF10 a FGFR2 s výskytom rakoviny prsníka v súbore slovenských žien

Danková Z.¹, Kapinová A.¹, Žúbor P.¹, Grendár M.², Zelinová K.¹, Jagelková M.¹, Kasajová P.³, Gondová A.³, Kalman M.⁴, Lasabová Z.¹

¹ Divízia onkológia, Biomedicínske centrum Martin, JLF UK v Martine, ² Oddelenie bioinformatiky, Biomedicínske centrum Martin, JLF UK v Martine, ³ Gynekologicko-pôrodnícka klinika JLF UK a UN Martin, 4 Ústav patologickej anatómie, JLF UK a UN Martin

Úvod: Nízko penetrujúci gén pre fibroblastový rastový faktor (FGF10) a jeho receptor (FGFR2) predstavujú podľa GWAS štúdií kandidátne gény karcinómu prsníka. Extrapolácia týchto výsledkov v jednotlivých populáciách však nie je jednoznačná z dôvodu interpopulačnej heterogenity. Cieľ: Cieľom práce bolo zistiť asociáciu polymorfizmov rs4415084 (C/ T) v géne FGF10 a rs2981582 (C/ T) v géne FGFR2 s výskytom rakoviny prsníka v populácii slovenských žien. Súbor a metódy: Súbor tvorilo 171 žien s nádorom prsníka (57,06 ± 11,60 rokov) a 146 žien bez histórie akéhokoľvek malígneho ochorenia (50,24 ± 10,69 rokov). Genotypy sa stanovili metódou HRM –  vysoko-rozlišovacia analýza kriviek topenia s následnou validáciou Sangerovým sekvenovaním. Asociácia bola testovaná chí-kvadrát testom dobrej zhody a logistickou regresiou. Výskum bol schválený etickou komisiou. Výsledky: Štatisticky významne odlišné frekvencie genotypov medzi ženami s nádorom prsníka a zdravými ženami boli zaznamenané v prípade génu FGFR2 (p = 0,032). Nositeľky recesívneho homozygotného genotypu TT majú vyššie riziko nádoru prsníka (OD 1,95; 95% CI 1,01– 3,83; p = 0,049) ako ženy s heterozygotným genotypom CT (OD 1,78; 95% CI 1,09– 2,90), v porovnaní so ženami s genotypom CC. Diskriminačná schopnosť tohto polymorfizmu je pomerne nízka vzhľadom na klasifikačnú chybu 41,95 %. Medzi histologickým typom, molekulovým podtypom a sledovanými genotypmi nebola štatisticky významná asociácia (p > 0,05). Gén FGF10 neasocioval s výskytom nádoru prsníka (p = 0,388). Záver: Predbežné výsledky štúdie slovenských žien potvrdili pozitívnu asociáciu medzi genotypmi polymorfizmu rs2981582 (FGFR2) s karcinómom prsníka. Diskriminačná schopnosť tohto SNP však nie je vysoká.

Práca bola podporená projektom KEGA 015UK-4/ 2015.

XXIX/ 347. Antioxidačné pôsobenie rastlinných prirodzených substancií v experimentálnej mamárnej karcinogenéze

Kapinová A.¹, Kubatka P.^1,2, Murín R.², Mahmood S.², Péč M.², Dobrota D.²

¹ Divízia Onkológia, Martinské centrum pre biomedicínu, JLF UK v Martine, ² Ústav lekárskej biológie, JLF UK v Martine

Úvod: Celosvetovo predstavuje rakovina prsníka najčastejšie nádorové ochorenie u žien. Existuje predpoklad, na základe epidemiologických a predklinických štúdií, že zmes bioaktívnych nenutričných rastlinných zložiek –  fytochemikálií obsiahnutých v rastlinných zložkách potravy so širokým spektrom biologických aktivít môže poskytnúť aditívne či synergické účinky proti karcinogenéze. Cieľ: Na základe tejto hypotézy, hlavným cieľom štúdie bolo zhodnotiť chemopreventívny a terapeutický účinok zmesi fytochemikálií obsiahnutých v dvoch substanciách –  Hordeum vulgare L., phylloma (listy mladého jačmeňa) a Flavin7^® (zmes ovocných polyfenolov), v premenopauzálnom modeli rakoviny mliečnej žľazy, a to okrem iného, aj prostredníctvom štúdia antioxidačného pôsobenia nami testovaných fytofarmák. Materiál a metódy: Samice potkanov kmeňa Sprague-Dawley boli náhodne rozdelené do troch experimentálnych skupín: 1. kontrolná skupina bez chemoprevencie; 2. skupina s fytofarmakom aplikovaným v nižšej koncentrácii v potrave (0,3 %); 3. skupina s fytofarmakom aplikovaným vo vyššej koncentrácii v potrave (3 %). Chemoprevencia začala týždeň pred aplikáciou karcinogénu a trvala do ukončenia experimentu (15 týždňov). Na konci experimentu sme sa pri štúdiu antioxidačného pôsobenia testovaných substancií zamerali na stanovenie vybraných parametrov oxidačného poškodenia bielkovín (dityrozíny, konjugáty lyzínu, 3-nitrotyrozíny) prostredníctvom fluorescenčného merania a na stanovenie expresie vybraných enzýmov s antioxidačnou kapacitou (SOD-2, kataláza, glutatión reduktáza) za použitia Western blotovej analýzy a ELISA testu. Výsledky: V prípade skupiny s vyššou dávkou mladého jačmeňa v potrave sme v homogenátoch mamárnych nádorov pozorovali štatisticky významný 30 ± 8 % (p = 0,025) pokles hodnôt dityrozínov v porovnaní s kontrolou. Záver: V prípade štúdie ide o prvú správu o chemopreventívnych a terapeutických účinkoch listov mladého jačmeňa a Flavinu7^® v experimentálnej mamárnej karcinogenéze in vivo. Výsledky štúdie poukazujú na protinádorový účinok zmesi fytochemikálií obsiahnutých vo skúmaných fytofarmakách v použitom experimentálnom modeli. Preukázali sme, že zložky obsiahnuté v mladom jačmeni sú schopné podporiť antioxidačnú kapacitu buniek.

Práca bola finančne podporená grantom VEGA č. 1/ 0108/ 16 a projektom „Martinské centrum pre biomedicínu (BioMed Martin)“ ITMS kód projektu: 26220220187, ktorý je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ.

XXIX/ 348. Molekulární chaperony –  workoholici v nádorové transformaci

Martinková V.¹, Trčka F.^2,3, Ďurech M.³, Křivánková K.^2,3, Dvořáková P.¹, Hernychová L.³, Vojtěšek B.³, Müller P.³

¹ MOÚ, Brno, ² Úsek molekulární a experimentální patologie, MOÚ, Brno,³ RECAMO, MOÚ, Brno

Východiska: Proteiny tepelného šoku (heat shock proteins) HSP70 a HSP90 jsou hlavní molekulární chaperony podílející se na udržení proteinové homeostázy. Hrají významnou roli při skládání nově syntetizovaných polypeptidových řetězců, zabraňují denaturaci proteinů či zamezují tvorbě proteinových agregátů. V nádorových buňkách se však molekulární chaperony podílejí na stabilizaci řady mutovaných proteinů, často onkoproteinů –  např. proteiny Her2, Bcr-Abl nebo vSrc jsou substráty chaperonu HSP90. Aktivita a funkce molekulárních chaperonů je dále řízena specializovanými proteiny –  kochaperony, které tvoří spolu s chaperony multichaperonové komplexy. Vysoká aktivita chaperonů spolu s vytvářením multichaperonových komplexů je charakteristickou vlastností pokročilých nádorů, která jim umožňuje stabilizovat onkogenní proteiny a čelit buněčnému stresu. Inhibice chaperonů pomocí malých molekul proto představuje nadějný způsob protinádorové terapie zasahující řadu onkogenních drah současně. Podmínkou pro úspěšnou aplikaci chaperonových inhibitorů v klinických zkouškách je charakterizace změn chaperonového systému v jednotlivých nádorech a definice biomarkerů pro cílenou léčbu. Cílem této práce je proto nalezení molekulárních mechanizmů ovlivňujících interakce chaperonového systému a jejich aktivitu v nádorových buňkách. Metody: Chaperonový systém byl studován in vitro s využitím rekombinantních proteinů HSP70, HSP90 a jejich kochaperonů. Metoda vodík/ deuteriové výměny ve spojení s hmotnostní spektrometrií (HDX-MS) byla použita pro studium struktury chaperonů a interakčních rozhraní, metoda izotermální titrační kalorimetrie (ITC) pro studium termodynamiky interakcí. Testování vazby inhibitorů HSP70 bylo provedeno metodou fluorescenční polarizace. Výsledky: Metodou HDX-MS jsme definovali konformační změny chaperonu HSP70 indukované vazbou ATP. Dále jsme charakterizovali termodynamiku ATP dependentní interakce proteinu HSP70 s kochaperonem Tomm34. Pomocí funkčních esejí bylo zjištěno, že protein Tomm34 inhibuje HSP70/ HSP40 řízený refolding denaturované luciferázy. V další části této práce jsme se zaměřili na možnost inhibice ATPázové aktivity HSP70. Závěr: Tato práce představuje souhrn biochemických a biofyzikálních metod, kterými jsme schopni analyzovat strukturu a funkci proteinů chaperonového systému na našem pracovišti. Získané informace popisující fungování chaperonového systému mohou být následně využitelné k návrhu nových inhibitorů nebo k hledání molekulárních cílů protinádorové terapie.

Práce byla podpořena projekty MŠMT –  NPU I –  LO1413 a GA ČR 16-20860S.

XXIX/ 349. Diagnostický a terapeutický potenciál membránového HSP90

Vacek O., Pastorek M., Ďurech M., Vojtěšek B., Müller P.

RECAMO, MOÚ, Brno

Východiská: Heat shock protein 90 (HSP90) je molekulárny chaperone, ktorý pomáha bunke udržiavať proteínovú homeostázu cez moduláciu stability de novo syntetizovaných proteínov. Zvýšená expresia HSP90 je charakteristická pre nádorové bunky s vysokými metabolickými nárokmi, ktoré si vytvorili „závislosť” na chaperónovom systéme. Špecifická inhibícia HSP90 má preto sľubný terapeutický potenciál a niekoľko inhibítorov HSP90 sa už nachádza aj v klinických skúškach. Nedávno bola okrem cytoplazmatickej lokalizácie popísaná aj prítomnosť HSP90 na membráne nádorových buniek, pričom extracelulárne lokalizovaný HSP90 bol u nádorov implikovaný pri zvýšenej invazivite a metastázovaní. Pochopenie vzťahu cytoplazmatickej a na membráne exponovanej formy HSP90 môže mať vďaka jeho prirodzene vyššej hladine v nádorových bunkách význam pri skorej detekcii malignity ako aj prispieť k pochopeniu mechanizmu importu terapeutík cielených na HSP90 do buniek. Preto sme na modeli bunkových línií karcinómu prsníka skúmali závislosť importu fluorescenčne značeného inhibítora HSP90 od hladiny jej membránovej formy a celkovej expresie HSP90. Metódy: Prietoková cytometria bola použitá na stanovenie importu FITC-Geldanamycin do buniek a hladiny extracelulárnej HSP90, celková expresia HSP90 bola stanovená pomocou SDS-PAGE a Western blottingu. Získané dáta boli podrobené štatistickej analýze možnej korelácie. Výsledky: Na vybraných bunkových líniách karcinómu prsníka (BT-474, BT-549, BT-20, MCF-7, MDA-MB-468, SK-BR-3 a T-47D) sme analyzovali celkovú hladinu HSP90 a mieru jej expozície na bunkovej membráne a pomocou prietokovej cytometrie sme určili mieru importu fluorescenčne značeného inhibítora HSP90. Získané dáta nám po štatistickej analýze odhalili koreláciu medzi hladinou celkového a membránového HSP90 a takisto importom fluorescenčne značeného inhibítora HSP90 FITC-Geldanamycin. Záver: Z našich výsledkov vyplýva, že import inhibítorov HSP90 je pravdepodobne závislý od hladiny membránovej formy HSP90 ako aj jej celkovej expresie a môže tak odrážať závislosť nádorových buniek na chaperone HSP90.

