Využití porózního hydrogelu jako 3D scaffoldu pro růst leukemických B lymfocytů

Use of Porous Hydrogel as a 3D Scaffold for the Growth of Leukemic B Lymphocytes

Background:
Primary human B cells chronic lymphocytic leukemia undergoes apoptosis, from which they can be rescued by contact with stromal cells or by the addition of specific soluble factor, when cultured in vitro. For research purposes of the behavior of CLL cells we created 3D in vitro model in which we simulated appropriate microenvironment for CLL cells to allow study the mechanism of survival of these cells in long-term cultivation.

Material and Methods:
Our aim was the scaffold structure to be geometrically similar to the 3D morphology of supporting bone marrow tissue in a trabecular bone; the 3D scaffold was also designed to conform to biocompatibility, sufficiently large surface area for cell attachment, high porosity for cell migration, proliferation and transport of nutrients. Another requirement was a partial transparency for inspection of cell model with optical techniques. We prepared 3D scaffolds from porous hydrogel poly (2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA), poly (2-hydroxyethyl methacrylate-co-2-aminoethyl methacrylate) p (HEMA-co-AEMA) and p (HEMA-co-AEMA) modified with frequently used cell adhesion peptide Arg-Gly-Asp (RGD). All hydrogel scaffolds were manufactured in four pore diameters (125, 200, 300 and 350–450 μm). Scaffolds were tested with human bone marrow stromal cell line HS-5 and human embryonic kidney cell line HEK293.

Results:
Hydrogel scaffold p (HEMA-co-AEMA) modified with adhesion peptide Arg-Gly-Asp (RGD) with pore diameter of 350–450 μm demonstrated that it is a convenient system for 3D cell cultivation, since it promotes interaction between the cells and also between the cells and the material. This scaffold was used for seeding of co-cultivation system of HS-5 cells with CLL-cells, which were stimulated through the CD40L signaling pathway as well as via the IL-4 pathway. Viability of B-CLL cells was higher in the presence of both stimulators than with each alone.

Conclusions:
We have shown that 3D scaffold technology is very useful for modeling of microsystems where the cancer cells behave like in their natural microenvironment.

Key words:
hematooncology – leukemia – hydrogel – stromal cells

This work was supported by grant COST CZ LD15144 “Cellular and acellular grounds for regeneration of bones and teeth” awarded by the Ministry of Education, Youth and Sport of the Czech Republic.

The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.

The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE recommendation for biomedical papers.

Submitted:
6. 3. 2017

Accepted:
26. 3. 2017

Autoři: R. Studená ^1,2; D. Horák ³; J. Baloun ¹; Z. Plichta ³; Š. Pospíšilová ^1,2
Působiště autorů: Centrum molekulární medicíny, CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno ¹; Centrum molekulární biologie a genové terapie, Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno ²; Polymerní částice, Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i., Praha ³
Vyšlo v časopise: Klin Onkol 2017; 30(Supplementum1): 184-186
Kategorie: Článek ve sborníku

Souhrn

Východiska:
Primární lidské B buňky chronické lymfocytární leukemie (CLL) podléhají při kultivaci in vitro buněčné smrti, nicméně jejich přežití lze signifikantně prodloužit kontaktem se stromálními buňkami nebo přítomností specifických solubilních faktorů. Pro účely výzkumu chování CLL buněk jsme vytvořili 3D in vitro model, ve kterém bylo simulováno vhodné mikroprostředí pro CLL buňky umožňující studium mechanizmu jejich přežívání v dlouhodobé kultivaci.

Materiál a metody:
Naším cílem bylo, aby struktura scaffoldu byla geometricky podobná 3D morfologii kostní dřeně, která vyplňuje trabekulární kost, aby měl 3D scaffold dostatečně velký povrch pro zachycení buněk a zároveň velkou pórovitost pro buněčnou migraci a transport živin. Dalším požadavkem byla také alespoň částečná transparentnost potřebná pro pozorování buněčného modelu pomocí optických metod. Připravili jsme 3D scaffoldy z porózního hydrogelu poly (2-hydroxyetyl metakrylát) (pHEMA), poly (2-hydroxyetyl metakrylát-co-2-aminoetyl metakrylát) p (HEMA-co-AEMA) a p (HEMA-co-AEMA) modifikovaný s často používaným adhezním peptidem Arg-Gly-Asp (RGD). Všechny hydrogelové scaffoldy byly vyrobeny ve čtyřech velikostech pórů (125, 200, 300 a 350–450 μm). Scaffoldy byly testovány pomocí HS-5 buněčné linie odvozené z lidských stromálních buněk kostní dřeně a HEK293 buněčné linie odvozené z lidských embryonálních buněk ledvin.

