XXX. Základní a aplikovaný výzkum v onkologii

Vnitřní heterogenita kolorektálního karcinomu z histopatologického pohledu, korelace s imunitní odpovědí a bakteriálními patogeny

Budinská E.1, Santa Guzman L.2, Hrivňáková M.1, Brychtová V.1, Zwinsová B.2, Zdražilová Dubská L.3, Bencsiková B.4, Šefr R.5, Nenutil R.6, Popovici V.2

¹ RECAMO, MOÚ, Brno, ² RECETOX, PřF MU, Brno, ³ Oddělení laboratorní medicíny, MOÚ, Brno, ⁴ Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ, Brno, ⁵ Oddělení chirurgické onkologie, MOÚ, Brno, ⁶ Oddělení patologické onkologie, MOÚ, Brno

Východiska: Imunitní odpověď organizmu na nádorové bujení je jedním z nejvýznamnějších faktorů ovlivňujících progresi nádoru a přežití pacienta. Zároveň nejnovější výzkum ukazuje, že vznik a vývoj kolorektálního karcinomu může být přímo ovlivněn patogenními druhy bakterií přítomnými v zažívacím traktu, zejména v tlustém střevě. Bakterie negativně působí na střevní epitel jednak svými genotoxickými metabolity, jednak svou interakcí s buňkami imunitního systému, kterých proliferaci dokážou cíleně zastavit. Cílem projektu bylo zjistit, jestli je imunitní odpověď homogenní v rámci různých FFPE bloků stejného nádoru a jestli přítomnost různých imunitních buněk v různých částech nádoru koreluje s výskytem určitých bakterií na nádorech. Materiál a metody: V FFPE histopatologických řezech 24 nádorů kolorekta stadia I–IV jsme provedli H&E barvení a imunohistochemické barvení CD3+, CD8+, CD45+RO, CD68+, FOXP3, PD1 a PDL1 buněk. Tyto řezy byly naskenovány a digitalizovány a dále semikvantitativně vyhodnoceny patologem a dále s pomocí metod analýzy obrazu a následné aplikace metod prostorové statistiky. Každý nádor byl pro analýzu vnitřní heterogenity reprezentován čtyřmi bloky, celkem jsme tedy vyhodnotili 96 × 8 = 768 řezů. Z nádorů byly odebrány mikrobiální stěry a jejich mikrobiální složení analyzováno pomocí sekvenace genu pro 16S rRNA na přístroji Illumina MiSeq. Rozložení imunitních buněk v nádoru jsme následně korelovali s abundancí bakterií z nádorových stěrů. Výsledky: Z výsledků je patrné, že existuje výrazná heterogenita v rozložení imunitní odpovědi v různých blocích stejného nádoru. Dále jsme našli asociace přítomnosti imunitních buněk ve stromě nebo v nádorovém epitelu s různými bakteriálními druhy. Například CD8+ v epitelu bylo asociováno se zvýšenou abundancí bakterií rodu Hungatella, Enterobacter a Klebsiella. Naopak CD8+ ve stromě bylo asociováno se zvýšeným výskytem bakterií Lactobacillus a Coprobacter. Coprobacter byl také asociován s přítomností nádorové nekrózy. Závěr: Z našich výsledků vyplývá, že imunitní odpověď v nádoru by měla být vyhodnocována z více FFPE bloků, aby byla podchycena celková heterogenita. Nalezené korelace mezi zvýšeným výskytem bakteriálních patogenů a různou imunitní odpovědí potvrzují existenci interakce bakterií a imunitní odpovědi a zároveň poskytují základ pro další funkční studie s cílem popsat princip této interakce a nalézt možné terapeutické cíle.

Mikroskopické a nanoskopické aspekty radiačního poškození a reparace DNA – potenciální role v radiorezistenci glioblastomových buněk

Falk M.1, Hausmann M.2, Krasavin E.3

1 Biofyzikální ústav AV ČR, v.v.i., Brno, 2 Kirchhoff Institute for Physics, University Heidelberg, Německo, 3 Joint Institute for Nuclear Research, Dubna, Rusko

Radiorezistence nádorů působí v onkologii závažný problém. Novou naději představuje ozařování nádorů urychlenými těžkými ionty s vysokým lineárním přenosem energie (LET). Biologickým účinkům urychlených iontů však doposud rozumíme jen omezeně. V tomto příspěvku prezentujeme výsledky rozšiřující naše poznání o účincích urychlených iontů s vysokým LET na normální a nádorové buňky. Zejména diskutujeme význam mikro- a nanoskopických parametrů poškození chromatinu s ohledem na efektivitu reparace dvouřetězcových zlomů DNA (DSB) a postiradiační přežívání buněk. Ukazujeme, že urychlené ionty s vysokým LET vytvářejí DSB výrazně vyšší komplexity než fotonové záření gama s nízkým LET. Komplexita DSB přitom snižovala schopnost buněk radiační poškození opravit a přežít. Vysoká radiobiologická účinnost urychlených těžkých iontů proto spočívá v jejich schopnosti vytvářet v DNA mikro- a nanoskopické klastry mnohočetných DSB. V kontrastu se současným paradigmatem jsme však objevili, že nejen záření s odlišným LET, ale i různé urychlené ionty s podobným LET generují v DNA dvouřetězcové zlomy o různé komplexitě. Zároveň ukazujeme, že vysoce radiorezistentní buňky U87 odvozené od glioblastomu vykazují obdobnou reparační kapacitu jako normální lidské kožní fibroblasty s průměrnou citlivostí k záření, disponují však výrazně vyšší schopností reparovat komplexní DSB. Tato schopnost buněk U87 je doprovázena odlišnou nanokompozicí reparačních komplexů DSB, podstata tohoto jevu a příčinná souvislost mezi nanostrukturou reparačních komplexů DSB a radiorezistencí buněk je nicméně předmětem dalšího výzkumu. Studie vznikla díky propojení unikátních světových technologií – částicových urychlovačů a pokročilých metod optické mikroskopie, vč. „molekulární mikroskopie“ (SMLM) s rozlišením až 10 nm. Výsledky mohou být užitečné v kontextu budoucího rozvoje hadronové terapie a také např. ochrany posádek při plánovaném letu na Mars.

Literatura: [1] Jezkova L et al. Nanoscale 2018; 10 (3): 1162–1179. [2] Bobkova E et al. Int J Mol Sci 2018; 19 (12): E3713.

Podpořeno projekty GAČR 20-04109J, DAAD-19-03 a projekty vládního zmocněnce a 3+3 pro spolupráci se SÚJV Dubna.

Změny N-glykanových profilů nádorů vaječníků pacientek senzitivních a rezistentních na chemoterapeutickou léčbu

Hernychová L.1, Uhrík L.2, Ihnátová I.3, Lattová E.4, Nenutil R.5, Náležinská M.6, Chovanec J.6, Vojtěšek B.1, Valík D.1, Novotný M.7

1 RECAMO, MOÚ, Brno, 2 MOÚ, Brno, 3 Bioinformatika pro studium exposomu, PřF MU, Brno, 4 CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno, 5 Oddělení onkologické patologie, MOÚ, Brno, 6 Oddělení gynekologické onkologie, MOÚ, Brno, 7 Indiana University, Bloomington, USA