Práca bola podporená projektom MŠMT –  NPU I –  LO1413.

XXIX/ 350. Encyclopedia of CLL Subsets –  Nový bioinformatický nástroj a unikátní databáze pro výzkum a klinické využití subsetů stereotypních B buněčných receptorů u chronické lymfocytární leukemie

Reigl T.¹, Bystrý V.¹, Krejčí A.^1,2, Brázdilová K.^1,3, Plevová K.^1,3, Pospíšilová Š.^1,3, Darzentas N.¹

¹ CEITEC –  Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ² RECAMO, MOÚ, Brno, ³ Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno

Východiska: Chronická lymfocytární leukemie (CLL) je hematoonkologické onemocnění s vysokou biologickou i klinickou variabilitou. Tato variabilita koresponduje s molekulárními a buněčnými markery, mezi něž patří také sekvenční motivy B buněčných receptorů (BcR), které se u určitých skupin pacientů opakují téměř identicky. Tyto skupiny, do kterých patří třetina CLL pacientů, sdílejí velmi podobné BcR a tvoří tzv. stereotypní subsety CLL. Většina subsetů vykazuje vysokou vnitřní homogenitu z hlediska klinických i biologických charakteristik onemocnění. Pro usnadnění orientace ve stereotypních subsetech u CLL a jejich klinické interpretaci byla vytvořena „Encyclopedia of CLL Subsets“. Metody: Encyklopedie je vytvořena v rámci nástroje „Antigen Receptor Research Tool/ ARResT“ [bat.infspire.org/ arrest/ ] specializovaného na zpracování, anotaci a shlukování imunoglobulinových sekvencí a jejich interaktivní analýzu a vizualizaci. Vstupem může být jakýkoli dataset imunoglobulinových sekvencí, vyšetřený u pacientů s CLL. Analyzované sekvence mohou být přímo zařazeny do příslušného subsetu pomocí integrovaného nástroje ARResT/ AssignSubsets a srovnány s výsledky publikované metaanalýzy 7 500 CLL pacientů, která je integrována do systému. Encyklopedie obsahuje také databázi elektronicky dostupné literatury, která je automaticky doplňována pomocí strojového dotazování serveru PubMed a následného využití „text-mining“ metod. Výsledky: Vytvořením encyklopedie subsetů CLL vznikl unikátní portál pro interaktivní přehled klinických a molekulárně biologických vlastností stereotypních subsetů v kombinaci s přístupem k nejnovějším publikovaným informacím. V současnosti je nástroj navržen pro analýzu všech 19 hlavních subsetů, z nichž u většiny je v literatuře doložen jejich prognostický význam. K dispozici má uživatel přístup k více než 200 relevantních publikací. Celý systém je možné využít pro správu, analýzu a vizualizaci lokálního datasetu CLL pacientů pro potřeby jednotlivých pracovišť. V současné době probíhá vývoj tohoto systému, vč. databáze vyšetřených sekvencí, pro Interní hematologickou a onkologickou kliniku FN Brno. Závěr: Množství publikací zmiňujících stereotypní subsety u CLL koresponduje s jejich rostoucím významem ve výzkumu i klinické praxi. Encyklopedie subsetů CLL je efektivním nástrojem pro přístup k nejnovějším poznatkům z této oblasti a umožňuje pokročilou analýzu vlastních dat pro využití ve výzkumu i rutinní diagnostice.

Podpořeno z programového projektu Ministerstva zdravotnictví ČR s reg. č. 16-34272A.

XXIX/ 351. Využití porózního hydrogelu jako 3D scaffoldu pro růst leukemických B lymfocytů

Studená R.¹, Horák D.², Baloun J.^1,3, Plichta Z.², Pospíšilová Š.¹

¹ Centrum molekulární medicíny, CEITEC –  Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ² Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i., Praha, ³ LF MU, Brno

Východiska: Primární lidské B buňky chronické lymfocytární leukemie (CLL) podléhají při kultivaci in vitro buněčné smrti, nicméně jejich přežití lze signifikantně prodloužit kontaktem se stromálními buňkami nebo přítomností specifických solubilních faktorů. Pro účely výzkumu chování CLL buněk jsme vytvořili 3D in vitro model, ve kterém bylo simulováno vhodné mikroprostředí pro CLL buňky umožňující studium mechanizmu jejich přežívání v dlouhodobé kultivaci. Materiál a metody: Naším cílem bylo, aby struktura scaffoldu byla geometricky podobná 3D morfologii kostní dřeně, která vyplňuje trabekulární kost, aby měl 3D scaffold dostatečně velký povrch pro zachycení buněk a zároveň velkou pórovitost pro buněčnou migraci a transport živin. Dalším požadavkem byla také alespoň částečná transparentnost potřebná pro pozorování buněčného modelu pomocí optických metod. Připravili jsme 3D scaffoldy z porózního hydrogelu poly(2-hydroxyetyl metakrylát) (pHEMA), poly(2-hydroxyetyl metakrylát-co-2-aminoetyl metakrylát) p(HEMA-co-AEMA) a p(HEMA-co-AEMA) modifikovaný s často používaným adhezním peptidem Arg-Gly-Asp (RGD). Všechny hydrogelové scaffoldy byly vyrobeny ve čtyřech velikostech pórů (125, 200, 300 a 350– 450 μm). Scaffoldy byly testovány pomocí HS-5 buněčné linie odvozené z lidských stromálních buněk kostní dřeně a HEK293 buněčné linie odvozené z lidských embryonálních buněk ledvin. Výsledky: Hydrogelový scaffold p(HEMA-co-AEMA) modifikovaný adhezním peptidem Arg-Gly-Asp (RGD) s velikostí pórů 350– 450 μm prokázal, že je vhodným systémem pro 3D kultivace buněk, neboť podporuje interakce mezi buňkami navzájem a také mezi buňkami a materiálem. Tento scaffold byl použit pro nasazení kultivace složené z HS-5 buněk a CLL buněk, které byly stimulovány pomocí ligandu CD40 a cytokinu IL-4. Viabilita CLL buněk byla vyšší v přítomnosti obou stimulátorů zároveň než v případě každého zvlášť. Závěr: Ukázali jsme, že technologie 3D scaffoldů je velmi dobře využitelná pro modelování mikrosystémů, kde se nádorové buňky chovají jako ve svém přirozeném mikroprostředí.

XXIX/ 352. Elektrochemický test pro detekci HPV DNA

Bartošík M., Hrstka R.

RECAMO, MOÚ, Brno

Úvod: Dlouhodobě neléčená přítomnost vysoce rizikových kmenů lidských papilomavirů HPV-16 a HPV-18 je nejčastější příčinou karcinomu děložního hrdla u žen [1]. V posledních letech se pro detekci těchto kmenů začínají hojně využívat molekulární metody, které jsou zaměřené na detekci DNA těchto HPV a pomáhají zefektivnit diagnostiku i následný management pacientek. Včasná diagnostika (nejenom) tohoto onemocnění ovšem vyžaduje vývoj nových, rychlejších a levnějších metod detekce. Jednu z těchto metod by mohla představovat i elektrochemie, která umožňuje miniaturizaci elektrod a paralelní detekci více vzorků [2]. Materiál a metody: Pro detekci DNA izolované jednak z nádorových linií CaSki a SiHa, ale i z kartáčkových stěrů pacientek jsme použili PCR amplifikaci, hybridizaci amplifikované DNA s vazebnou DNA sondou upevněnou na magnetických kuličkách, inkubaci s konjugátem protilátka/ peroxidáza a monitorování enzymatické reakce na elektrodových čipech [3]. Kromě klasické PCR jsme vyzkoušeli i rychlejší variantu izotermální amplifikace vstupního materiálu, konkrétně tzv. LAMP reakci (45 min/ 60 °C). Enzymatická reakce byla sledována pomocí amperometrie při potenciálu – 0,3 V. Výsledky: Vyvinuli jsme test, který umožňuje detekci přítomnosti HPV-16 DNA v biologických i klinických vzorcích. Test je reprodukovatelný (RSD < 10 %), citlivý (~50 attomolů HPV DNA) a selektivní (rozlišuje HPV-16 a HPV-18). Výsledky byly validovány na nádorových liniích pozitivních (CaSki a SiHa) i negativních na HPV-16 (HeLa a H1299) a následně na klinickém materiálu pocházejícím z ambulantně odebraných kartáčkových stěrů. Všechny výsledky jednoznačně korelovaly s PCR vizualizovanou pomocí gelové elektroforézy. Následné zavedení elektrodového čipu umožnilo paralelní detekci osmi vzorků současně, čímž se významně zkrátil čas měření. Započali jsme rovněž s optimalizací LAMP reakce a elektrodového čipu detekujícího HPV-16 v LAMP směsi, přičemž i zde jsou pozorovány rozdíly mezi pozitivními a negativními vzorky. Závěr: V porovnání s většinou ostatních elektrochemických přístupu jsme úspěšně aplikovali námi vyvinutý test na klinickém materiálu [3]. V současné době jsou optimalizovány LAMP experimenty nevyžadující PCR reakci, což by zrychlilo a zjednodušilo náš již dříve publikovaný přístup.

[1] Walboomers JM et al. J Pathol 1999; 189(1): 12– 19. [2] Palecek E et al. Chem Rev 2012; 112(6): 3427– 3481. [3] Bartosik M et al. Biosens Bioelectron 2016; 83: 300– 305.

Práce byla podpořena projekty MZ ČR –  RVO (MOÚ, 00209805), MŠMT –  NPU I –  LO1413 a GA ČR P206/ 12/ G151.

XXIX/ 353. Stanovení DNA metylace v BRCA2 genu na elektrodových biočipech

Bartošík M.¹, Bartáková D.²

¹ RECAMO, MOÚ, Brno, ² Masarykova univerzita, Brno

Úvod: DNA metylace tlumí expresi genů, a hraje tak důležitou roli v proliferaci nebo diferenciaci buněk. Abnormální metylace DNA, zejména promotorů genů, je často asociována se vznikem nádorových onemocnění, a proto se analýza metylace DNA jeví jako zajímavá možnost při včasné diagnostice nádorů, případně při určení jejich invazivity, progrese nebo metastatického potenciálu. Jednou z metod analýzy by mohla být i elektrochemie, která nabízí finančně nenáročné přístrojové vybavení, rychlé měření a paralelní detekci více vzorků. Materiál a metody: Analyzovali jsme metylační status konkrétního místa promotoru genu BRCA2 hrajícího roli při vzniku karcinomu mléčné žlázy. Tuto sekvenci jsme hybridizovali na magnetické kuličky a štěpili pomocí metyl senzitivní restriktázy BstUI, která štěpí restrikční místo CGCG u nemetylované DNA, nikoli však u metylované DNA. Po přidání značené DNA sondy a peroxidázy jsme sledovali enzymatickou reakci na elektrodovém čipu. Výsledky: Nejdřív jsme pomocí gelové elektroforézy ověřili vhodnost navržených sond a efektivitu štěpení restriktázy BstUI. Následně jsme tyto sondy a BstUI enzym použili v kombinaci s magnetickými kuličkami a s výslednou detekcí na elektrodovém čipu. Ukázali jsme, že výsledky dobře korelují s gelem, tj. že značená sonda byla na magnetických kuličkách restriktázou odštěpena pouze u nezametylovaného restrikčního místa. V případě, že restrikční místo bylo zametylováno, ke štěpení nedošlo a výsledný signál byl vysoký. Ukázali jsme i dobrou reprodukovatelnost měření. Závěr: Elektrochemická detekce se jeví jako potenciálně zajímavý nástroj, který by společně s magnetickými kuličkami a restrikčními enzymy mohl jednoduchým způsobem určit metylační status konkrétního místa v DNA.

XXIX/ 354. Využití metody PLA pro detekci komplexů p53/ p63/ p73 in situ v nádorových buňkách a nádorové tkáni

Hrabal V., Nekulová M., Nenutil R., Holčáková J., Coates P., Vojtěšek B.