Výsledky:
Hydrogelový scaffold p (HEMA-co-AEMA) modifikovaný adhezním peptidem Arg-Gly-Asp (RGD) s velikostí pórů 350–450 μm prokázal, že je vhodným systémem pro 3D kultivace buněk, neboť podporuje interakce mezi buňkami navzájem a také mezi buňkami a materiálem. Tento scaffold byl použit pro nasazení kultivace složené z HS-5 buněk a CLL buněk, které byly stimulovány pomocí ligandu CD40 a cytokinu IL-4. Viabilita CLL buněk byla vyšší v přítomnosti obou stimulátorů zároveň než v případě každého zvlášť.

Závěr:
Ukázali jsme, že technologie 3D scaffoldů je velmi dobře využitelná pro modelování mikrosystémů, kde se nádorové buňky chovají jako ve svém přirozeném mikroprostředí.

Klíčová slova:
hematoonkologie – leukemie – hydrogel – stromální buňky

Chronická lymfocytární leukemie (CLL) je nejčastější leukemií dospělého věku v euroamerické populaci. Jde o indolentní hematologickou malignitu charakterizovanou hromaděním morfologicky zralých B lymfocytů v kostní dřeni, periferní krvi a lymfatických orgánech. Dlouho byl zastáván názor, že jde pouze o chorobu způsobenou akumulací leukemických buněk v G0 nebo časné G1 fázi buněčného cyklu, díky předpokládanému defektu apoptózy u imunologicky nekompetentních B lymfocytů. Nicméně, současné studie ukazují na to, že leukemické buňky proliferují in vivo a dochází u nich k permanentní apoptóze s menší intenzitou [1]. CLL je také prototypem B buněčné malignity závislé na mikroprostředí. CLL buňky v rámci svého přirozeného mikroprostředí interagují s mezenchymálními stromálními buňkami (MSC), od monocytů odvozenými nurse-like buňkami (NLC) a také s T buňkami. Tyto interakce jsou nezbytné pro proliferaci a přežití CLL buněk. Je známo, že pokud jsou CLL buňky odebrány ze svého přirozeného mikroprostředí a jsou kultivovány in vitro, velmi brzy u nich dochází ke spontánní apoptóze. Apoptóze CLL buněk lze zabránit kultivací ex vivo se stromálními buňkami kostní dřeně nebo s NLC buňkami [2].

Buněčná kultivace na kultivačních destičkách je považována za jednu ze základních a nejčastějších kultivací, se kterou se setkáváme ve většině biologických experimentů. Buněčná proliferace se zde projevuje jako 2D kolonie. Většina experimentálních výsledků však potvrzuje, že 3D kultivace buněk je lepší než 2D z hlediska formování tkání. 3D kultivace je také nezbytná pro podporu buněčných funkcí vyskytujících se v přirozeném prostředí tkáně [3,4].