Maligní nádory vaječníků a vejcovodů (nejčastěji se jedná o karcinomy) jsou dlouhodobě na prvním místě v úmrtnosti na gynekologické nádory. V souvislosti s touto diagnózou zemře ročně přibližně 700 žen. Příčinou je zachycení onemocnění v pokročilých klinických stadiích s diseminací tumoru po dutině břišní. Terapeuticky se uplatňuje radikální operační výkon se snahou o minimální nádorové reziduum a chemoterapie založená na platinových derivátech. Rezistence na chemoterapii je prognosticky velmi nepříznivým faktem. I když je léčba klinicky úspěšná, pokročilá stadia obvykle až v 60 % recidivují a na 5leté přežití nedosáhne přibližně 45 % těchto pacientek. Apelem na současný výzkum je identifikace možných markerů predikujících senzitivitu pacientek k protinádorové léčbě. Je známo, že změny glykanových struktur na povrchu nádorových buněk ovlivňují proliferaci, adhezi, migraci i buněčnou signalizaci. Strukturně změněné N-glykany (zvýšená fukosylace, sialylace nebo přítomnost komplexních rozvětvených struktur) byly detekovány v sérech a nádorových tkáních pacientek s karcinomem vaječníků. V naší studii bylo 83 pacientek s high grade nemuciózním karcinomem vaječníků. U části z nich (n = 27) byla možná radikální operace, u zbývajících (n = 56) bylo nutné ponechat makroskopické reziduum. Všechny byly následně léčeny chemoterapií obsahující deriváty platiny, u které byla vyhodnocena odpověď jako senzitivní nebo rezistentní. Z nádorových tkání a sér byly pomocí PNGasy F izolovány N-glykany, jejichž profily byly měřeny pomocí MALDI-TOF/TOF hmotnostního spektrometru (UltrafleXtremeTM, Bruker). Kvalitativní a kvantitativní změny v profilech glykanů byly statisticky evaluovány. Z dat naměřených na hmotnostním spektrometru jsme byli schopni detekovat N-glykany v tkáních (68 glykanů) a v sérech (63 glykanů). Pacientky s ponechaným makroskopickým nádorovým reziduem měly v tkáních 26 N-glykanů signifikantně zvýšených v případě rezistence k chemoterapeutické léčbě ve srovnání s pacientkami senzitivními. Šest z těchto glykanů bylo možné považovat za biologické markery na základě jejich senzitivity a specificity a zvýšené intenzity glykanů spojené s kratší dobou do relapsu. U pacientek s radikální operací však tyto tkáňové glykany nevykazovaly statisticky signifikantní rozdíly. Mezi nadějné kandidáty na diagnostické markery patří glykoproteiny, proto naše pozornost bude dále zaměřena na identifikaci a kvantifikaci proteinů nesoucích popsané statisticky významné N-glykanové struktury.

Práce byla podpořena projekty GAČR 16-04496S, MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805), Evropského fondu pro regionální rozvoj – projekty ENOCH (reg.č.: CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000868), CETOCOEN PLUS (CZ.02.1.01/0.0/0.0/15_003/0000469) a MSCAfellow@MUNI“ (No.CZ.02.2.69/0.0/0.0/17_050/0008496), CIISB (LM2018127, MEYS CR); RECETOX (LM2018121, MEYS CR).

Nanomedicína pro cílenou léčbu nádorových onemocnění – význam proteinové korony

Kizek R.1, Sehnal K.2, Kepinská M.3, Fernandez C.4, Banáš D.2, Uhlířová D.1, Staňková M.1, Všetičková M.1, Tóthová Z.1, Ruttkay Nedecký B.2

1 Prevention Medicals s. r. o., Brno, 2 Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 3 Wroclaw Medical University, Wroclaw, Polsko, 4 Robert Gordon University, Aberdeen, Velká Británie

Východiska: Nádorová onemocnění jsou druhou nejčastější příčinou úmrtí ve vyspělých zemích. Je známo, že protinádorová terapie vykazuje řadu závažných nežádoucích účinků. Jedním z nich je nedostatek selektivity pro nádorovou tkáň, což vede k jejich působení na nenádorové buňky. Kromě toho relativně nízká terapeutická koncentrace aktivní sloučeniny často způsobuje rezistenci a multirezistenci nádorových buněk vůči léčivům. Cílem práce je zhodnotit nanomedicínský přístup pro léčbu zhoubných nádorů. Výsledky: Nanotransportéry pro cílenou léčbu představují moderní a efektivní způsob personalizovaného přístupu. Jako základ nanotransportéru mohou být využity uhlíkové, zlaté, stříbrné a další nanočástice. Nanočástice mohou vstoupit do buňky nezávisle na jejím typu a funkční skupině připojené k povrchu nanočástice. Různé studie in vitro a in vivo ukázaly, že mnoho funkcionalizovaných nanočástic je biologicky kompatibilních. Fyzikálně-chemické vlastnosti nanočástic hrají rozhodující roli v jejich potenciální buněčné toxicitě. Kromě pasivních metod cílení založených na mechanizmu účinku EPR (enhanced permeability and retention efffect) a specifickém kyselém prostředí v nádoru jsou také zkoumány strategie aktivního cílení na vybraný nádor pomocí ligandů nebo protilátek, které zvyšují specificitu nanotransportéru. Pro aplikaci nanočástic in vivo však hraje velkou roli proteinová korona. Studium proteinové korony je aktuální otázkou. Proteinovou koronou se rozumí soubor všech proteinů, které se na nanočástice mohou vázat. Vytvoření proteinové korony je většinou asociováno s výrazným snížením terapeutického potenciálu nanočástic. Nejzastoupenější složkou proteinové korony je albumin. Ukázalo se, že složení proteinové korony závisí na struktuře a fyzikálně-chemických vlastnostech nanočástic. Efekty modifikace povrchu nanočástic ovlivňují složení a tvorbu proteinové korony. Modelově byly studovány efekty a interakce albuminu a různých nanočástic (AgNPs, AuNPs, CNTs). Závěr: Zcela nezodpovězenou otázkou je interakce nanočástic s thiolovými sloučeninami jako jsou nízkomolekulární glutathion nebo metalothionein. Kromě výše uvedeného pozorujeme u některých zhoubných nádorů zvýšenou expresi albuminových receptorů (nádory jater, žlučníku, ale i prsu). Tento fakt může být výhodným pro nanočástice s proteinovou koronou. Výzkum v této oblasti nanomedicíny je zcela otevřený a jistě přinese mnoho nečekaných objevů v blízké budoucnosti.

Práce je realizována v COST CA18122 and International Collaboration Project of The European Technology Platform for Nanomedicine.

Studium kinetiky internalizace feritinů do buněčných linií prsního karcinomu

Kratochvíl Z.1, Tesařová B.1, Charousová M.1, Pekařík V.2, Rex S.3, Heger Z.3

1 Mendelova univerzita v Brně, 2 Fyziologický ústav, LF MU, Brno, 3 Ústav chemie a biochemie, Mendelova univerzita v Brně

Východiska: Díky svým unikátním vlastnostem se feritin stal předmětem velkého počtu studií souvisejících s výzkumem cílené léčby nádorových onemocnění. Tato práce je zaměřena na sledování jeho vstupu do prsních buněk ve vymezeném časovém úseku. Při procesu internalizace je však nutné zohlednit přítomnost tzv. proteinové korony, což jsou plazmatické proteiny navázané na povrch nanomateriálů při průchodu krevním řečištěm. Z tohoto důvodu může být výrazně ovlivněn vstup feritinu do buněk, což by v případě jeho potenciálního využití jako nanotransportéru mělo značný efekt na účinnost cílené terapie nádorových onemocnění. Materiál a metody: Pro tento experiment byly použity čtyři druhy feritinů, a sice koňský feritin tvořený 22 lehkými a 2 těžkými podjednotkami (EcaLH), popř. pouze lehkými podjednotkami (EcaL), dále lidský feritin tvořený pouze těžkými podjednotkami (HsaH) a feritin produkovaný mikroorganizmem Pyrococcus furiosus (Pfu). Tyto feritiny byly fluorescenčně označeny pomocí Cyanine5 NHS esteru a posléze naneseny na různé lidské prsní buněčné linie bez přítomnosti lidského séra a v jeho přítomnosti. Kinetika jejich internalizace byla studována pomocí průtokové cytometrie v několika časových intervalech s ohledem na absenci či přítomnost proteinové korony. Výsledky: Na základě mediánu intenzity fluorescence byla stanovena míra internalizace jednotlivých typů feritinů do použitých prsních buněčných linií. Nejrychlejší internalizace byla pozorována u lidského feritinu, naopak v případě koňského feritinu s lehkými podjednotkami docházelo k nejpomalejšímu vstupu do buněk. Po 24 hod, což byl poslední časový interval tohoto experimentu, byl v nejvyšší míře internalizován lidský feritin HsaH v nemaligní epiteliální prsní buněčné linii HBL-100 a v maligní buněčné linii prsního karcinomu MCF-7, zatímco nejnižší míra internalizace byla zaznamenána u koňského feritinu EcaL v liniích triple negativních prsních karcinomů MDA-MB-231 a MDA-MB-468. Proteinová korona nejvíce ovlivnila vstup lidského feritinu HsaH do buněk MCF-7, a to tak, že po 24 hod inkubace s touto buněčnou linií došlo ke snížení internalizace feritinu až o 98 %. Závěr: Nejvyšší schopnost vstupu do prsních buněk vykazoval lidský feritin. Jeho internalizace však byla značně omezena přítomností proteinové korony. Možným řešením této skutečnosti by pak mohl být návrh takové povrchové modifikace lidského feritinu, která by co nejvíce eliminovala tvorbu proteinové korony a zároveň by nikterak nesnížila jeho schopnost internalizace do buněk.