RECAMO, MOÚ, Brno

Východiska: PLA (proximity ligation assay) je metoda umožňující detekovat protein-proteinové interakce in situ přímo v buňce nebo tkáni. Její hlavní výhodou je vysoká citlivost a specificita, umožňující detekovat, lokalizovat a kvantifikovat proteinové komplexy s vysokým rozlišením až jednotlivých molekul. Jedním z mechanizmů „gain of function“ mutovaného p53 je tvorba komplexů s dalšími členy proteinové rodiny p53 –  p63 a p73. Tyto interakce pak mají přímý vliv na chemosenzitivitu nádorových buněk a jejich invazivní potenciál, a proto jsou komplexy p53/ p63/ p73 nadějným cílem protinádorové terapie. Cílem této práce je prokázat existenci komplexů p53/ p63/ p73 in situ v nádorových buňkách a v nádorové tkáni na parafinových řezech s využitím metody PLA. Materiál a metody: Pro detekci izoforem p63 a p73 byly na našem pracovišti charakterizovány unikátní specifické protilátky. Proteinové komplexy byly detekovány metodou PLA ve stabilních buněčných liniích SVK14, HCC1806 a FaDu a na parafinových řezech z tkáně kolorektálního karcinomu. Buněčné linie byly zpracovány do parafinových bloků, aby je bylo možné využít jako model pro optimalizaci protokolu pro barvení tkáňových řezů. Výsledky: V buňkách SVK14 exprimujících virový T antigen jsme metodou PLA detekovali komplex p53/ T antigen a ΔNp63/ T antigen. Interakci izoforem ΔNp63 a TAp73 jsme zaznamenali v linii HCC1806 s endogenní expresí těchto proteinů. V linii FaDu byl lokalizován komplex mut-p53/ TAp73, ne však mut-p53/ ΔNp63. Přímo v nádorové tkáni kolorektálního karcinomu se podařilo detekovat tetramer mutovaného p53. Závěr: V rámci vývoje metody PLA pro detekci komplexů proteinů z rodiny p53 jsme v nádorových buněčných liniích detekovali komplexy p53 a p63 s T antigenem, komplexy mutovaného p53 a ΔNp63 s nádorovým supresorem TAp73 a na parafinových řezech kolorektálního karcinomu tetramery p53. Další vývoj metody bude směřovat k detekci komplexů p53/ p63, p53/ p73 a p63/ p73 v nádorové tkáni a testování možnosti využití PLA pro screening látek blokujících tvorbu těchto komplexů.

Práce byla podpořena projektem MŠMT –  NPU I –  LO1413.

XXIX/ 355. Změny v biomechanických vlastnostech buněk jako slibný marker epiteliálně-mezenchymální tranzice u nádorů v oblasti hlavy a krku (pilotní studie)

Svobodová M.¹, Raudenská M.¹, Kratochvílová M.¹, Peltanová B.¹, Polanská H.¹, Přibyl J.², Balvan J.¹, Gumulec J.¹, Kostřica R.³, Masařík M.¹

¹ Masarykova univerzita, Brno, ² CEITEC –  Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ³ Klinika otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku LF MU a FN u sv. Anny v Brně

Důležitou součástí procesů kancerogeneze je schopnost nádorových buněk šířit se organizmem a tvořit metastázy. Vznik invazivních vlastností u nádorových buněk podporuje proces epiteliálně-mezenchymální tranzice (EMT). Během EMT ztrácí nádorová buňka původní epiteliální charakter (nízká motilita, silné vazby na ostatní buňky) a získává znaky mezenchymálních buněk (zvýšená motilita, slabé mezibuněčné kontakty, exprese CD90). V recentních výzkumech bylo prokázáno, že změny v buněčné tuhosti jsou slibným ukazatelem EMT a potažmo metastatické kapacity buněk. Zvýšená exprese CD90 byla u spinocelulárních karcinomů v oblasti hlavy a krku (HNSCC) asociována s procesem EMT, s přítomností fibroblastů asociovaných s nádorem (CAFs) a přítomností mezenchymálních kmenových buněk. V této studii jsme z nádorové tkáně HNSCC pacientů separovali buňky exprimující CD90 a testovali jsme hypotézu, že míra jejich buněčné tuhosti bude v asociaci se schopnostmi těchto nádorů tvořit metastázy v oblasti lymfatických uzlin. Z nádorových tkání HNSCC pacientů byly vytvořeny primární buněčné kultury. Využita byla mechanická disagregace a následné enzymatické působení trypsinu. Poté byly ze vzorku vyseparovány CD90⁺ buňky pomocí magnetické separační sady MiniMACS™ Starting Kit (CD90 MicroBeads-human, Miltenyi Biotec). Úspěšná separace subpopulací byla ověřena fluorescenčním barvením (CD90-APC). Tuhost CD90⁺ buněk byla analyzována pomocí mikroskopie atomárních sil (AFM). Youngův modulus buněčné tuhosti byl vypočítán pomocí Hertzian‑Sneddonova modelu. Buněčná tuhost CD90⁺ buněk získaných z nádorů od HNSCC pacientů se stadiem zasažení lymfatických uzlin N2– 3 byla signifikantně nižší než tuhost buněk získaných od HNSCC pacientů se stadiem zasažení lymfatických uzlin N0– 1. Naše výsledky ukazují, že snížení průměrné tuhosti CD90⁺ buněk obsažených v nádorové tkáni (důsledek zvýšení EMT) by mohlo být slibným prediktorem metastatického potenciálu buněk konkrétního nádoru.

Práce byla podpořena projekty MZ ČR –  16-29835A, GA ČR –  GA16-12454S a MUNI/ A/ 1401/ 2016.

XXIX/ 356. Mezenchymální buňky vykazující charakteristiky nádorově asociovaných fibroblastů v glioblastomech a jejich vliv na migraci endoteliálních a gliálních buněk

Bušek P.¹, Balážiová E.¹, Stollinová Šromová L.¹, Výmola P.¹, Vlašicová K.¹, Tomáš R.², Kramář F.³, Šedo A.¹

¹ 1. LF UK v Praze, ² Nemocnice na Homolce, Praha, ³ Ústřední vojenská nemocnice Praha

Východiska: Glioblastomy (GBM) jsou v dospělosti nejčastější maligní primární mozkové nádory. Vyznačující se infiltrativním růstem a intenzivní neovaskularizací. Tyto faktory spolu s radio- a chemorezistencí přispívají k velmi špatné prognóze pacientů. V procesech invazivního růstu a angiogeneze hrají důležitou roli buněčné interakce v rámci nádorového mikroprostředí. Fibroblastový aktivační protein (FAP, seprasa) je proteáza typicky exprimovaná na nádorově asociovaných fibroblastech karcinomů. Naše předchozí práce prokázaly zvýšenou expresi FAP u GBM a jeho přítomnost v nádorových, ale i stromálních buňkách. Cílem této práce byla izolace a charakterizace FAP+ stromálních buněk GBM a určení jejich vlivu na buňky endoteliální a gliomové. Materiál a metody: Exprese FAP, gliálních (GFAP), endoteliálních (von Willebrandův faktor) a mezenchymálních (smooth muscle actin (SMA), TEM-1, TE-7) markerů byla studována v bioptickém materiálu pomocí imunohistochemie. FAP+ buňky byly izolovány z mechanicky a enzymaticky rozdisociované nádorové tkáně pomocí imunomagnetické separace, propagovány v pericytárním mediu a charakterizovány imunocytochemicky. Byla připravena kondiciovaná media a migrační experimenty byly provedeny s využitím tkáňových insertů (transwell assay). Výsledky: V bioptickém materiálu pacientů s glioblastomy jsou přítomny perivaskulárně lokalizované FAP+ buňky typicky exprimující mezenchymální markery SMA, TEM-1 a antigen fibroblastů detekovaný pomocí protilátky TE-7. S použitím imunomagnetické separace se z řady glioblastomů podařilo izolovat FAP+ primokultury. Tyto primokultury propagované v pericytárním mediu si zachovaly expresi typických mezenchymálních markerů vč. fibroblastového markeru TE-7. Exprese gliálních markerů a markerů endotelových buněk byla nízká, což svědčí pro mezenchymální původ těchto kultur. S použitím kondiciovaných medií jsme prokázali, že tyto mezenchymální kultury jsou chemotakticky atrahovány k buňkám endoteliálním a zároveň zvyšují migraci endoteliálních buněk. Kondiciovaná média z těchto primokultur dále chemotakticky podporují migraci gliomových linií U87 a U251 a mírně zvyšují jejich růst. Závěr: Naše výsledky prokazují humorálně zprostředkovanou vícesměrnou interakci mezi subpopulacemi buněk v lidských glioblastomech, které se účastní FAP+ mezenchymální buňky stomatu. Faktory produkované těmito buňkami, analogickými s nádorově asociovanými fibroblasty známými z karcinomů, mohou přispívat k invazivnímu růstu a neoangiogenezi glioblastomů.

Podpořeno granty AZV 15-31379A, SVV 260264, Progres Q28 a 2015064 LM EATRIS.

XXIX/ 357. Charakterizace buněčných linií kolorektálního karcinomu se sníženou hladinou proteinu AGR2

Jiráková L.¹, Ondroušková E.², Hrstka R.²

¹ Masarykova univerzita, Brno, ² RECAMO, MOÚ, Brno

Východiska: U kolorektálního karcinomu (CRC) je snížená hladina proteinu Anterior Gradient 2 (AGR2) spojena s horší prognózou. Protein AGR2 se v buňce obvykle nachází v endoplazmatickém retikulu, kde se účastní procesu sbalování proteinů, např. mucinů. Současně také tento protein může působit parakrinně či autokrinně, neboť bývá z buněk často aktivně sekretován. U některých typů nádorů působí jako proto-onkogen podílející se na regulaci proliferace, migrace a adheze buněk. Molekulární mechanizmy vedoucí ke snížení jeho hladiny u CRC, ani s tím spojené důsledky prozatím nebyly popsány. Materiál a metody: Metodou CRISPR-Cas9 byl v buněčných liniích DLD-1 a HT-29 odvozených z CRC „knock-outován“ gen agr2. V klonech s nulovou hladinou funkčního proteinu AGR2 byla pomocí sekvenace ověřena přítomnost mutací v kódující sekvenci agr2. Rychlost proliferace a schopnost adheze byly stanoveny metodou krystalové violeti. Rezistence k běžně používaným chemoterapeutikům (oxaliplatina, 5-fluorouracil) byly stanoveny MTT testem. Výsledky: U DLD-1 (vysoká hladina AGR2) byl pozorován signifikantní pokles adheze a rychlosti proliferace v důsledku umlčení exprese AGR2. Výsledky MTT testu ukázaly zvýšení citlivosti AGR2 CRISPR klonů linie DLD-1 u nižších koncentrací léčiv v 72hodinovém intervalu. U linie HT-29 (nižší hladina AGR2 ve srovnání s DLD-1) nebyla pozorována změna mezi kontrolními buňkami a AGR2 CRISPR klony. Závěr: Naše výsledky prokázaly vliv proteinu AGR2 na rychlost proliferace, adhezivitu a rezistenci k chemoterapeutikům u testovaných linií CRC. Experimenty také ukázaly rozdílnou odpověď u testovaných buněčných linií v závislosti na původní hladině proteinu AGR2. Je třeba však vzít v potaz také genetické pozadí daného nádoru, které hraje významnou roli ve výsledném chování studovaných nádorových buněčných linií.

Práce byla podpořena grantovým projektem GA CR 13-00956S a MZ ČR –  RVO (MOÚ, 00209805).