Naším cílem bylo vytvořit 3D in vitro model klonálních leukemií tak, aby bylo simulováno vhodné mikroprostředí pro CLL buňky umožňující studium mechanizmu přežívání těchto buněk v dlouhodobé kultivaci a jejich případné proliferace. Důležité bylo, aby součástí našeho 3D in vitro modelu byl scaffold, který imituje morfologii kostní dřeně, a buňky jsou zde v tzv. cell-to-cell kontaktu, který tento model odlišuje od 2D kultivací. Podmínkou bylo, aby měl 3D scaffold dostatečně velký povrch pro zachycení buněk, a zároveň velkou pórovitost pro buněčnou migraci a transport živin. Dalším požadavkem byla také alespoň částečná transparentnost materiálu, abychom mohli náš konstrukt pozorovat pomocí optických metod. 3D scaffoldy byly vyrobeny z porózního hydrogelu poly (2-hydroxyethyl metakrylát) (pHEMA), poly (2-hydroxyethyl metakrylát-co-2-aminoethyl metakrylát) p (HEMA-co-AEMA) a p (HEMA-co-AEMA) modifikovaná s peptidem Arg-Gly-Asp (RGD), který se často používá z důvodu lepší adheze buněk. Všechny zmíněné scaffoldy byly vyrobeny ve čtyřech velikostech pórů (125, 200, 300 a 350–450 μm) a měly podobu válečků o průměru 5 mm a výšce 2 mm. 3D scaffoldy jsme nejdříve otestovali pomocí HS-5 buněčné linie odvozené z lidských stromálních buněk kostní dřeně a HEK293 buněčné linie odvozené z lidských embryonálních buněk ledvin. Buněčná linie HS-5 je dobře charakterizovaným modelem mikroprostředí kostní dřeně a buněčná linie HEK293 byla testovací linií. Důležitou vlastností materiálu scaffoldu je jeho biokompatibilita. Ze tří testovaných materiálů adherovaly studované HS-5 a HEK293 buňky nejvíce na scaffold vyrobený z p (HEMA-co-AEMA) -RGD. Ačkoli buněčná linie HEK293 je částečně adherentní, některé oblasti scaffoldu byly jejími buňkami hustě osídleny, což se dá považovat za předběžný důkaz biokompatibility scaffoldu.

Pro změření metabolické aktivity a proliferace buněk ve scaffoldech byla použita Alamarblue zkouška. Alamarblue funguje na základě konverze resazurinu na resorufin. Resazurin je nefluorescenční indikátorová barva, která je přeměněna na červeně fluorescenční resorufin pomocí redukční reakce metabolicky aktivních buněk. Množství produkované fluorescence odpovídá počtu živých buněk. Scaffoldy s velikostí pórů 125 μm byly vyřazeny z testování, protože buňky nepenetrovaly do scaffoldu a zůstávaly na jeho povrchu. Testování jsme tedy podrobili zbývající velikosti pórů. HS-5 a HEK293 buňky byly inkubovány ve scaffoldech v časovém intervalu 1, 3, 5 a 7 dní. Ukázalo se, že nejvíce buňky proliferovaly v p (HEMA-co-AEMA) -RGD scaffoldu s póry 350–450 μm 7. den kultivace. Bylo zjištěno, že proliferace buněk HS-5 a HEK293 vzrůstá s časem kultivace a s velikostí pórů p (HEMA-co-AEMA) -RGD scaffoldu. Na druhou stranu (pHEMA), p (HEMA-co-AEMA) scaffoldy nebyly efektivní, co se týče buněčné proliferace.

Viabilitu buněk jsme detekovali pomocí konfokálního mikroskopu a barvením na živé/mrtvé kalceinem-AM a propidium jodidem. Počet živých/mrtvých buněk byl vyhodnocen a zprůměrován pro každý scaffold. Viabilita byla kalkulována jako procento živých buněk z celkového počtu na definované ploše. Kalcein-AM je fluorescenční pouze pokud je štěpen enzymy uvnitř živých buněk a jen tehdy může být považován za barvu prokazující viabilitu buněk. Největší viabilita HS-5 a HEK293 buněk byla detekována v p (HEMA-co-AEMA) -RGD scaffoldu s póry 350–450 μm 7. den kultivace. Viabilita HS-5 a HEK293 buněk vykazovala vzrůstající tendenci s časem kultivace a s velikostí pórů scaffoldu. Klesající viabilita HS-5 a HEK293 buněk byla pozorována po 1 dnu v (pHEMA) a p (HEMA-co-AEMA) scaffoldech s póry 200 a 300 μm a po 5. dnu v těch samých scaffoldech, ale s 350–450 μm póry.

Velmi zajímavé bylo srovnání chování HS-5 a HEK293 buněk ve scaffoldech s póry 350–450 μm. Buňky kultivované za stejných podmínek formovaly těsně spojené kolonie. HS-5 buňky tvořily mnohem menší klastry než HEK293 buňky v pórech stejné velikosti. Navzdory dalším faktorům, rozdíly byly způsobeny silnějšími interakcemi HS-5 buněk s materiálem scaffoldu a jejich větší velikostí v porovnání s HEK293 buňkami (30–80 vs. 10 μm – HS-5 vs. HEK293 buňky). V přirozeném prostředí se HS-5 buňky morfologicky podobají fibroblastům, avšak ve scaffoldech mají protáhlou morfologii a často získané kulaté a neobvyklé tvary.