Práce byla podpořena projektem CEITEC 2020 (LQ1601).

Albendazole and Fenbendazole Activate p53 in MdmX Overexpressing Tumor Cells

Mrkvová Z.1, Uldrijan S.2, Pombinho A.3, Bartůněk P.3, Slaninová I.1

1 Biologický ústav, LF MU, Brno, 2 Biologický ústav, LF MU, Brno; ICRC – Mezinárodní centrum klinického výzkumu, FN u sv. Anny v Brně, 3 CZ-OPENSCREEN: Národní infrastruktura chemické biologie, Praha; Ústav molekulární genetiky AV ČR, v.v.i., Praha

p53, the guardian of the genome and the main tumor suppressor, is mutated in about 50% of cancers. However, even in the absence of mutations, the function of p53 may be inhibited. The overexpression of p53 negative regulators Mdm2 and MdmX renders p53 inactive in malignant melanomas or breast adenocarcinomas despite the presence of wild-type p53. We established a method to detect p53 transcriptional activity in melanoma cell line (A375) carrying p53-activity luciferase reporter construct. This method was then used for high throughput screening of more than 2,000 compounds. Based on the screening results, we decided to focus on two benzimidazoles – albendazole and fenbendazole. Both are commonly used as anthelmintics in clinical practice. Albendazole and fenbendazole induced an increase in p53 and p21 protein levels in melanoma as well as in breast adenocarcinoma cell lines. These changes imply an activation of the p53-p21 signaling pathway. Both benzimidazoles also caused a decrease in Mdm2 and MdmX protein levels in melanoma and breast adenocarcinoma cell lines. We demonstrated that the benzimidazoles reduced cell viability and changed cellular morphology to the point of mitotic catastrophe. G2/M cell cycle arrest, enlarged cells with multiple nuclei and damaged microtubular system were observed. In conclusion, we developed a method for detection of p53 activity. Our primary screening of small molecule compounds yielded two attractive p53 activators – albendazole and fenbendazole. Both benzimidazoles promoted p53 activity via downregulation of its negative regulators Mdm2 and MdmX in MdmX-overexpressing cancer cell lines. Our study suggests the possibility of using these anthelmintics for drug repurposing strategy, specifically for the treatment of cancers overexpressing p53 negative regulators Mdm2 and MdmX.

This research was funded by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic, the specific university research grant (MUNI/A/1087/2018), Masaryk University program P-Pool, and grant LQ1605 – Translational Medicine.

Kvantitativní analýza mRNA kódující (sub) izoformy metalothioneinů v buňkách karcinomu prsu po aplikaci cytostatických léčiv

Petrlák F.1, Michálek P.2, Heger Z.2, Šubrtová H.1

1 Mendelova univerzita v Brně, 2 Ústav chemie a biochemie, Mendelova univerzita v Brně

Metalothioneiny (MT) jsou proteiny s nízkou molekulovou hmotností. MT je velmi bohaté na cystein, což způsobuje vysokou afinitu MT k těžkým kovům a poskytuje buňkám ochranu proti jejich toxickému účinku. MT tak primárně řídí intracelulární homeostázu zinku, která je nezbytná pro buněčnou proliferaci a diferenciaci. MT působí také jako antioxidant chránící buňky před volnými radikály a následným oxidačním stresem. Dosud byly detekovány čtyři transkripčně aktivní izoformy a osm (sub) izoforem MT, jejichž exprese je tkáňově specifická. Mnoho studií uvádí, že exprese jednotlivých MT se liší u různých typů nádorů, což naznačuje, že MT hrají zásadní roli v procesu karcinogeneze. Identifikace změn v expresi jednotlivých (sub) izoforem MT by tak mohla mimo jiné přispět k časné diagnóze nádoru a efektivnější terapii. Pro experimenty byly využity prsní nádorové linie MDA-231, MDA-468 a MCF-7. Byl proveden MTT test pro zjištění poloviční inhibiční koncentrace jednotlivých cytostatických léčiv (cisplatina, doxorubicin) pro každou z buněčných linií. Poté byla provedena inkubace se stanovenými koncentracemi testovaných látek. Po 24 hod byla izolována RNA, následovaná reverzní transkripcí. Přepsaná cDNA sloužila jako templát pro kvantitativní polymerázovou řetězcovou reakci qPCR. Sledovány byly exprese jednotlivých genů pro následující subizoformy MT: MT1A, MT1E, MT1F, MT1G, MT1X, MT2A a MT3. Výsledky byly vyhodnoceny metodou 2–∆∆Ct. Specificita PCR byla validována analýzou křivek tání amplifikačních produktů. Byly zjištěny poloviční inhibiční koncentrace pro jednotlivé buněčné linie. 24hIC50 cisplatiny byla 115µM pro MDA-MB-231, 14µM pro MDA-MB-468 a 52µM pro MCF-7. 24hIC50 doxorubicinu byla 230 µM pro MDA-MB-231, 3µM pro MDA-MB-468 a 10µM pro MCF-7. Následovala samotná kvantitativní analýza jednotlivých MT u vybraných nádorových buněčných linií. Po inkubaci s cytostatickými léčivy došlo ke změně expresních profilů MT1A, MT1E, MT1F, MT1G a MT1X u všech zkoumaných buněčných linií. Zvýšení bylo pozorováno obzvláště u genu MT3, který je u těchto buněčných linií za normálních podmínek exprimován pouze v zanedbatelné míře. Výsledky této studie potvrzují, že exprese (sub) izoforem MT je specificky zvyšována aplikací cytostatických léčiv, a může tak hrát důležitou roli v procesu rozvoje chemorezistence. Dalším krokem budou funkční analýzy jednotlivých (sub) izoforem (knock-in, knock-out) a identifikace konkrétních mechanizmů zodpovědných nejen za dysregulaci exprese MT, ale také za rozvoj chemorezistence.

Práce byla podpořena grantovým projektem DFG-GAČR (19-13766J).