XXIX/ 358. Nothobranchius furzeri jako nový model pro studium karcinomu ledvin

Součková K.¹, Blažek R.², Hermanová M.³, Reichard M.⁴, Slabý O.¹

¹ CEITEC –  Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ² Ústav biologie obratlovců AV ČR, v.v.i., Brno, ³ I. patologicko-anatomický ústav, LF MU a FN u sv. Anny v Brně, ⁴ Ústav biologie obratlovců AV ČR, v.v.i., Brno

Renální karcinom (RCC) je nejčastějším primárním nádorem ledvin a třetí nejčastější příčinou úmrtí na urologické malignity v ČR. Jeho incidence u nás zaujímá první příčky na seznamu sledovaných zemí světa. Halančík furzerův (Nothobranchius furzeri) je extrémně krátkověký druh ryby s anuálním životním cyklem. Obývá dočasné tůně afrických savan Mosambiku a Zimbabwe. Lze ho chovat v zajetí, kde jeho životní cyklus dosahuje délky 4– 12 měsíců. Výhoda nejkratšího životního cyklu mezi modelovými obratlovci a známá sekvence genomu přispěly k faktu, že se z halančíků během několika let stal atraktivní model pro studium stárnutí. Nadprůměrně častý výskyt věkově podmíněných malignit, které jsou u ryb spíše výjimkou, společně s extrémně krátkým životním cyklem nás inspiroval k provedení pilotní metodické studie. Cílem bylo zavést metodiku extrakce tkáně hlavových ledvin halančíka, techniku přípravy tkáně na histopatologické vyšetření a metodiku izolace nukleových kyselin v dostatečném množství a kvalitě. Ledviny 30 jedinců druhu Nothobranchius furzeri byly histopatologicky posouzeny. Ve třetině případů jsme detekovali nodulární nádorové infiltráty od drobných po rozsáhlejší, splývající nádory. Z kontrolních a maligních tkání hlavových ledvin se nám opakovaně podařilo vyizolovat nukleové kyseliny v množství a kvalitě požadované pro následnou molekulárně-biologickou analýzu. Následovala expresní analýza čtveřice mikroRNA, jejichž změny byly popsány u lidského RCC (miR-21, miR-210, miR-30a-5p a miR-200a). Výsledky pilotní studie jsou prvním krokem v řešení projektu, jehož cílem je zachytit a popsat charakteristické změny na úrovni DNA, které provázejí maligní transformaci hlavových ledvin u halančíka.

Tento výzkum byl finančně podpořen Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy ČR v rámci projektu CEITEC 2020 (LQ1601), projektem RVO (MOÚ, 00209805) a z programového projektu Ministerstva zdravotnictví ČR s reg. č. AZV č. 16-33209A, 15-33158A a 15-31627A.

XXIX/ 359. Testování septinu 9 u kolorektálního karcinomu kitem epiprocolon

Staněk L.¹, Mihlová R.², Šlégrová S.², Štika J.², Fridrichová K.³

¹ Onkologická klinika 1. LF UK a VFN v Praze, ² Synlab czech, s.r.o., Praha, ³ PentaGen, s.r.o., Kladno

Zhoubné novotvary tlustého střeva a konečníku (CRC) patří k nejčastějším nádorovým onemocněním ve světové populaci. Světová incidence byla pro rok 2012 odhadnuta celkem 1 360 602 nově diagnostikovaných případů. V ČR je u obou pohlaví zhoubný nádor kolorekta druhou nejčastější onkologickou diagnózou po karcinomu prostaty u mužů a po karcinomu prsu u žen s více než 8 000 případy ročně. Až ve 25– 30 % případů bývá v době stanovení primárního nádoru ve střevě již zjistitelné metastatické postižení jater a méně často i jiných orgánů, u dalších 35 % se metastázy vyvinou v pozdějším období. Jedná se tedy o velmi početnou skupinu nemocných, u které potřebujeme znát primární diagnózu co nejdříve. CRC může být léčitelný až v 90 % případů, pokud je včas diagnostikovaný a pokud je stále ještě lokalizovaný. Přesto je tato vážná nemoc jednou z nejčastějších příčin úmrtí spojeného s nádory ve vyspělých zemích. Zhoubné nádory jsou z molekulárního hlediska nesmírně heterogenní. O to více to platí o kolorektálním karcinomu. Je známa celá řada molekulárních změn, které lze využít k časné diagnostice CRC. Proto byl firmou Epigenomics vyvinut vysoce citlivý test EpiProColon, který umožňuje detekci prostřednictvím analýzy metylace genu Septin9. Principem testu je bisulfitická konverze genu následovaná real time PCR detekcí. Na rozdíl od testů okultního krvácení ve stolici má test vyšší citlivost, která je navíc nezávislá na lokalizaci karcinomu. Cytozinová rezidua v oblasti v2 genu Septin9 jsou metylována ve tkáni s CRC, ale nikoli ve zdravé sliznici tračníku. Společnost Synlab Czech ve spolupráci s firmou PentaGen tuto metodu detekce CRC zavedla a provádí ze vzorku krve, což je pro pacienta jednodušší, rychlejší a pohodlnější než ostatní dostupná vyšetření. Pilotní studie byla provedena na kohortě 10 pacientů ve věku 28– 62 let (medián 46 let), výběr pacientů byl proveden tak, aby zahrnoval jak případy bez klinických projevů, se zátěží v podobě Crohnovy choroby a skupiny pozitivní na test okultního krvácení ve stolici. U všech pacientů byl negativní nález a přítomnost metylovaného genu nebyla prokázána. Díky tomuto testu byla navíc vyloučena falešná pozitivita při použití testu na okultní krvácení. Závěrem lze říci, že test EpiProColon se v DNA diagnostice při řádném zavedení a důsledném dodržování uživatelské příručky jeví jako velice přínosný pro laboratorní praxi. Klíčové body, kde může nastat chyba, je preanalytická fáze, vstupní množství odebrané krve, které by mělo být 30 ml a izolace DNA.

XXIX/ 360. Efekt exogenní suplementace sarkosinem na proteom nemaligních, maligních a metastatických buněk prostaty

Strmiska V., Michálek P., Guráň R., Zítka O., Adam V., Heger Z.

Mendelova univerzita v Brně

Východiska: Sarkosin je onkometabolit, jehož koncentrace je zvýšena při progresi a proliferaci prostatických buněk a roste s jejich invazivitou [1]. Jeho přítomnost také výrazně ovlivňuje expresi genů spojených s kontrolou buněčného cyklu a apoptózou [2]. I přes to, že lze očekávat podobný efekt i na proteinové úrovni, není jeho vliv na proteom prostatických buněk znám. Jednou z velmi efektivních metod kvantitativní analýzy buněčného proteomu je dvoudimenzionální diferenční gelová elektroforéze (2D-DIGE) kombinovaná s hmotnostní spektrometrií (MS). Cílem této práce bylo provést exogenní suplementaci vybraných prostatických buněčných linií (nemaligní PNT1A, maligní 22Rv1 a metastatické LNCaP a PC-3) sarkosinem s následnou 2D-DIGE a MS analýzou identifikovat změny v proteomu těchto linií, a tím získat detailnější náhled na možnou roli sarkosinu v nádorech prostaty. Materiál a metody: Prostatické buňky byly preinkubovány v médiu s klinicky relevantní koncentrací sarkosinu (10 μM) po dobu 24 a 48 hod. Extrahované proteiny byly po izoelektrické fokusaci (IPG: 7 cm, pH 3– 10) separovány pomocí 2D-DIGE (CyDyes (Cy2, Cy3 a Cy5), Lumiprobe, USA). Diferenčně exprimované spoty byly dále denzitometricky analyzovány pomocí Azure c600 (Azure Biosystems, USA), trypsinovány a identifikovány pomocí MALDI-TOF (Bruker, Německo). Výsledky: S výjimkou nemaligní linie (PNT1A) vykazovaly maligní i metastatické buňky (nezávisle na expresi androgenního receptoru) po suplementaci sarkosinem významně (p < 0,05) zvýšenou expresi v proteinovém spotu s přibližným pI 4,1 a velikostí 15 kDa, jenž byl identifikován jako kalmodulin. Ostatní proteiny byly sarkosinem stimulovány nebo inhibovány pouze nevýznamně. Kalmodulin je velmi významným efektorem ve vnitrobuněčné signalizaci, a proto bude jeho souvislost s hladinou sarkosinu dále zkoumána. Závěr: Sarkosin je důležitým onkometabolitem nádorů prostaty. Naše studie prokázala, že je schopen stimulovat expresi kalmodulinu, který se účastní vnitrobuněčné signalizace. Jeho role a hladina u nádorů prostaty bude dále studována na klinických vzorcích.

Literatura: [1] Sreekumar A et al. Nature 2009; 457(7231): 910– 914. [2] Heger Z et al. PLoS One 2016; 11(11): e0165830.

Práce byla podpořena grantovým projektem GA ČR 16-18917S.

XXIX/ 361. Měření biomechanických vlastností prostatických nádorových buněk s využitím mikroskopie atomárních sil

Štěpka P.¹, Kratochvílová M.¹, Raudenská M.¹, Přibyl J.², Polanská H.¹, Fojtů M.¹, Gumulec J.¹, Masařík M.¹

¹ LF MU, Brno, ² CEITEC –  Středoevropský technologický institut, MU, Brno

Mikroskopie atomárních sil (AFM) je trojrozměrná topografická mikroskopie s vysokým rozlišením vhodná pro biologické aplikace v nativních podmínkách. AFM je přínosná zejména pro měření biomechanických vlastností buněk (buněčná tuhost a její rozložení v buňce, elasticita, výškový profil). V několika studiích bylo prokázáno, že buněčná tuhost může sloužit jako ukazatel progrese nádorového onemocnění a rovněž metastatického potenciálu buněk. Změny v buněčném cytoskeletu v průběhu kancerogeneze jsou totiž reflektovány změnami tuhosti buněk. V této studii jsme se zaměřili na změny biomechanických vlastností buněk u různých stadií nádoru prostaty. Jako model jsme využili čtyři prostatické buněčné linie (PNT1A –  model zdravé tkáně, 22Rv1 –  linie odvozená z primárního nádoru prostaty, LNCaP –  odvozena z androgen-senzitivní metastázy v lymfatické uzlině a PC-3 –  odvozena z kostní metastázy nezávislé na androgenech). K měření AFM byl využit mikroskop JPK NanoWizard 3 (JPK, Berlin, Germany). Měření AFM bylo prováděno při 37 °C ve zvlhčené atmosféře (60%) inkubátoru s 5% CO₂ v pulzním režimu s frekvencí 1 Hz a rychlostí 2 µm/ s. Viabilita buněk před měřením byla zkontrolována mikroskopicky. Buňky byly kultivovány ve standardním médiu pro ně určeném. 22Rv1 buňky (primární nádor) vykazovaly nejnižší hodnoty Youngova modulu (E), který lze definovat jako poměr napětí a jím vyvolané deformace. Průměrná hodnota E byla pro linii PC-3 1,21 kPa, pro linii PNT1A 1,15 kPa, pro linii 22Rv1 0,67 kPa a pro linii LNCaP 0,99 kPa. Na základě měření tuhosti buněk byly odlišitelné buňky primárního nádoru od buněk metastatických a benigních. Na androgenech závislá linie LNCaP vykazovala jako jediná signifikantně vyšší tuhost jádra oproti okrajům buněk. Metastatické buňky byly výrazně plošší než buňky primárního nádoru či buňky benigní.

Práce byla podpořena projekty MUNI/ A/ 1355/ 201 a IRP 2016-ROZV/ 24/ LF/ 16 (Martina Raudenská).

XXIX/ 362. Změny aminokyselinového profilu nádorových buněk v souvislosti s progresí karcinomu prostaty a posouzení vlivu akumulace zinečnatých iontů

Kratochvílová M.¹, Raudenská M.1, Heger Z.², Richtera L.¹, Masařík M.¹, Gumulec J.¹, Nováková M.¹

¹ Masarykova univerzita, Brno, ² Mendelova univerzita v Brně

Karcinom prostaty je unikátní nejenom svým vztahem k zinečnatým iontům, ale také změnami v intermediálním metabolizmu. Karcinom prostaty má oproti zdravé prostatické tkáni plně funkční citrátový cyklus (TCA) a získává tak významně více energie. S funkčním TCA cyklem souvisí také často odlišný metabolizmus aminokyselin. Obecně mají nádorové buňky vyšší energetické nároky a také zvýšenou syntézu látek nutných pro dělení buněk. V této práci byl stanoven rozdíl v obsahu vybraných aminokyselin (aspartátu, cysteinu a methioninu) na modelu tří prostatických buněčných linií s odlišným charakterem ve vztahu k postupu onemocnění. Dále byl zkoumán vliv akumulace zinečnatých iontů na hladiny aminokyselin v buňkách. Pro experimenty byly použity prostatické buněčné linie PNT1A, 22Rv1 a PC-3 odvozené ze zdravé tkáně prostaty, primárního karcinomu a kostní metastázy a jejich protějšky kultivované dlouhodobě v přítomnosti zinečnatých iontů. Aminokyseliny byly stanoveny pomocí ionexové kapalinové chromatografie. Spolu s progresí nádorového onemocnění, tedy u modelových buněk s agresivnějšími vlastnostmi docházelo ke zvýšení poměru cysteinu k methioninu. Zároveň byl akumulován aspartát. Methionin je spolu s dalšími esenciálními aminokyselinami využíván k syntéze aspartátu. Aspartát je u zdravých prostatických buněk esenciální, ale nádorové si jej dokáží syntetizovat. To je u dělících se buněk znakem aktivní respirace a snahy udržet dostatek redukovaného NADH z glykolýzy. V nádorových buňkách docházelo k akumulaci cysteinu a snížení obsahu methioninu také po dlouhodobém působení zinku. Cystein je obsažen ve zvýšené míře v metalothioneinu, jehož produkce byla také zvýšená a methionin je esenciální aminokyselinou, která je nutná např. pro produkci GSH. Zinečnaté ionty tedy působily posun vlastností buněk k agresivnějšímu metabolizmu. Celkově by poměr cysteinu a methioninu v nádorových buňkách mohl být významným markerem maligního metabolizmu.