Z testovaných scaffoldů se ukázal jako nejvhodnější p (HEMA-co-AEMA) -RGD s póry 350–450 μm. Tento typ scaffoldu sloužil jako nosič pro kokultivační systém složený s HS-5 a CLL buněk. Scaffold s nasazeným kokultivačním systémem byl kultivován jednak samostatně, a byl také stimulován pomocí ligandu CD40 a cytokinu IL-4 po dobu 72 hod. Stimulátory byly přidány do kultivačního média každý zvlášť a dohromady. Přítomnost IL-4 v médiu mělo za následek vzrůst viability CLL buněk, která byla téměř srovnatelná s viabilitou CLL buněk po přidání CD40L do média. Synergistický efekt měla viabilita CLL buněk po přidání IL-4 a CD40L do média zároveň.

Závěrem lze shrnout, že scaffold p (HEMA-co-AEMA) -RGD s póry 350 až 450 μm je vhodný pro 3D kultivace buněk, neboť podporuje buněčnou adhezi, viabilitu a proliferaci buněk. Na druhou stranu scaffoldy vyrobené z (pHEMA) a nemodifikovaného p (HEMA-co-AEMA) hydrogelu nepodporují interakce mezi buňkami a materiálem a také mezi buňkami navzájem. CLL buňky v kokultivaci s HS-5 buňkami byly kultivovány v p (HEMA-co-AEMA) -RGD scaffoldu a stimulovány pomocí CD40L a IL-4. Z výsledků vyplývá, že viabilita CLL buněk byla nejvyšší v přítomnosti obou stimulátorů zároveň oproti každému testovanému stimulátoru zvlášť anebo bez stimulace. Ukázali jsme, že technologie 3D scaffoldů je velmi dobře využitelná pro modelování mikrosystémů, kde se nádorové buňky chovají jako ve svém přirozeném mikroprostředí. Tato oblast výzkumu má obrovský potenciál, což radikálně ovlivní kultivace nádorových buněk v laboratořích v příštích letech. Dále plánujeme náš 3D systém podrobit stimulaci pomocí dalších vhodných aditiv, jako jsou cytokiny a růstové faktory, abychom co nejvíce imitovali mikroprostředí CLL buněk in vivo.

**Obr. 1. Snímky z konfokálního mikroskopu p(HEMA-co-AEMA)-RGD scaff oldu, d = 350–450 μm po inkubaci s HS-5 buňkami (A, B).**

Tato práce byla podpořená grantem COST CZ LD15144 ,,Buněčné a nebuněčné základy pro regeneraci kostí a zubů” uděleným Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy České Republiky.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Ing. Radana Studená, Ph.D.

Centrum molekulární medicíny

CEITEC, MU a Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno

Kamenice 753/5

625 00 Brno

e-mail: radana.studena@gmail.com

prof. RNDr. Šárka Pospíšilová, Ph.D.

Centrum molekulární medicíny

CEITEC, MU a Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno

Kamenice 753/5

625 00 Brno

e-mail: pospisilova.sarka@fnbrno.cz

Obdrženo: 6. 3. 2017

Přijato: 26. 3. 2017

Zdroje

1. Burger JA, Gribben JG. The microenvironment in chronic lymphocytic leukemia (CLL) and other B cell malignancies: Insight into disease biology and new targeted therapies. Semin Cancer Biol 2014; 24: 71–81. doi: 10.1016/j.semcancer.2013.08.011.

2. Hacken E, Burger JA. Microenvironment dependency in chronic lymphocytic leukemia: the basis for new targeted therapies. Pharmacol Ther 2014; 144 (3): 338–348. doi: 10.1016/j.pharmthera.2014.07.003.

3. Kotov NA, Liu Y, Wang S et al. Inverted colloidal crystals as three-dimensional cell scaffolds. Langmuir 2014; 20 (19): 7887–7892.

4. Lee J, Li M, Milwid J et al. Implantable microenvironments to attract hematopoietic stem/cancer cells. PNAS 2012; 109 (48): 19638–19643.