Regulace aktivity proteinu p63

Pokorná Z.1, Hrabal V.2, Vysloužil J.1, Zatloukalová P.2, Brychtová V.2, Vojtěšek B.2, Coates P.1

1 MOÚ, Brno, 2 RECAMO, MOÚ, Brno

Rodina p53 je tvořena třemi členy – p53, p63 a p73. TP63 lze považovat za dva samostatné geny, přičemž nezávislé promotory vedou ke vzniku mRNA, které kódují varianty proteinů TAp63 nebo Np63. TAp63 obsahuje transaktivační doménu podobnou p53 a má podobné vlastnosti jako p53. Np63 postrádá tuto oblast, což naznačuje inhibici funkcí p53. Nicméně p63 má role nezávislé na p53, což je důležité pro normální vývoj epitelových tkání. TP63 marker je u onkologických onemocnění velmi zřídka mutován, avšak je často amplifikován a/nebo nadměrně exprimován např. ve spinocelulárních karcinomech a u některých forem rakoviny močového měchýře jako Np63 forma. P63 je převážně nadměrně exprimován u rakoviny jako onkogenní forma Np63 a p53 hraje roli tumor supresorového genu. Za fyziologických podmínek je exprese Np63 omezena převážně na epiteliální tkáně, zatímco p53 je exprimován ve všech typech buněk. Většina prací týkajících se p63 se soustředila především na identifikaci cílových genů, které mohou být tímto markerem ovlivněny. Byla popsána jeho role např. v proliferaci, přežití, diferenciaci či adhezi. Naproti tomu existuje jen velmi málo studií o tom, jak a čím je Np63 regulován. Vzhledem k tomu, že Np63 má odlišné funkce a expresi od p53, očekává se, že jeho regulace bude odlišná, i když mohou existovat překrývající se mechanizmy. Snažili jsme se tedy identifikovat faktory, které se uplatňují v regulaci Np63 na in vitro úrovni. Tyto experimenty byly provedeny za použití nádorových a nenádorových buněčných linií s endogenní expresí, nebo bez endogenní exprese Np63 (FaDu, HaCaT, MCF7 aj.). Dle získaných výsledků je pravděpodobné, že Np63 je up-regulován specifickými signály týkajících se růstu/přežití buňky, které působí prostřednictvím membránových receptorů a kinázových kaskád, a tím zvyšují expresi Np63 markeru. Růstové faktory (IGF-1, inzulín) indukují nárůst Np63. Experimenty s užitím inhibitorů downstream signalizačních drah naznačily, že signální cesta nemusí být pouze přes AKT dráhu, ale zahrnuje jak PI3K-AKT, p38/MEK, tak MAPK/ERK dráhu. Stresem navozené poškození DNA (např. cisplatinou, UV) snižuje hladiny proteinu Np63. Pravděpodobně je snížení exprese Np63 ovlivněno proteazom-ubikvitin zprostředkovanou degradací. V případě posttranslačních modifikací má své důležité postavení acetylace a fosforylace, což dokládá významná up-regulace tohoto markeru po podání inhibitorů histondeacetyláz či inhibitorů HMG-CoA reduktázy. Regulace Np63 se tedy významně liší od p53 a zasluhuje další studium.

Podpořeno Grantovou agenturou České republiky s reg. č. 19-06530S.

Autonomní nanosystémy pro dynamický transport proteinů

Ressnerová A.1, Pumera M.2, Rex S.1, Michálková H.3, Novotný F.2, Heger Z.3

1 Ústav chemie a biochemie, Mendelova univerzita v Brně, 2 Center for Advanced Functional Nanorobots, Praha, 3 Ústav chemie a bio chemie, Mendelova univerzita v Brně

Východiska: Posledním trendem nanomedicíny se stává přechod ze statických nanočástic na dynamické nanosystémy. Důvodem této tranzice je vysoké procento akumulace pasivních nanočástic v okolní necílové tkáni, což může vést k nežádoucím účinkům a neefektivní léčbě. Nanorobotika je novým odvětvím, které je právě na vzestupu. Nanoroboti jsou schopni vykazovat pohyb díky katalytické aktivitě. Jejich pokročilé vlastnosti je řadí na přední příčky současných trendů v oborech pokročilých materiálů a nanomedicíny a slibují efektivnější transport biologicky aktivních molekul. Tato práce se zabývá studiem kationických zlatých nanorobotů s katalytickou stříbrnou vrstvou, která po kontaktu s H2O2 vytváří dynamický pohyb. Pohyb nanorobotů a schopnost jejich internalizace do buněk byl charakterizován při různých koncentracích H2O2. Kolokalizace s endozomálními a lysozomálními proteiny byla studována. Biokompatibilita byla testována pro zjištění případné reaktivity s necílovými tkáněmi. V neposlední řadě byli nanoroboti použiti pro transport metalothioneinu do buněčné linie karcinomu prostaty. Metody: Kinetika internalizace nanorobotů do buněk a kolokalizace s endozomálními a lysozomálními proteiny byla kvantifikována pomocí super-resolution fluorescenčního konfokálního mikroskopu díky plazmonové rezonanci nanorobotů a imuno-fluorescenčního značení buněčných kompartmentů. Biokompatibilita nanorobotů byla studována v závislosti na tvorbě proteinových koron a aktivace C3 složky komplementu. Účinnost transfekce fluorescenčně značeným metalothioneinem byla stanovena pomocí FACS analýzy. Buněčná linie karcinomu prostaty DU145 byla využita pro všechny experimenty. Výsledky: Buněčná internalizace nanorobotů byla závislá v čase na přítomnosti pohonu v médiu v porovnání se samotným médiem. Internalizace byla signifikantně zrychlena při vyšších koncentracích H2O2. Nanoroboti vykazovali kolokalizaci především s lyzozomálními proteiny. Vysoká biokompatibilita nanorobotů byla zjištěna během testů biokompatibility. Nanoroboti v přítomnosti H2O2 byli schopni transfekce metalothioneinu do komerčně dostupné obtížně transfekovatelné linie DU145. Závěr: Zlatí nanoroboti se stříbrnou katalytickou vrstvou jsou biokompatibilními nanonástroji, schopnými pohybu a internalizace do buněk v přítomnosti H2O2. Schopnost transfekce obtížně transfekovatelné buněčné linie proteinem metallothioneinem ukazuje potenciální využití pro transfekce či pro dynamický transport jiných biologicky aktivních molekul.

Práce byla podpořena grantovým projektem ERC Starting Grant 759585.

Expresní analýza cirkulárních RNA u pacientů s glioblastomem

Ručková M.1, Večeřa M.1, Kopková A.1, Šána J.2, Trachtová K.1, Smrčka M.3, Kazda T.4, Hermanová M.5, Jančálek R.6, Slabý O.2

1 CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno, 2 CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno; Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ, Brno; Ústav patologie, LF MU a FN Brno, 3 Neurochirurgická klinika, LF MU a FN Brno, 4 Klinika radiační onkologie, MOÚ, Brno, 5 I. ústav patologie, LF MU a FN u sv. Anny v Brně, 3 LF MU, Brno, 6 Neurochirurgická klinika, LF MU a FN u sv. Anny v Brně

Východisko: Glioblastom (GBM) je nejčastějším maligním primárním nádorem mozku asociovaným s velmi špatnou prognózou. I přes konvenční léčbu se medián celkového přežívání (OS) pohybuje mezi 12 a 15 měsíci od stanovení diagnózy. V současnosti se proto výzkum zaměřuje na nové terapeutické možnosti a nové prognostické a prediktivní biomarkery odpovědi na léčbu. Významnou úlohu v biologii GBM by mohly hrát i cirkulární RNA (circRNA), nekódující RNA regulující v buňce hladiny mikroRNA (miRNA). Esenciální význam miRNA v biologii mnoha nádorových onemocnění vč. GBM byl přitom již mnohokrát popsán. CircRNA by tedy díky své funkci mohly sloužit jako potenciální terapeutické cíle, případně prognostické, prediktivní nebo diagnostické biomarkery. Materiál a metody: Pro účely identifikace deregulovaných circRNA v GBM pomocí technologie RNA-Seq bylo do studie zahrnuto 20 pacientů s GBM a 10 pacientů s farmakorezistentní epilepsií, od kterých byla během chirurgicko-léčebného výkonu získána nádorová, resp. nenádorová mozková tkáň. Získané sekvence byly mapovány pomocí nástroje STAR a dále byl za pomoci nástrojů CIRCexplorer a CIRI zhodnocen počet tzv. zpětných sestřihů, jež jsou charakteristické právě pro circRNA. Na nezávislém souboru 45 GBM a 17 nenádorových vzorků mozkové tkáně byla následně provedena qRT-PCR analýza vybraných circRNA (CFH, cirITCH, hsa_circ_0008344, NFIX). Expresní data normalizovaná na expresi GAPDH pak byla hodnocena pomocí Mann-Whitneyho analýzy. Výsledky: Bioinformatická analýza sekvenačních dat odhalila u GBM celkem 1 018 a u nenádorových vzorků 2 050 různých circRNA s min. třemi zpětnými sestřihy. Průměrný počet unikátních circRNA s alespoň třemi zpětnými sestřihy detekovaných oběma nástroji společně dosahoval u GBM 338 (247–482) a u nenádorových vzorků 738 (531–1 029). Z výsledků nezávislé qRT-PCR analýzy exprese circRNA CFH, cirITCH, hsa_circ_0008344 a NFIX byla statistickým porovnáním odhalena významně nižší exprese cirITCH a hsa_circ_0008344 v nenádorové mozkové tkáni oproti GBM (p < 0,0001). Statistická analýza odhalila taktéž částečnou asociaci mezi expresí CFH a hsa_circ_0008344 a OS u pacientů s GBM. Závěr: Výsledky studie potvrzují, že exprese vybraných circRNA je v GBM deregulována, a tyto molekuly se tak mohou skutečně podílet na gliomagenezi, přičemž by mohly být slibnými terapeutickými cíli a diagnostickými a prognostickými biomarkery u pacientů s GBM.