Práce byla podpořena projektem GA ČR 16-18917S a MUNI/ A/ 1355/ 2016.

XXIX/ 363. Povrchové modifikace rutheniových nanočástic polymery a vliv na kinetiku uvolňování a cytotoxicitu doxorubicinu

Buchtelová H., Strmiska V., Dostálová S., Michálek P., Křížková S., Kopel P., Adam V., Heger Z.

Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta Mendelovy univerzity v Brně

Východiska: V posledních letech je intenzivně studováno uplatnění nanomateriálů v cílené protinádorové léčbě [1], kde lze s jejich využitím zvýšit terapeutický index léčiva a snížit jeho nežádoucí necílovou toxicitu [2]. Ruthenium patří mezi vzácné kovy a díky své struktuře má mnoho příznivých vlastností využitelných v terapii a diagnostice nádorových onemocnění [3]. Komplexy ruthenia se vyznačují vysokou selektivitou a menšími nežádoucími účinky ve srovnání s platinovými komplexy [4]. Práce byla zaměřena na přípravu a testování hybridních nanočástic na bázi ruthenia s polymerní modifikací pro cílený transport doxorubicinu (Dox) s možností využití v magnetické rezonanci. Materiál a metody: Rutheniové nanočástice byly modifikovány polyvinylpyrolidonem (PVP) a polyoxyetylenstearátem (POES) a komplexovány s Dox pomocí ultrasonikace. Výsledné částice (RuPDox) byly charakterizovány pomocí FTIR a DLS. Kinetika uvolňování Dox byla testována v pufrech imitujících intracelulární prostředí, plazmu a kyselé prostředí endozomů či hypoxie. Toxicita (MTT) a vliv na klonogenicitu byly testovány na buňkách karcinomu vaječníku (A2780). Výsledky: Nejvyšší stabilitu a návratnost vazby Dox bylo docíleno využitím 20% POES, kdy došlo ke vzniku nanočástic o velikosti přibližně 300 nm. Hodnoty 24IC50 byly 0,98 μg/ ml pro RuPDox a 7,81 pro Dox. Stejný efekt byl pozorován i v rámci klonogenicity buněk. Nejvyššího uvolnění Dox bylo dosaženo v kyselém prostředí (až 60% po 2 hod). V ostatních prostředích bylo dosaženo max. 20% uvolnění léčiva, což indikuje výjimečnou stabilitu nanočástic v necílovém prostředí a jejich vhodnost pro další testování in vivo. Závěr: Byly připraveny rutheniové nanočástice modifikované PVP a POES s navázaným Dox. Takto vytvořený komplex je stabilní po více jak 24 hod, vykazuje výhodnou kinetiku uvolňování léčiva a zvyšuje účinek Dox in vitro.

Literatura: [1] Nie S et al. Annu Rev Biomed Eng 2007; 9: 257– 288. [2] Mohanraj VJ et al. Trop J Pharm Res 2006; 5(1): 561– 573. [3] Mjos KD et al. Chem Rev 2014; 114(8): 4540– 4563. [4] Allardyce CS et al. Platinum Metals Review 2001; 45(2): 62– 69.

Práce byla podpořena grantovým projektem AZV MTCYTO (15-28334A).

XXIX/ 364. Termálně syntetizované zlaté nanočástice s peroxidázovou aktivitou pro značení sarkosinu

Ruttkay-Nedecký B.¹, Dočekalová M.², Uhlířová D.², Staňková M.², Kepinská M.³, Kizek R.¹

¹ Centrální laboratoře, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, ² Prevention Medicals s.r.o., Studénka, ³ Ústav biomedicínských a environmentálních analýz, Wroclaw Medical University, Polsko

Východiska: Karcinom prostaty je nejčastější zhoubné nádorové onemocnění mužů s výraznými geografickými rozdíly, vč. nárůstu jeho incidence s věkem. Pro rychlou diagnostiku jsou hledány vhodné nádorové markery. Velmi slibnou kandidátní molekulou je aminokyselina sarkosin. Zlaté nanočástice (AuNPs) jsou používány v nanomedicíně a vykazují pseudo-enzymatickou aktivitu. Cílem této práce bylo navrhnout vysoce senzitivní detekční systém pro sarkosin. Materiál a metody: Termální syntéza AuNPs probíhala na magnetické míchačce s ohřevem za kontrolované teploty a míchání po dobu 60 min. Nanočástice byly modifikovány citrátem. Získané nanočástice byly charakterizovány pomocí ZetaSizeru, spektrofotometru, fluorimetru a elektrochemie. Konjugace zlatých nanočástic se sarkosinem probíhala při stálém míchání v prostředí borátového pufru (pH 8,8) při 37 °C 90 min. Výsledky: Příprava zlatých nanočástic vychází z Tukevich metody. AuNPs byly připravovány za různých teplot (20, 40, 60, 80, a 100 °C) a charakterizovány dostupnými fyzikálně-chemickými metodami (velikost 17– 37 nm, zeta potenciál – 32 až – 44 mV; absorpční maximum bylo zaznamenáno při 529 nm). Hodnocení peroxidázové aktivity AuNPs bylo normalizováno na aktivitu křenové peroxidázy (HRP) a substrátu. U sledovaných AuNPs byla peroxidázová aktivita v rozmezí 0,8– 1 mU/ ml. U AuNPs konjugovaných sarkosinem (AuNPs-Sar) byla provedena zkouška peroxidázové aktivity se substrátem 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidinem (TMB). Detekce sarkosinu byla uskutečněna dvěma různými postupy (s přímým navázáním AuNPs-Sar na destičku a s navázáním AuNPs-Sar pomocí slepičích antisarkosinových protilátek). Peroxidázová aktivita byla sledována jako katalytická oxidace substrátu TMB a hodnoty absorbance se odečítaly při vlnové délce 620 nm. Závěr: Navrženým postupem bylo možné detekovat sarkosin v subnanomolárních koncentracích.

Práce byla realizována jako součást cílů v The European Technology Platform for Nanomedicine (Development of a simple test for detection of sarcosine in urine).

XXIX/ 365. Zinečnatými ionty modifikovaný nanotransportér antracyklinových antibiotik pro cílenou terapii nádoru prsu

Skaličková S.¹, Gargulák M.², Löffelmann M.², Ruttkay-Nedecký B.², Kepinská M.³, Parák T.¹, Kizek R.^1– 3

¹ Ústav humánní farmakologie a toxikologie, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, ² Centrální laboratoře, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, ³ Ústav biomedicínských a environmentálních analýz, Wroclaw Medical University, Polsko

Východiska: V popředí zájmu nanomedicíny je nanotechnologická úprava antracyklinových antibiotik, která se často využívají v protinádorové léčbě hematologických malignit a solidních nádorů. Chitosanové nanočástice získávají více pozornosti v oblasti cíleného transportu léčiv díky své stabilitě, nízké toxicitě a jednoduché přípravě. Cílem práce bylo navrhnout chitosanový nanotransportér antracyklinového antibiotika s modifikací povrchu zinkem, pro specifickou interakci s metalothioneinem (MT). Materiál a metody: Chitosanové nanočástice s enkapsulovaným doxorubicinem byly připraveny rozpuštěním 5 g chitosanu v 3% kyselině octové a TPP (0,25 % w/ v) a doxorubicinem (0,5 mg/ ml). Fe₂O₃-NPs byly připraveny redukcí s borohydridem a amoniakem. Poté byly připraveny Fe₂O₃-AuNPs termální syntézou. Množství doxorubicinu a Zn²⁺ bylo určeno pomocí DPV. Výsledky: V experimentu byl navržen a následně studován biofyzikálními metodami chitosanový nanotransportér antracyklinových antibiotik (CHIT-Zn-DOXO-Fe₂O₃-AuNPs). Uvnitř vytvořené nanometrické struktury je elektrostaticky navázán doxorubicin (o koncentraci kolem 10 µm, CHIT-DOXO). Navíc chitosan je molekula bohatá na cystein a díky svým volným sulfhydrylovým skupinám je schopen vázat ionty zinku. Této vlastnosti jsme se rozhodli využít v konstrukci nanotransportéru pro jeho cílené směřování k nádorové tkáni (CHIT-Zn-DOXO). V řadě našich předchozích experimentů jsme ukázali výrazné vzestupy hladiny MT ve zhoubných nádorech. MT do svých domén váže ionty těžkých kovů (přirozeně ionty zinku), a tak udržuje jejich homeostázu v organizmu. Proto jsme se v další části experimentu rozhodli sledovat schopnost modifikovaných chitosanových nanočástic (100 mg/ ml, (CHIT-Zn-DOXO) vázat se k proteinu MT (magnetické zlaté nanočástice byly modifikovány MT, 100 µg/ ml, Fe₂O₃-AuNPs). Efektivita vazby chitosanové nanočástice modifikovaná zinečnatými ionty (CHIT-Zn-DOXO) k MT (CHIT-Zn-DOXO-Fe₂O₃-AuNPs-MT) vzrostla o více než 30 % v porovnání s nemodifikovanou nanočásticí (CHIT-DOXO). Závěr: Předpokládáme, že nový nanotransportér je specifický svojí bio­dostupností, zvýšeným vychytáváním léčiva z krevního řečiště v místě nádorové tkáně a nízkou toxicitou pro necílové tkáně.

Práce byla realizována za podpory projektu NANODRUGS 328/ 2017/ FaF a The European Technology Platform for Nanomedicine.

XXIX/ 366. Fullerenový nanotransportér doxorubicinu pro cílenou interakci s mutovaným genem BRCA2

Skaličková S.¹, Löffelmann M.², Gargulák M.², Dočekalová M.², Ruttkay-Nedecký B.², Suchý P.¹, Kepinská M.³, Kizek R.^1– 3

¹ Ústav humánní farmakologie a toxikologie, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, ² Centrální laboratoře, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, ³ Ústav biomedicínských a environmentálních analýz, Wroclaw Medical University, Polsko

Východiska: Zhoubné nádory prsu jsou v rozvinutých zemích nejčastějším nádorovým onemocněním, postihující převážně ženy. Odhaduje se, že přibližně 5– 10 % karcinomů prsu je podmíněno rodinnou genetickou zátěží, způsobenou mutací genu BRCA2. Při léčbě je často používaným terapeutikem doxorubicin. Přes svou terapeutickou účinnost však vykazuje vysokou kardiotoxicitu. Možnost, jak zvýšit terapeutické okno, představují nanotransportéry. Fullereny jsou nanočástice tvořené atomy uhlíku jejichž fyzikálně chemické vlastnosti jim udávají vysokou stabilitu. Komplex fullerenu a doxorubicinu (DOXO) umožňuje cílenou metodu léčby. Cílem této práce je vyvinout nanotransportérový systém s předpokládaným účinkem cytostatika bez výrazných toxických efektů. Materiál a metody: K 5 mg fullerenu bylo přidáno 0,5 ml destilované vody a roztok byl následně vložen na 30 min do ultrazvukové lázně (50 W). Fullereny s navázaným DOXO byly purifikovány od nenavázaného DOXO pomocí centrifugace (16 000 g). Pro analýzu DOXO byl použit acetátový pufr. Fe₂O₃-NPs byly připraveny redukcí s borohydridem a amoniakem. Poté byly připravené Fe₂O₃-AuNPs termální syntézou. Výsledky: Byl navržen a následně studován biofyzikálními metodami uhlíkový nanotransportér (fulleren) pro vazbu doxorubicinu (FULLER-DOXO). Zjistili jsme, že velikost FULLER-DOXO je větší než 100 nm a zeta potenciál se pohybuje kolem 24 mV. DOXO interaguje s FULLER elektrostatickou interakcí a jeho množství se zvyšuje s aplikovanou koncentrací (R2 = 0,96). V následujícím experimentu byl FULLER-DOXO modifikován oligodeoxynukleotidem (ODN; 10 µg/ ml), a byl tak vytvořen komplex FULLER-DOXO-ODN1. Vázaný ODN představuje specifickou sekvenci, pro zacílení komplexu na bodovou mutaci v genu BRCA2. Pro prokázání interakce byla navržena magnetická zlatá nanočástice modifikovaná komplementární sekvencí k testovanému nanotransportéru (ODN2-Fe₂O₃-AuNPs). Vytvořený komplex (FULLER-DOXO-ODN1-ODN2-Fe₂O₃-AuNPs) byl následně potvrzen několika nezávislými technikami. Závěr: Předpokládáme, že navržený nanokonstrukt bude možné využít pro geneticky cílené směřování protinádorového léčiva.

XXIX/ 367. Vliv cisplatiny a karboplatiny na akumulaci mědi a zinku v nádorové tkáni

Polanská H., Kratochvílová M., Fojtů M., Gumulec J., Vaculovič T., Vaculovičová M., Masařík M.

Masarykova univerzita, Brno

Protinádorové látky na bázi platiny jsou používány při léčbě mnoha lidských malignit. Bylo prokázáno, že na transportu platinových léčiv do buněk se podílí transportér mědi (hCtr1) a že platinová léčiva jsou zpětně schopna ovlivňovat expresi genu (SLC31A1), který tento transportér kóduje. Kromě mědi je hCtr1 schopen transportovat i železo a zinek. Regulace exprese hCtr1 pomocí platinových léčiv může být tedy centrálním prvkem homeostázy mědi a zinku. Bylo rovněž popsáno, že podávání zinku může zvýšit účinnost léčby chemoterapeutiky na bázi platiny u některých druhů karcinomů. V této studii jsme se proto zabývali změnami akumulace mědi a zinku v nádorové tkáni v důsledku podání cisplatiny a karboplatiny. Nádory byly indukovány u samců myší kmene NuNu pomocí podkožní aplikace PC-3 buněk (metastatické buňky odvozené z kostní metastázy karcinomu prostaty). Po indukci nádoru byla myším intraperitoneálně podávána karboplatina nebo cisplatina a to 2× týdně po 2 týdny (dávka 2 mg/ kg živé hmotnosti –  cisplatina; 10 mg/ kg živé hmotnosti –  karboplatina). Obsah platiny, zinečnatých a měďnatých iontů v nádoru byl měřen metodou ICP-MS (indukční spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem). Obě cytostatika se dokázala v nádoru akumulovat. Obsah platiny v nádorové tkáni byl signifikantně vyšší než koncentrace platiny u neléčené kontroly. Akumulace platiny v nádoru byla vyšší po podání cisplatiny ve srovnání s karboplatinou. V důsledku léčby karboplatinou docházelo k signifikantní akumulaci mědi a zinku v nádorové tkáni. Tento efekt nebyl pozorován při léčbě cisplatinou.

Práce byla podpořena projekty GA17-12774S, MUNI/ A/ 1355/ 2016 a MUNI/ A/ 1401/ 2016.

XXIX/ 379. Tumorpreventívne účinky klinčeka v modeli karcinómu prsníka

Kubatka P.¹, Uramová S.¹, Kello M.², Kajo K.³, Žúbor P.¹, Mojžiš J.², Lasabová Z.¹, Péč M.¹, Adamkov M.¹, Danko J.¹

¹ Jesseniova lekárska fakulta UK v Martine, ² Lekárska fakulta UPJŠ v Košiciach, ³ Onkologický ústav sv. Alžbety, Bratislava

Ciele: V štúdii bol analyzovaný preventívny účinok klinčeka a jeho mechanizmus účinku v in vivo a in vitro modeli karcinómu prsníka. Metódy: Klinček bol podávaný samiciam potkanov v diéte ve dvoch koncentráciách 0,1 % a 1 % počas 13 týždňov po podaní chemokarcinogénu. Po pitve bola realizovaná histopatologická a imunohistochemická analýza mamárnych karcinómov. Paralelne s animálnou štúdiou prebiehala in vitro štúdia použitím MCF-7 buniek. Výsledky: Klinček spôsobil dávkovo závislý pokles frekvencie nádorov v dvoch liečených skupinách o 47,5 % a 58,5 % v porovnaní s kontrolou. Analýza buniek karcinómov preukázala pokles expresie bcl-2, Ki-67, VEGF, CD24, a CD44, súčasne nárast expresie Bax, kaspázy 3 a ALDH1 v skupine s vyššou dávkou klinčeka. Hladiny MDA poklesli v oboch liečených skupinách. Hodnotenie modifikácií histónov ukázali nárast trimetylácií a acetylácií lyzínu (H4K20me3, H4K16ac) v liečených karcinómoch. Liečba zmenila stupeň metylácie promótora TIMP3 u ostrovčekov CpG3, CpG4, CpG5. Vyššia dávka klinčeka zvýšila celkovú metyláciu promótora RASSF1A (tri CpG miesta). Štúdia in vitro potvrdila antiproliferatívne a proapoptotické účinky extraktu klinčeka u MCF-7 bunkových línií (cytotoxicita, Brdu, bunkový cyklus, annexin V/ PI, kaspáza 7, Bcl-2, mitochondriálny membránový potenciál). Záver: Naša štúdia po prvý krát demonštrovala signifikantné tumorpreventívne účinky klinčeka v modeli karcinómu prsníka.

Štúdia bola podporená projektom VEGA 1/ 0108/ 16.

XXIX/ 380. Význam posttranslačních modifikací histonů v nádorové rezistenci

Eckschlager T., Plch J., Hraběta J., Vícha A.

Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol, Praha

Úvod: Chemorezistence je hlavní důvod selhání protinádorové léčby. Dosud byla rezistence k chemoterapii vysvětlována změnami v genomu klonu nádorových buněk, který nesl určitou mutaci a byl léčbou selektován –  tzv. Darwinovský typ rezistence. Nově popsaný fenomén rychle vzniklé rezistence k cytostatikům svědčí pro dynamickou negenetickou heterogenitu nádorové populace, která kontinuálně produkuje různé fenotypové varianty. Na základě literatury a našich výsledků byl vytvořen in vitro model získané chemorezistence, kdy po krátkodobé kultivaci s extrémní dávkou cytostatika přežila část nádorových buněk. Neuroblastomové buňky UKF-NB4 přežily kultivaci v médiu s vysokou koncentrací VCR (115 × IC50) a DOXO (3 × IC50). U subpopulace buněk přežívající vysokou dávku VCR nebyly metodou SNP/ CHIP Array zaznamenány genetické odchylky od mateřské linie. Pro pochopení vzniku chemorezistence jsme se rozhodli pro analýzu změn posttranslačních modifikací histonu H3, H4 u buněk UKF-NB4 vystavených vysokým koncentracím cytostatika. Cílem bylo studium epigenetické regulace při vzniku chemorezistence pomocí sledování změn v posttranslačních modifikacích. Pochopení posttranslačních modifikací může přispět k efektivnější léčbě nádorů. Metody: Změny v acetylaci jsme detekovali Western Blottem za použití protilátek H3ac, H3K14ac, H4ac a H3 jako nanášecí kontroly. Buňky UKF-NB4 byly kultivovány v médiu s 3 µM VCR 6 a 48 hod. Buňky přeživší 48 hod v médiu s VCR byly kultivovány dalších 48 hod v médiu bez VCR a poté sklizeny. Buňky UKF-NB4 byly kultivovány v médiu s 0,6 µM DOXO 24 a 48 hod. Buňky přeživší 24 a 48 hod v médiu s DOXO byly kultivovány 96 hod v médiu bez DOXO a poté sklizeny. Z takto kultivovaných buněk byly kyselou extrakcí izolovány histony a byla vyšetřena acetylace H3 a H4. Buněčný cyklus jsme hodnotili průtokovou cytometrií po barvení propidium jodidem. Výsledky: Buňky UKF-NB4 vykazovaly po vystavení VCR hypoacetylaci H3 a H4, dále se u nich prokázala zástava v G2/ M fázi. Následná kultivace v médiu bez cytostatika umožnila návrat do fáze G1, S a přeživší buňky proliferovaly, tvořily kolonie a nevykazovaly chemorezistenci. Závěr: U buněk UKF-NB4 inkubovaných s vysokými koncentracemi VCR byla detekována hypoacetylace H3 a H4. Deacetylace histonů souvisí s přestavbou chromatinu do inaktivní podoby. Po působení cytostatika VCR byla u přežívajících buněk pozorována zástava buněčného cyklu ve fázi G2/ M, buňky se vrátily do proliferační fáze během kultivace v médiu bez cytostatika.

Podpořeno AZV MZ ČR 15-28334A.

XXIX/ 383. Včasná detekcia leukémie pomocou aptamérového biosenzora

Poturnayová A.^1,2, Bábelová L.¹, Buríková M.³, Bizík J.^1,3, Leitner M.⁴, Ebner A.⁵, Hianik T.⁶

¹ Centrum biovied SAV, Ústav biochémie a genetiky živočíchov, Ivanka pri Dunaji, ² Katedra jadrovej fyziky a biofyziky, Fakulta matematiky, fyziky a informatiky UK v Bratislave, ³ Biomedicínske centrum SAV, Ústav experimentálnej onkológie, Bratislava, ⁴ Center for Advanced Bioanalysis GmbH, Linz, Austria, ⁵ Institute of Biophysics, Johannes Kepler University Linz, Austria, ⁶ Katedra jadrovej fyziky a biofyziky, Fakulta matematiky, fyziky a informatiky UK v Bratislave

V súčasnej dobe modernej medicíny pokrok a zvýšený záujem o nanoonkológiu spôsobuje revolúciu v diagnostike a terapii nádorových ochorení. Deje sa to najmä vďaka najnovším poznatkom v oblasti výskumu tohto závažného ochorenia a ich aplikácii v bio- a nanotechnológiách. Genomika a včasná diagnostika zohrávajú kľúčovú úlohu vo vývoji cielenej terapie pre väčšinu ľudských nádorov. Nanoonkológia vďaka objavu nových biomarkerov prispieva k vývoju citlivých biosenzorov na detekciu počiatočných štádií ochorenia. Nové diagnostické prístupy schopné zlepšiť presnú detekciu nádorových buniek sú rozhodujúce pri diagnostike rakoviny. Vývoj citlivých biosenzorov na báze DNA aptamérov sa ukazuje ako vhodný nástroj na včasnú detekciu napr. cirkulujúcich nádorových buniek. DNA a RNA aptaméry sú jednovláknové oligonukleotidy, ktoré majú schopnosť vysoko špecifickej afinitnej väzby s rôznymi cieľovými molekulami. V roztoku vytvárajú aptaméry jedinečné 3D štruktúry obsahujúce väzobné miesto pre vybrané molekuly, ako sú napr. onkomarkery na povrchu bunky. Konjugácia aptamérov s nanočasticami vytvára nanomateriál, ktorý by mohol byť používaný nielen ako nový zobrazovací nástroj, ale aj pre kvantifikáciu a zosilnenie detekcie onkomarkerov, napr. v krvných vzorkách. V našej práci sme sa zamerali na vývoj biosensora, ktorého citlivou zložkou bol sgc8 aptamer. Tento aptamér sa špecificky a s vysokou afinitou viaže na povrchové receptory tyrozínkinázy 7 (PTK7) leukemických buniek (Jurkat, Molt-4). PTK7 receptor nie je exprimovaný na zdravých bunkách imunitného systému. Mechanizmy interakcií sgc8 aptamérov s PTK7 sme testovali pomocou moderných metód založených na meraní akustických strižných kmitov (TSM) a jednomolekulovej silovej spektroskopie. Tieto interakcie boli monitorované v reálnom čase a umožňili určenie kinetických väzbových konštánt a sily interakcie medzi aptamérmi a sledovanými receptormi. Kľúčovou úlohou bolo zistenie špecifických a nešpecifických interakcií sgc8 s transmembránovým PTK7 receptorom na povrchu buniek. V spolupráci s JKU Linz sme použili po prvý krát aj metódu topografického rozpoznávacieho zobrazenia (TREC) na určenie síl interakcie medzi aptamérmi a PTK7 na Jurkat bunkách a na zistenie ich povrchového rozdelenia a povrchovej hustoty. Ukázali sme, že sgc8 sa viaže s veľkou pravdepodobnosťou 38,3 ± 7,48 % a selektivitou k PTK receptorom. V prietokovom systéme TSM sa nám podarilo detekovať leukemické bunky s citlivosťou 50– 100 buniek/ ml.