Projekt byl uskutečněn za podpory MZ ČR grantu AZV NV19-03-00501 a projektu MŠMT ČR CEITEC 2020 (LQ1601).

Stříbrné nanočástice modifikované albuminem s potencionálním protinádorovým účinkem

Ruttkay Nedecký B.1, Sehnal K.1, UhlÍřová D.2, Noguera M.3, Staňková M.2, Kepinska M.4, Kizek R.2

1 Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 2 Prevention Medicals s. r. o., Brno, 3 Faculty of Farmacy and Food Sciences, Barcelona, Španělsko, 4 Wroclaw Medical University, Wroclaw, Polsko

Východiska: S vývojem nanotechnologií jsou hledány nové strategie pro léčbu a diagnostiku nádorových onemocnění. Stříbrné nanočástice se dostávají do stále větší pozornosti pro jejich antibakteriální vlastnosti, ale vyznačují se také protinádorovými a antioxidačními účinky. Díky použitému procesu zelené syntézy může být povrch nanočástic potažen molekulami, které vykazují antibakteriální a protinádorové účinky. Rostliny poskytují vysoce žádoucí sloučeniny pro syntézu nanočástic díky jejich schopnosti produkovat širokou škálu sekundárních metabolitů se silným redukčním potenciálem. Cílem této práce bylo připravit zelenou syntézou stříbrné nanočástice (AgNPs), modifikovat je bovinním sérovým albuminem (BSA) a zjistit jejich protinádorový účinek. Materiál a metody: Pro zelenou syntézu AgNPs byly použity vodné extrakty pelyňku pravého (Artemisia absinthium) AgNPs/A; a maliníku obecného (Rubus idaeus) AgNPs/R. Byly smíchány s 0,1 M AgNO3 v poměru 1: 1 a míchány 24 hod při RT. Poté byly pročištěny methanolem, vysušeny a dispergovány ve vodě. Pro modifikaci se k AgNPs přidalo BSA a tato směs byla míchána 1 hod při 37 °C anebo 24 hod při RT. Buněčná linie nádoru prsu MCF-7 byla pasážována v intervalu 3 dny v DMEM médiu s 5% fetalním bovinním sérem, při 37 °C, a 5% CO2. Proliferační aktivita AgNPs byla testována pomocí MTT testu po 24 hod inkubace buněk s nanočásticemi. Výsledky: Získané AgNPs/A (Amax 470 nm), AgNPs/R (Amax 490 nm) i jejich BSA modifikace byly charakterizovány pomocí UV – Vis absorpční spektroskopie a dynamického rozptylu světla (DLS). Nejvýraznější inhibiční účinek byl zřejmý u AgNPs/A (IC50 = 0,8 ± 0,01 µg/ml; p = 4.4.10–8) a u AgNPs/A/BSA/24 hod/25 °C (IC50 = 8,0 ± 1,5 µg/ml; p = 8.2.10–3). U AgNPs/R byl průměrný cytotoxický efekt spíše mírně proliferační. Nejvyšší cytotoxickou aktivitu vykazovaly AgNPs připravené s použitím extraktu z pelyňku AgNPs/A, a to již při koncentraci nanočástic 1,25 µg/ml. Naproti tomu stříbrné nanočástice připravené s použitím extraktu z maliníku AgNPs/R ani jejich modifikace AgNPs/R/BSA/1 hod/37 °C a AgNPs/R/BSA/24 hod/25 °C nevykazovaly téměř žádnou cytotoxickou aktivitu. Cytotoxická aktivita byla pozorována až při koncentraci AgNPs > 50 µg/ml. Závěr: V práci byly získány nové informace o možnosti přípravy AgNPs zelenou syntézou, modifikaci povrchu nanočástic BSA a možným protinádorovým potenciálem. AgNPs/A/BSA/24 hod/25 °C vykazovaly výrazné antiproliferační vlastnosti k MCF-7 buňkám.

Práce byla financována projekty H2020 CA COST Action LTC18002, ERASMUS+ a institucionální podporou FaF VFU.

Modulačný účinok rastlinných funkčných potravín asociovaný s reguláciou epigenetických mechanizmov v modeli mamárnej karcinogenézy in vivo

Samec M.1, Kubatka P.1, Jašek K.1, Kajo K.2, Kello M.3, Mojžiš J.3, Adamkov M.1, Líšková A.1, Žúbor P.4, Péč M.1

1 Jesseniova lekárska fakulta v Martine, UK v Bratislave, 2 Onkologický ústav sv. Alžbety, Bratislava, 3 LF UPJŠ v Košiciach, 4 OBGY Health & Care, Žilina

Východiská a ciele: Fytochemikálie ako sekundárne metabolity obsiahnuté v rastlinných funkčných potravinách predstavujú v synergii s ostatnými nutrientami rastlín významné látky asociované s prevenciou civilizačných ochorení vrátane rôznych typov malignít. Jeden z mechanizmov prevencie rakoviny prostredníctvom fytochemikálií predstavuje schopnosť týchto substancii regulovať epigenetické modifikácie, ktoré sú priamo zapojené v iniciácii, promócii a progresii malígnej transformácie. Na základe tejto hypotézy sme analyzovali zmeny v rámci epigenetických alterácií, vrátane expresie miRNA, metylačného profilu génových promótorov a zmien v histónových modifikáciách po aplikácii dúšky tymianovej (Thymus vulgaris L) a škorice (Cinnamomum zeylanicum L.) v experimentálnom modeli mamárnej karcinogenézy in vivo. Metódy: V dvoch experimentálnych štúdiách bola podávaná sušená vňať tymianu, resp. drvená kôra škorice v diéte v dvoch koncentráciách 0,1 a 1 % potkanom, ktorým bola indukovaná karcinogenéza subkutánnou aplikáciou karcinogénu N-methyl-N-nitrosourea. Na konci experimentálnej štúdie boli zvieratá dekapitované a bolo im odobraté nádorové tkanivo, ktoré bolo následné podrobené imunohistochemickým a molekulárnym analýzam. Výsledky: V oboch experimentálnych štúdiách sme zaznamenali signifikantné zmeny v epigenetických mechanizmoch. V animálnom modeli mamárnej karcinogenézy preukázal tymian pozitívny dopad asociovaný so zvýšením expresie miR-22, -210 a -34a (vyššia dávka tymianu) a znížením metylácie promótorových oblastí génov ATM, RASSF1, PTEN a TIMP3. V prípade posttranslačných modifikácií histónov bola zaznamená znížená úroveň trimetylácie histónu H3 (H3K4m3). V druhom experimente s použitím škorice bol dokumentovaný pokles v expresii miR-155 a miR-21 (nižšia dávka škorice) a v redukcii úrovne metylácie promótorových oblastí génov ATM a TIMP3. V prípade sledovania zmien v histónových modifikáciách bol detekovaný regulačný účinok škorice spojený s poklesom trimetylácie histónov H3 (H3K4m3 resp. H3K9m3) a nárastom úrovne acetylácie histónu H4 (H4K16ac). Záver: Tymian ako aj škorica preukázali výrazné modulačné účinky v rámci epigenetických mechanizmov asociovaných so supresiou nádorovej progresie v in vivo modeli karcinómu prsníka.