Práca bola podporená agentúrami APVV (APVV-14-0267, SK-AT-2015-0004) a VEGA (2/ 0088/ 17).

XXIX/ 385. Dvouřetězcové zlomy DNA ve výzkumu rakoviny

Falk M.¹, Falková I.¹, Kopečná O.¹, Pagáčová E.¹, Bačíková A.¹, Depeš D.¹, Lukášová E.¹, Masařík M.², Gumulec J.², Horáková Z.³

¹ Radiobiologie a buněčná biologie, Biofyzikální ústav, AV ČR, v.v.i., Brno, ² Ústav patologické fyziologie, LF MU, Brno, ³ Klinika otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku LF MU a FN u sv. Anny v Brně

Radiobiologie v současné době znovu zažívá svůj rozkvět. Děje se tak zejména díky obrovskému metodologickému rozvoji v experimentální oblasti na tomto poli a zároveň díky technologickým a medicínským pokrokům v radioterapii. Pozornost si radiobiologie získala i s ohledem na plánované dlouhodobé vesmírné cesty a bohužel i na riziko jaderných havárií a teroristických útoků. Nejzávažnějšími a zároveň terapeuticky nejdůležitějšími poškozeními DNA indukovanými ionizujícím zářením (a některými chemoterapeutiky) jsou dvouřetězcové zlomy této molekuly (DNA double strand breaks –  DSB). Pokud nejsou DSB správně opraveny, mohou vést k smrti buněk nebo jejich genetickému poškození, stárnutí a nezřídka i nádorové transformaci. Z hlediska rakoviny tak DSB představují dvojsečný meč –  indukce DSB je doposud nejúčinnějším prostředkem zabíjení nádorových buněk, DSB však mohou rakovinu také způsobovat. Procesy umožňující reparaci DSB, zejména nehomologní spojování DNA konců (NHEJ) a homologní rekombinace (HR), proto hrají nezastupitelnou úlohu v životě buňky a jejich aktivita do značné míry determinuje buněčnou odpověď na ozáření a radiosenzitivitu. A jsou to právě nádorové buňky, které díky své genetické heterogenitě a deregulaci reparačních systémů mohou vykazovat jak extrémní radiosenzitivitu, tak bohužel i radiorezistenci. V rámci přednášky se nejdříve zaměříme na vývoj možností detekce a kvantifikace DSB a následně na vlastní výzkum autorů, zejména využívající imunofluorescenční konfokální mikroskopie o vysokém rozlišení ke studiu indukce a reparace DSB s ohledem na vznik a léčbu nádorových onemocnění. Zmíněná metoda, kvantifikující DSB prostřednictvím mikroskopické detekce reparačních ohnisek (např. γ-H2AX a 53BP1) v buněčném jádře v průběhu času po ozáření, představuje v současnosti nejcitlivější metodu pro tento účel, která může poskytnout cenná klinická i komplexní výzkumná data. Na rozdíl od ostatních metod lze pomocí mikroskopie monitorovat indukci a reparaci DSB v jednotlivých, i živých buňkách, navíc po působení velmi malých dávek ionizujícího záření či radiomimetik. Zásadní devizou je také možnost sledovat reparační procesy v prostoru (buněčného jádra) a čase. Diskutovány budou např. nové poznatky týkající se a) mechanizmů tvorby chromozomálních aberací, b) radiorezistence nádorových buněk a c) možností jejího terapeutického ovlivnění (např. pomocí kovových nanočástic).

Výzkum byl podpořen projekty 16-29835 (AZV), 16-12454S a P302/ 12/ G157 (GA ČR), a projekty pro spolupráci s JINR Dubna (Projekt 3 + 3 a Projekt vládního zmocněnce ČR).

XXIX/ 387. Interakce ionizujícího záření a laseru

Efremova Y.¹, Šinkorová Z.², Navrátil L.³

¹ Fakulta biomedicínského inženýrství ČVUT v Praze, ² Katedra vojenské radiobiologie, Fakulta vojenského zdravotnictví Univerzity obrany, Hradec Králové, ³ Fakulta biomedicínského inženýrství ČVUT v Praze

Každodenně je organizmus člověka ovlivňován ionizujícím zářením. Průměrný jedinec může přijmout až 80 % celkové dávky ionizujícího záření z přírodních zdrojů, např. z kosmického záření a přírodních radionuklidů. Zbylá dávka je získána z umělých zdrojů, které představují největší riziko neočekávaného ozáření organizmu. Malé jaderné zbraně mohou být využity teroristy. Zvyšuje se počet atomových elektráren, laboratoří a pracovišť, na kterých se používají zdroje ionizujícího záření. Tato skutečnost zvyšuje riziko vzniku nehod a havárií na uvedených pracovištích. Některé státy disponují jadernými zbraněmi, které mohou být použity. Lasery se používají v nejrůznějších oblastech vědy a techniky. Zkoumání interakce laserového a ionizujícího záření v živé hmotě se stává aktuálním. Zkoumá se např. vliv laseru na reparaci následku poškozujícího působení ionizujícího záření. Přednáška je věnována současnému stavu zkoumání radioprotektivního účinku laserového záření a některým perspektivním výsledkům experimentů autorů publikace. V experimentu bylo použito celkem 164 hlav myši kmene C57BL/ 6. Myši byly náhodně rozděleny do osmi skupin, které byly dodatečně rozděleny do dvou podskupin. V první podskupině byla sledována délka života myší v časovém intervalu 30 dní. V druhé podskupině byl stanoven počet populací krevních buněk 12. den po ozáření. Jedna skupina myší nebyla ozáření ani gama, ani laserovým zářením. Druhá skupina myší byla ozářena pouze gama zářením (celotělové ozáření dávkou 8,7 Gy). V šesti skupinách myší byl aplikován laser 24 hod před nebo po jejich ozáření ionizujícím záření. V experimentu byl použít laser o vlnové délce 940 nm, o výkonu 5 W s frekvenci pulzů 20 Hz a o hustotě energie 3, 12 nebo 18 J/ cm². Laser o hustotě energie 3 J/ cm² prodlužuje délku života myší vystavených letální dávce gama záření při jeho aplikaci 24 hod po gama ozáření (p < 0,05). Aplikace laseru ovlivňovala počty leukocytů, granulocytů, lymfocytů a subpopulace T lymfocytů. Přeživší myši ozářené laserem měly v krvi známky reparace krvetvorby. V následujících experimentech se plánuje pokračovat ve zkoumání vlivu laseru na organizmy poškozené ionizujícím zářením, např. stanovit vliv laseru na postradiačního poškození zdravých a nádorových tkání ozářených ionizujícím zářením.

Výzkum byl proveden za podpory studentského grantu ČVUT v Praze SGS15/ 230/ OHK4/ 3T/ 17.

XXIX/ 460. Stanovení sérových nádorových markerů –  významné interference s preanalytickými vlivy

Rampulová I.¹, Češková M.¹, Greplová K.¹, Zdražilová Dubská L.^1,2, Valík D.^1,2

¹ Oddělení laboratorní medicíny, MOÚ, Brno, ² RECAMO, MOÚ, Brno

Nádorovým markerem (TM) rozumíme substanci přítomnou v nádoru nebo produkovanou nádorem či hostitelem jako odpověď na přítomnost tumoru. Pro správnou interpretaci změn v hladinách TM, zejména při dlouhodobém sledování nemocných s nádorovými chorobami, je třeba vyloučit možné rušivé faktory, které by mohly stanovení ovlivnit již ve fázi preanalytické. V Masarykově onkologickém ústavu (MOÚ) se národové markery stanovují v séru. Provedli jsme studii srovnání séra vs. plazmy. Stanovení následujících TM v Li-heparin plazmě a v séru bez aktivátoru poskytuje stejnou hodnotu: CEA, CA 19-9, CA 125, CA 15-3, AFP, hCG, PSA, fPSA, CA 72-4, S-100, SCC, CYFRA 21-1, HE4. Nádorový marker HE4 má vyšší hladiny v plazmě než v séru. Hemolýza významně interferuje se stanovením NSE, proto stanovujeme současně koncentraci volného hemoglobinu v séru a při hemolýze s volným hemoglobinem nad 300 mg/ l již vyšetření NSE neprovádíme, neboť by výsledek byl vyšší, než je hladina cut-off 15,2 µg/ l a nebyl by využitelný ani z hlediska sledování dynamiky NSE u daného pacienta. Pro prevenci hemolýzy při odběru je třeba pokud možno dodržovat tato pravidla –  nepoužívat zatažení paže; pokud je to nutné, nemělo by být delší než 1 min; zcela nevhodné, avšak stále často používané, je tzv. pumpování paže, vhodnější je sevřená pěst a svěšení paže před odběrem; dezinfekce musí zcela zaschnout; pro odběr krve je důležité používat jehlu s dostatečným průsvitem. Při práci se sérem je důležité dodržovat dobu potřebnou pro srážení krve. Při centrifugaci je důležité dodržovat stanovenou dobu a otáčky a nejpozději do 1 hod separovat sérum od krevních elementů. Nadále je třeba mít na paměti, že pokračující koagulace v séru nebo drobné sraženinky v něm mohou narušit aspiraci vzorku a vést k falešně negativnímu výsledku. Přestože moderní imunochemické analyzátory mají funkci detekce sraženiny, je nutné před vydáním výsledků sledovat a ověřovat nepravděpodobně nízké hodnoty TM. Biologický materiál pro stanovení TM je třeba uchovávat v předepsaných tepelných podmínkách. Obecně jsou markery tzv. CA velmi stabilní, a to i při laboratorní teplotě. Nicméně určité TM, např. chromogranin A, jsou labilní v chladu, proto se transportují při laboratorní teplotě a do analýzy uchovávají na – 20 °C. Při manipulaci se vzorky a spotřebním materiálem (sekundární zkumavky, pipety, plastik pro automatické analyzátory) je nutné pracovat vždy v rukavicích, aby nedošlo ke kontaminaci slinami nebo potem, které významně zvyšují hladinu SCC. Na prevenci kontaminace vzorku slinami je třeba myslet po celou dobu manipulace s otevřeným vzorkem.

XXIX/ 463. Nanovlákenné materiály –  způsoby výroby, vlastnosti a možné biologické aplikace

Lukáš D., Horáková J., Jenčová V., Kuželová-Košťáková E., Mikeš P., Chvojka J.