Molekulární heterogenita kolorektálních adenomů a její korelace s výskytem metachronních adenomů

Semyakina A.1, Ptáčková R.1, Minárik M.2, Hálková T.1, Suchánek Š.3, Traboulsi E.4, Brogyuk N.3, Zavoral M.3, Benešová L.1

1 Genomac výzkumný ústav, s. r. o., Praha, 2 Genomac výzkumný ústav, s. r. o., Praha; Elphogene, s. r. o., Praha, 3 Interní klinika, 1. LF UK a ÚVN Praha, 4 Oddělení patologie, ÚVN Praha

Východiska: Nejčastější novotvary nalézané během screeningové kolonoskopie jsou adenomatózní polypy a jejich odstranění je jedním z nejúčinnějších preventivních opatření proti rozvoji kolorektálního karcinomu (CRC). U významné části pacientů však dochází během následujících několika let k výskytu metachronních adenomů, a tak jsou všichni pacienti s nálezem adenomu zařazeni do sledovacího programu s intervaly kontrolních kolonoskopií v rozmezí 1–10 let v závislosti na míře rizika rekurence. Ta se hodnotí na základě několika klinických parametrů (počet, velikost, stupeň dysplazie, lokalizace a vilózní charakter) a nově se hledají další, např. molekulárně-genetické markery, které by pomohly riziko zpřesnit a zefektivnit sledovací program. Kolorektální adenomy jsou z hlediska počtu i prostorové distribuce somatických mutací velmi heterogenní, a tak se nabízí otázka, zda tato heterogenita může být prediktorem rizika jejich rekurence. Materiál a metody: Ve studii je zahrnuto 52 adenomů > 10 mm, které byly získány v rámci kolonoskopie od celkem 39 pacientů. Všichni tito pacienti následně podstoupili kontrolní kolonoskopické vyšetření v odstupu 1 roku. Každý adenom byl rozkrájen na 20–48 částí s dokumentací jejich prostorového umístění. Z každé části pak byla izolována DNA a provedena heteroduplexní analýza na přítomnost mutací v jedenácti oblastech pěti genů: KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA, APC. Následně byl pro každý adenom na základě námi vyvinutého postupu zohledňujícího počet a procentuální zastoupení jednotlivých somatických mutací stanoven stupeň jejich heterogenity. Výsledky: Molekulárně-genetická analýza ukázala výraznou heterogenitu analyzovaných adenomů, a to jak podle počtu mutací, tak i v zastoupení mutací mezi jednotlivými částmi v rámci jednoho adenomu. Více než polovina z analyzovaných adenomů měla ≥ 2 mutace, čtvrtina z celkového počtů měla 3–4 mutace. Rozdělení adenomů na stupnici heterogenity I–V bylo rovnoměrné. Ve všech adenomech s mutací kromě jednoho byla detekována mutace min. v jednom z protoonkogenů KRAS nebo BRAF. Ve všech případech, kdy byla mutační změna detekována v obou těchto genech, došlo k vývoji metachronních adenomů během jednoho roku po odstranění první léze. Závěr: Určené mutační profily adenomů vykazují velkou heterogenitu, která může mít vliv na riziko vzniku metachronních lézí. Předpokládáme, že určování stupně heterogenity u velkých adenomů má potenciál pro přesnější prognózu rekurence a zlepšení medicínské péče o pacienty.

Podpořeno z projektu Ministerstva zdravotnictví ČR s reg. č. 17-31909.

Transkriptomové profilování meningiomů – nové biomarkery a patogeneze onemocnění

Slavík H.1, Řehulková A.1, Zavadil Kokáš F.2, Slavkovský R.1, Balik V.1, Srovnal J.1, Štefanová H.3, Blumová B.3, Hajdúch M.3

1 Ústav molekulární a translační medicíny, LF UP a FN Olomouc, 2 RECAMO, MOÚ, Brno, 3 Ústav molekulární a translační medicíny, LF UP a FN Olomouc

Úvod: Meningiomy představují asi 20 % všech intrakraniálních nádorů a jejich rychlost růstu je velmi variabilní. I některé benigní formy mohou navzdory radioterapii rychleji růst a v pozdější fázi progredovat. Biomarkerů, které by rozlišily agresivnější meningiomy a umožnily predikci jejich biologického chování, je v současné klinické praxi nedostatek. Materiál, metody a pacienti: RNA byla získána ze 70 FFPE vzorků meningiomů s různými klinickými charakteristikami. Knihovny cDNA pro NGS byly připraveny za použití kitu TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit s RiboZero Gold – sada A (Illumina) a sekvenovány na HiSeq 2500 (Illumina). Diferenciálně exprimované mRNA a lncRNA byly vyhodnoceny na hladině q ≤ 0,050 a logFC ≥ 2 nebo ≤ 2 mezi studovanými podskupinami (pohlaví, rekurentní stav, stupeň WHO a lokalizace nádoru). Vybrané markery byly validovány na nezávislé kohortě pacientů. Výsledky a závěry: Mezi pohlavími bylo nalezeno patnáct diferenciálně exprimovaných mRNA a 59 lncRNA, tyto výsledky vykazují nejpřesnější hierarchické shlukování a nejviditelnější změny mezi všemi porovnáními. Mezi různými WHO grady je však nejvyšší počet deregulovaných transkriptů. Rovněž existují silné deregulace mezi rekurentními a nerekurentními pacienty v primárních nádorech (deregulace 69 mRNA a 108 lncRNA). Nejčastější překryvy jednotlivých diferenciálně exprimovaných genů jsou mezi podskupinami recidivy a WHO gradu. Diferenciální genová exprese mezi určitými skupinami vzorků může odhalit podrobnější pohled na patogenezi meningiomů, a tím přispět k zpřesnění prognózy a predikce terapeutického výsledku.

Projekt byl finančně podpořen granty IGA_LF_2019_003, AZV 15-29021A a CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000868.

Detekce dvojí spontánní neoplastické proliferace u plynového měchýře halančíků

Součková K.1, Dyková I.2, Blažek R.3, Žák J.3, Bystrý V.1, Jasík M.1, Reichard M.3, Slabý O.4

1 CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno, 2 Ústav botaniky a zoologie, PřF MU, Brno, 3 Ústav biologie obratlovců AV ČR, v.v.i., Brno, 4 Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ, Brno; CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno

Afričtí halančíci (řád Cyprinodontiformes) jsou drobné anuální ryby, jejichž délka života je geneticky naprogramována na pouhých pár měsíců. V současné době jsou považováni za obratlovce s vůbec nejkratším životním cyklem, které lze chovat v kontrolovaných laboratorních podmínkách. Vedle již léty osvědčených modelových organizmů, jako jsou myš a dánio pruhované, halančíci nacházejí své místo ve studiu procesů souvisejících se stárnutím organizmu vč. neoplastické transformace. V této práci jsme se věnovali detekci a detailnímu popisu spontánních neoplazií halančíků. Na jejich nadprůměrně častý výskyt již upozornilo několik prací, charakteristika lézí však ve většině případů chybí. Histopatologickou analýzu makroskopicky zjevných změn v orgánech dutiny břišní jsme zaměřili i na plynový měchýř, životně důležitý hydrostatický orgán ryb. U několika jedinců jsme diagnostikovali spontánní adenokarcinom žlázy plynového měchýře. Souběžně s neoplastickou proliferací žlázových buněk plynového měchýře jsme zejména u stárnoucích jedinců zaznamenali i neoplastickou proliferaci krvetvorné tkáně ledvin a zvýšený výskyt hemoblastů v orgánech dutiny tělní i ve vlastní dutině plynového měchýře. Naším dlouhodobým cílem je využít halančíky jako modelový organizmus pro biomedicínský výzkum věkem podmíněné spontánní karcinogeneze.