Technická univerzita v Liberci

Pojednáme o současné snaze pochopit fyzikální podstatu technologií (např. elektrického zvlákňování) umožňujících výrobu nanovláken, tj. vláken o poloměru kolem sta nanometrů. Soustředíme se přitom především na historické, aplikační aspekty a na metodu hladinového elektrického zvlákňování, které má v současné době dominantní význam pro průmyslové využití. Pro představu našeho ponoru do „nanosvěta“ uveďme, že délka jednoho nanometru se má k výšce člověka zhruba tak, jako výška člověka k vzdálenosti Měsíce od Země. Předmětem současného zájmu je především rozbor fyzikálních principů hladinového elektrospinningu vodivých kapalin, který vede k tvorbě mnohočetných tenkých trysek polymerních roztoků z jejich volné hladiny. Tok tryskající kapaliny je přitom vyvolán elektrickými silami mezi náboji v trysce a v okolních elektrodách. Fyzikální vysvětlení jevu elektrického zvlákňování se zakládá na hypotéze samoorganizace (self-organization/ ordering) kapalinových trysek pomocí mechanizmu nejrychleji rostoucí nestability na úzkém dlouhém pruhu volné hladiny kapaliny, která je vložena do vnějšího elektrostatického pole. Základem hypotézy je analýza disperzního zákona vln podrobených gravitačním, kapilárním a elektrickým silám. Výsledkem technologického procesu jsou pak nanovlákenné vrstvy, lineární útvary složené ze svazků nanovláken nebo trojrozměrné útvary. Nanovlákenná hmota svojí morfologí nese některé rysy podobné mimobuněčné hmotě. Proto se do ní v současné době vkládají mnohé naděje spojené s jejich aplikacemi v lékařství. Tento zájem je ještě umocněn možností vyrábět řízené nanovlákenné struktury z biodegradabilních nebo biokompatibilních polymerů.

Autoři příspěvku děkují projektu MPO „Nanovlákenné kryty kožních defektů“ (FV10416).

XXIX/ 464. Nanotechnologie v onkologii

Perlovská Harvanová M.^1,2, Bartoň Tománková K.^3,4, Jiravová J.^3,4, Malohlavá J.^3,4, Kolářová H.^3,4

¹ Oddělení laboratorní medicíny, MOÚ, Brno, ² ACIU (Advanced Cell Immunotherapy Unit) LF MU, Brno, ³ Ústav lékařské biofyziky LF UP v Olomouci, ⁴ Ústav molekulární a translační medicíny LF UP v Olomouci

Výzkum a rozvoj oboru nanotechnologií v posledních několika dekádách zaznamenal rozšíření tohoto oboru i do oblasti biomedicíny. Znalosti fyzikálních vlastností nanomateriálů spolu s postupy molekulární biologie a dalších disciplín poukazují na slibné možnosti využití v diagnostice a v léčbě nádorových onemocnění. Zdrojem unikátních vlastností nanomateriálů je jejich velikost v rozmezí 1– 100 nm, která je příčinou odlišných fyzikálně-chemických a optických vlastností, využívaných napříč různými obory. Kombinace znalostí buněčné biologie, fyziologie a možností povrchových modifikací nanočástic charakterizuje jednu z nejvíce studovaných biomedicínských aplikací nanomateriálů, a to jejich využití jako nosičů protinádorových léčiv. Současný výzkum se soustředí zejména na výhody, které nabízí uzavření protinádorového léčiva do nanonosiče –  překonávání překážek souvisejících s nerozpustností, chemickou nestabilitou nebo biodegradací léčiva. Preklinický výzkum studuje i možnosti cíleného transportu protinádorového léčiva po konjugaci se specificky povrchově modifikovanou nanočásticí do nádorové tkáně. Cílený transport a akumulace léčiva na specifickém místě, kde je uvolněno, nabízí vedle potřebné koncentrace léčiva v místě účinku také mnohem nižší systémové nežádoucí účinky. Nanočástice na bázi lipidů –  lipozomy, uhlíkové nanotrubice, polymerní nanonosiče, micely nebo dendrimery, ve studiu možností využití jako nástrojů protinádorové terapie doplňují i kovové nanočástice. Nanočástice stříbra (AgNPs) patří po některých oxidech kovů k široce využívaným nanomateriálům. Benefity jejich využití jsou hojně diskutovány a není proto překvapující, že se výzkum soustředí i na studium jejich potenciálu na poli biomedicíny. Kromě možnosti využití k cílenému transportu léčiva je pozornost zaměřena také na vlastní schopnost AgNPs negativně ovlivnit proliferaci nádorových buněk. Ta pravděpodobně souvisí s ovlivněním energetického metabolizmu buňky a s biochemickými změnami, nicméně, mechanizmus cytotoxického účinku AgNPs je aktuálně řešenou otázkou mnoha studií. Otázkou zůstává i systémová toxicita, která by mohla být potlačena specifickým rozmezím velikosti využívaných AgNPs nebo jejich povrchovými modifikacemi. Nanotechnologie a jejich využití na poli diagnostiky a léčby nádorových onemocnění se stává často diskutovaným a studovaným tématem. Na cestě hledání možností využití benefitů, které nanotechnologie nabízejí, jsou neustále potkávány další otazníky, které jsou současně motivem dalších studií.

Studium vlivu AgNPs na buněčné úrovni bylo podpořeno grantovým projektem MŠMT ČR L01304 a LM2015062 Czech-BioImaging.

XXIX/ 498. N-glykanové profilování buněčných linií odvozených od rakoviny vaječníků s různou reakcí na podání cisplatiny

Zahradníková M., Nenutil R., Vojtěšek B., Valík D., Novotný M., Hernychová L.

RECAMO, MOÚ, Brno

Východiska: Glykanové profilování se zabývá analýzou glykanů (oligosacharidových struktur) vázaných na proteiny. Změna v glykanovém profilu informuje o průběhu biologických i biochemických procesech v těle a současně o vzniku onemocnění případně jeho progresi. Rakovina vaječníků je každý rok diagnostikována u téměř čtvrt milionu žen. Podání platinových derivátů je jednou z variant léčby, na kterou často vzniká rezistence. V této studii byly izolovány N-glykanové struktury z buněčných linií odvozených z epiteliálního karcinomu vaječníků s rozdílnou citlivostí na účinky cisplatiny. Pomocí hmotnostní spektrometrie pak byly glykany identifikovány a statisticky hodnoceny. Materiál a metody: Byly použity tři buněčné linie: A2780 (senzitivní), A2780cis (se získanou rezistencí) a SK-OV-3 (přirozeně rezistentní) na cisplatinu. Byly připraveny buněčné lyzáty a sekretomy vždy v biologických triplikátech. Glykanové profilování zahrnovalo enzymatické odštěpní glykanu enzymem PNGázou F (16 hod při 37 °C) s následnou permetylací. Vzorky byly měřeny hmotnostním spektrometrem MALDI TOF/ TOF MS (Apllied Biosystems) v reflektorovém módu a získaná data statisticky vyhodnocena programem STATISTICA. Výsledky: Po vyhodnocení získaných dat bylo nalezeno 11 statisticky významně změněných glykanových struktur v lyzátech i sekretomech. Devět z nich bylo zvýšených pro buněčnou linii A2780 a dvě zbývající struktury byly významně zvýšené pro buněčné linie A2780cis a SK-OV-3. Závěr: Získané výsledky jsou v souladu s probíhající pilotní studii, v níž jsou porovnávány N-glykanové profily sér a nádorových tkání vaječníků pacientek senzitivních a rezistentních na podání platinových derivátů. Tyto výsledky budou dále validovány na větších souborech pacientek případně dalších buněčných liniích. Podle dosavadních výsledků i světových trendů výzkumu v této oblasti lze předpokládat budoucí přímý dopad pro klinickou praxi.

Práce byla podpořena projekty MŠMT –  NPU I –  LO1413; MZ ČR –  RVO (MOÚ, 00209805); PPV5/ 2015 a GA ČR 16-04496S. Poděkování patří Mgr. Pavlovi Řehulkovi, Ph.D. z Fakulty vojenského zdravotnictví, Univerzity obrany v Hradci Králové za měření glykanových vzorků na hmotnostním spektrometru.

XXIX/155. Možnosti cílené léčby u vzácných nádorových syndromů

SVOBODA M.

Oddělení epidemiologie a genetiky nádorů, MOÚ; Brno, Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ Brno

Cílená léčba nádorů přináší benefit zejména v těch případech, kde cílová struktura hraje významnou roli při vzniku a progresi daného nádorového onemocnění. Z tohoto pohledu, při současném rozvoji cílené léčby, jsou autozomálně dominantní hereditární nádorové syndromy ideálním modelem pro její použití. V rámci tohoto sdělení budou představeny pokroky v cílené prevenci a léčbě, a to především u vzácnějších hereditárních nádorových syndromů. Gorlinův syndrom (mutace v genu PTCH1/ Hedgehog signální dráha; mnohočetné bazocelulární karcinomy kůže). V cílené léčbě se uplatňují inhibitory SMO proteinu, v našich podmínkách se jedná zejména o vismodegib, kromě něj je v USA registrován i sonidegib a pro lokální použití se testuje patidegib. V preventivním použití existují údaje ke COX-2 inhibitorům a NSAID a dále k ACE-I a blokátorům angiotenzinového receptoru. Součástí prezentace bude kazuistika pacienta s mnohočetnými bazocelulárními karcinomy kůže léčeného vismodegibem. Tuberózní skleróza (mutace v genech TSC1 (hamartin) nebo TSC2 (tuberin)/ zejména mTOR signální dráha; variabilní plicní, renální a CNS projevy). V cílené léčbě se uplatňují zejména mTOR inhibitory. Sirolimus (lymfangioleiomyomatóza –  LAM, renální angiomyolipomy) a everolimus (subependymální obrovskobuněčný tumor (SGCT), refrakterní epilepsie, angiomyolipomy). Sirolimus má využití i v prevenci progrese středně závažného funkčního plicního postižení způsobeného LAM. U méně závažné formy se testuje použití statinů. Součástí prezentace budou kazuistiky dvou pacientek léčených sirolimem pro LAM a renální postižení angiomyolipomy. Neurofibromatóza –  typ NF1, mutace v genu NF1 (neurofibromin)/ RAS-MAPK a mTOR signální dráha, projevy: nádory centrálního a periferního nervového systému –  neurofibromy, gliomy, MPNST, dále kožní projevy, GIST; typ NF2, mutace v genu NF2 (schwannomin, merlin)/ Hippo (YAP/ TAZ) signální dráha, projevy: nádory CNS/ PNS –  vestibulární neurinomy, gliomy, meningeomy, ependymomy, plexiformní a jiné neurofibromy, schwannomy, dále kožní projevy). Existují data podporující použití cílené léčby MEK1/ 2 inhibitory (selumetinib), mTOR inhibitory (sirolimus) a c-Kit inhibitory (imatinib mesylát) u pacientů s NF1 a plexiformními neurofibromy a PDGFR/ c-Kit-wt GIST. Dále jsou zdokumentovány pozitivní účinky bevacizumabu u pacientů s NF2 s vestibulárními schwannomy doprovázenými poruchou sluchu. V této indikaci byl testován i lapatinib. V preventivním užívání byly u NF zaznamenány úspěchy se statiny (lovastatin) za účelem prevence poklesu neurobehaviorálních funkcí a vitaminem D₃ pro udržení kostní denzity. Cowdenův a Bannayan-Riley-Ruvalcaba syndrom (mutace v PTEN genu/ PI3K/ Akt/ mTOR signální dráha, mnohočetné hamartomy, tumory štítné žlázy, prsu a endometria, dále nádory kůže a CNS). V cílené léčbě se mohou uplatnit zejména mTOR inhibitory. Existují údaje dokumentující efektivitu sirolimu u kožních a slizničních projevů a neřešitelných hamartomů v různých lokalitách. Von Hippel--Lindauova choroba (mutace v genu VHL/ VHL-HIF1/ 2 signální dráha, hemangioblastomy CNS a PNS, pankreatické, jaterní, slezinné cysty, cystadenomy, adenomy a hemangiomy a PNET, renální karcinom, feochromocytom). Z hlediska cílené léčby existují údaje o účinnosti sunitinibu u pacientů s VHL a renálním karcinomem nebo pankreatickým NET. Podobně i pro pazopanib (hemangioblastomy, renální karcinom) a intraokulárně aplikovaný bevacizumab (retinální hemangioblastom). U juvenilní polypózy (mutace ve SMAD4 nebo BMPR1A/ TGF-beta signální dráha) a Peutz-Jeghersova syndromu (mutace v STK11/ AMPK/ mTOR signální dráha, TGF-β a KRAS signální dráha) jsou v prevenci rozvoje polypů a vzniku karcinomů v GIT testovány COX-2 inhibitory (meloxicam, celocoxib) a STK11 inhibitory (metformin).