Výzkum byl finančně podpořen grantovými projekty GAČR 19-20873S, CEITEC 2020 (LQ1601) a RVO (MOÚ, 00209805).

Studium efektu kreatininu na stanovení sarkosinu v moči

Staňková M.1, Všetičková M.1, Tóthová Z.1, Uhlířová D.1, Noguera M.2, Kepinska M.3, Parák T.4, Ruttkay Nedecký B.5, Kizek R.1

1 Prevention Medicals s. r. o., Brno, 2 Faculty of Pharmacy and Food Sciences, Barcelona, Španělsko, 3 Wroclaw Medical University, Wroclaw, Polsko, 4 Oddělení klinických laboratoří, Nemocnice Milosrdných bratří, Brno, 5 Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Východiska: Pro rychlou diagnostiku zhoubných nádorů jsou intenzivně hledány nové markery. Kreatinin je aminokyselinou v buněčném metabolizmu svalových buněk. Biosyntéza kreatininu je konstantní, kreatinin přechází do krve a je následně vylučován močí. Hladina kreatininu je sledována pro posouzení funkce ledvin, ale byla zjištěna asociace k zhoubným nádorům (jater, hlavy a krku, prsu a další). Dalším potenciálním nádorovým markerem by mohla být aminokyselina sarkosin (SAR) v moči. Cílem této práce bylo posouzení efektu zvýšeného množství kreatininu na detekci SAR v moči. Materiál a metody: Artificiální moče byly připraveny podle publikovaných protokolů. Pro chemickou analýzu moči byl použit analyzátor Mindray BS300. Mixed Urine 11 byla připravena smísením močí dobrovolníků (n = 5). Hladina SAR byla analyzována reakcí na destičkovém fotometru po dobu 30 min. Výsledky: Byly sledovány změny signálu SAR (25 µmol/l) v močích (AU-N0, AU-N, AU-7/0, AU-7 a Mixed Urine 11). Každá z uvedených močí byla obohacena o kreatinin v rozsahu (0, 5, 10, 15, 25, 40, 50, 60, 75, 90 a 100 mmol/l). Průměrná lineární závislost signálu kreatininu v testovaných močích byla popsána rovnicí: y = 0,091x + 0,0405 (r = 0,9960), QC 12,76 %, RSD 13,83 %. V rozsahu nižších koncentrací kreatininu (0, 5, 10, 15 mmol/l) byla závislost signálu lineární (r = 0,9955), RSD 12,62 %, QC 12,41 %, LOD (0,83) a LOQ (2,75) mmol/l. Zjistili jsme, že směrnice přímek absorbance na koncentraci kreatininu v testovaných močích byly podobné. V přítomnosti SAR nebyl pozorován žádný efekt na směrnice přímek kreatininu (r = 0,999). Při korelační analýze kreatininu/−SAR, kreatininu/+SAR byla získána velmi dobrá korelace (r = 0,999). Při sledování signálu SAR (25 µmol/l) v závislosti na rostoucí koncentraci kreatininu (0–100 mmol/l) byly pozorovány v AU-N0 nevýznamné změny v trendu signálu (r = 0,21 a r = 0,02); v AU-N0 (r = 0,30 a r = 0,39); v AU-7/0 (r = 0,54 a r = 0,44); AU-7 (r = −0,49 a r = −0,34) a v Mixed Urine byl klesající trend nejvýraznější (r = −0,65 a r = −0,44). Všechny sledované změny byly statisticky nevýznamné. Při hodnocení získaných dat signálu SAR v regulačním diagramu bylo 90 % hodnot v pásu 1 SD. Závěr: Byly detailně analyzovány vzorky močí obohacených kreatininem a SAR. Získané signály kreatininu nebyly SAR ovlivněny. Dále jsme zjistili, že zvýšené množství kreatininu neruší stanovení SAR v moči.

Literatura: [1] Nishimura G et al. Int J Clin Oncol 2007; 12 (2): 120–124. [2] Montgomery MJ et al. Ther Drug Monit 2000; 22 (6): 695–700. [3] Limquiaco JL et al. J Gastroenterol Hepatol 2009; 24 (1): 63–69. [4] Kent R et al. Kidney Int 2017; 91 (3): 761–762.

Práce byla financována projekty Liga proti rakovině Praha 273/2019.

Fibroblastový aktivační protein – možný terapeutický a diagnostický cíl v mikroprostředí glioblastomu

Šedo A.1, Bušek P.2, Křepela E.2, Mateu R.2, Vaníčková Z.3, Šácha P.4, Konvalinka J.4

1 Ústav biochemie a experimentální onkologie 1. LF UK v Praze, 2 Ústav biochemie a experimentální onkologie, 1. LF UK, Praha, 3 Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky, 1. LF UK a VFN v Praze, 4 Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i., Praha

Glioblastom představuje nejčastější primární mozkový nádor u dospělých. Je typický vysoce infiltrativním růstem a fatální prognózou. Kromě transformovaných gliálních buněk různého stupně diferenciace, vč. gliomových kmenových buněk, obsahuje „ekosystém“ glioblastomu řadu dalších buněčných populací, vč. pericytů a dalších stromálních mezenchymálních buněk, buněk imunitního systému a endoteliálních buněk. Vzájemné interakce mezi těmito buněčnými typy v nádorovém mikroprostředí zásadním způsobem ovlivňuje chování nádoru. Fibroblastový aktivační protein (FAP), proteáza typicky exprimovaná fibroblasty asociovanými s nádorem, může své biologické funkce vykonávat jednak štěpením strukturálních nebo regulačních proteinů nebo nehydrolytickými mezimolekulárními interakcemi s dalšími proteiny. Naše výsledky prokázaly zvýšenou expresi FAP zejména v mezenchymálním subtypu glioblastomu, kde byl FAP přítomen jak v gliomových, tak i ve stromálních buňkách, přičemž kondiciovaná kultivační média z těchto FAP exprimujících stromálních buněk zvyšovala migraci gliomových a endoteliálních buněk. FAP gen představuje jeden z cílů signalizace transformujícího růstového faktoru beta (TGF-). Proto jsme ověřili, zda může TGF-1 ovlivňovat expresi FAP v glioblastomu. Koncentrace TGF-1 v glioblastomech pozitivně korelovala s FAP. TGF-1 dále několikanásobně zvyšoval enzymovou aktivitu FAP gliomových buňkách, pericytech a primárních endoteliálních kulturách, zatímco v gliomových kmenových buňkách působil zvýšení zanedbatelné nebo žádné. Inhibitory TGFR zabránily TGF-1-indukovenému vzestupu FAP enzymové aktivity a rovněž snižovaly bazální FAP enzymovou aktivitu v gliomových buňkách. Tyto výsledky svědčí pro podíl autokrinní signalizace TGF- v regulaci exprese FAP. V současnosti optimalizujeme specifické na FAP cílené PET sondy a hydroxypropylmetakrylátové kopolymery (iBodies) pro neinvazivní vizualizaci nádorů exprimujících FAP a pro dopravu „karga“ do jejich tkáně. Naše výsledky přispěly k pochopení mechanizmů vedoucích ke zvýšené expresi FAP v glioblastomech a podporují koncept jeho využití jako molekulárního cíle pro diagnostické či terapeutické účely.

AZV grant 15-31379A, MŠMT OP VVV CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000785 Centrum nádorové ekologie, Progres Q28/1LFUK, a LM2015064 EATRIS-CZ.

Regulation of stress response in cancer cells

Šimončík O.1, Müller P.2, Vandová V.1, Vojtěšek B.2, Křivánková K.2

1 MOÚ, Brno, 2 RECAMO, MOÚ, Brno

Malignant transformation is associated with increased demands on the maintenance of protein homeostasis. Heat shock response represents fundamental homeostatic mechanism constitutively activated in cancer cells. Under physiological conditions, the major mediator HSF1 is kept in inactive monomeric form by chaperones. The stress conditions, common in advanced cancer, lead to HSF1 activation. HSF1 is assembled in trimers that bind DNA and activate transcription. The activation of HSF1 also leads to formation of characteristic chromatine structures known as nuclear stress bodies (NSBs). Although heat shock response has been extensively studied, key aspects governing HSF1 activation remain a mystery. It is unclear whether HSF1 functions as a stand-alone stress sensor, or serves as a node integrating various cellular signalling pathways. Important for unveiling the mechanism of HSF1 activation are the findings of conditions that inhibit its activation. While the heat shock response is well manifested in metabolically active cells, HSF1 activation is restricted in nutritionally deprived cells. This was also documented in recent work showing inhibition of HSF1 by inhibitors of mTOR signaling and by AMPK activation. Altogether, the data point to the importance of total protein load for HSF1 activation. Therefore, we considered the phenomenon of macromolecular crowding to explain the global effect of protein load on HSF1 conformation. We used fluorescent microscopy to study NSBs and BN PAGE or crosslinking for conformational studies. We mimicked the crowded environment by using HSP90 inhibition and proteasome inhibition leading to protein misfolding and accumulation. Then we used protein synthesis inhibitors to prevent this effect. We also used mTOR inhibitors whose impact on molecular crowding is already known. By using cancer cell line expressing fluorescently labeled HSF1 we observed that HSF1 is localized mainly in the nucleus and in response to enhanced crowding it forms NSBs. This effect was diminished by co-treatment of cells with protein synthesis inhibitors. We also observed the conformational changes of monomeric HSF1 by modulating the intracellular crowding. In this case, reduced crowding prevents initial steps of HSF1 activation despite persisting stress. We propose that conformational changes of HSF1 are primarily driven by physical conditions that determine the state with the lowest Gibbs free energy.

Popodřeno Evropský fond pro regionální rozvoj – ENOCH (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000868), GAČR 19-03796S and MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).

Mutace v genu PIK3CA u pacientů s karcinomem kolorekta a prsu v České republice

Šimová J.1, Urbanovská I.1, Vaňáková K.1, Smolíková M.1, Konvalinka D.1, Žmolíková J.1, Pitronová S.1, Dvořáčková J.1, Drábek J.2, Uvírová M.1

1 CGB laboratoř a. s., Ostrava, 2 Ústav molekulární a translační medicíny, LF UP v Olomouci

Východiska: Genetické profilování tumoru a testování vybraných molekulárních markerů je v současné době v klinické praxi rutinní záležitostí u mnoha typů nádorů. Fosfatidyl-3-kinázy (PI3K) jsou rodinou lipidových kináz zapojených do mnoha buněčných procesů vč. růstu buněk, proliferace, diferenciace, pohyblivosti a přežití. Somatické mutace v genu PIK3CA se vykytují u řady různých typů nádorů. V současnosti, vzhledem k vývoji nových léčiv, nabývá na významu i testovaní tohoto biomarkeru. Soubor pacientů a metody: V letech 2008–2019 bylo vyšetřeno 2 207 vzorků kolorektálních karcinomů a 342 vzorků karcinomů prsu. Analýza somatických mutací v PIK3CA genu ve vybraných kodonech v exonu 9 (kodony 542, 545) a exonu 20 (kodon 1047) byla provedena metodou extenze primeru. Výsledky: Mutace v genu PIK3CA byly detekovány u 11,8 % (260/2 207) případů karcinomů kolorekta a u 26 % (89/342) případů karcinomu prsu. Byla provedena statistická analýza korelace mezi vybranými klinicko-patologickými parametry a výskytem mutací v PIK3CA genu. U podskupiny pacientů s kolorektálním karcinomem léčených inhibitory angiogeneze nebyla nalezena významná souvislost mezi přítomností mutací v PIK3CA genu a přežitím bez progrese (PFS) či celkovým přežitím (OS). U podskupiny pacientů s HER2 pozitivním karcinomem prsu léčených trastuzumabem měli pacienti s aktivačními mutacemi v PIK3CA kratší přežívání bez relapsu (RFS) než případy bez mutací v PIK3CA genu. Závěr: Frekvence mutací v PIK3CA genu v našem souboru koreluje s literárními údaji. Vzhledem k tomu, že byla nedávno FDA schválena nová léčebná strategie u pacientů s HR+/HER2− pokročilým nebo metastatickým karcinomem prsu a mutací PIK3CA genu, lze předpokládat zavedení testování mutací v tomto genu do rutinní klinické praxe.

Podpořeno z AZV ČR, No. 16-32198A: Genetické a epigenetické prediktivní biomarkery úspěšnosti léčby inhibitorů angiogeneze u kolorektálního karcinomu.

Hydrogelové nosiče pro transsklerální dopravu léčiv do očního bulbu při léčbě retinoblastomu

Širc J.1, Cocarta A.1, Hobzová R.1, Švojgr K.2, Kodetová M.3, Pochop P.3, Uhlík J.4

1 Ústav makromolekulární chemie AV ČR v. v. i., Praha, 2 Klinika dětské hematologie a onkologie, 2. LF UK a FN Motol, Praha, 3 Oční klinika dětí a dospělých 2. LF UK a FN Motol, Praha, 4 Ústav histologie a embryologie, 2. LF UK a FN Motol, Praha

Retinoblastom je nejčastějším maligním primárně intraokulárním karcinomem u dětí. Systémové podávání chemoterapeutik je spojeno s relativně nízkou účinností a vysokým rizikem sekundárních malignit a dalších závažných vedlejších účinků. Lokální aplikace protinádorových léčiv do očního bulbu pomocí hydrogelového implantátu umístěného na zadní oční segment může zvýšit koncentraci a prodloužit účinek léku na cílové buňky nádoru. Hydrogelový implantát se skládá ze dvou vrstev – vnitřního hydrofilního rezervoáru uvolňujícího léčivo, které difunduje přes skléru do očního bulbu, a vnější hydrofobní vrstvy chránící okolní vaskularizovanou tkáň před cytotoxickým účinkem. Hydrofilní chemoterapeutika s nízkou molekulovou hmotností, jako je topotekan a vinkristin, snadno pronikají přes skléru a lze je účinně dopravit pomocí hydrogelů na bázi metakrylátů. Uvolňování léčiva může být řízeno stupněm zesíťování hydrogelu a přítomností různých funkčních skupin v hlavním řetězci polymeru. Vnější hydrofobní vrstva tvoří účinnou bariéru chránící okolní citlivou tkáň. Dlouhodobá biologická aktivita hydrogelových implantátů s obsahem léčiva byla potvrzena pomocí in vitro experimentů na buněčných liniích lidského Rb a testem na chorioalantoidní membráně. Farmakokinetika byla testována pomocí in vivo experimentů na králičím modelu.

Kokultura triple negativní metastatické nádorové linie prsu s endoteliálními buňkami zajišťuje větší odolnost vůči léčbě inhibitory tyrosinkináz

Šmídová V.1, Kwak J.2, Heger Z.1

1 Ústav chemie a biochemie, Mendelova univerzita v Brně, 2 Ajou University School of Medicine, Suwon, Jižní Korea

Invazivní nádorové onemocnění prsu je závislé na angiogenezi, která je velmi důležitým faktorem pro nádorový růst a metastazování [1]. Proto bylo naším cílem zkoumat efekt společné kultivace s endoteliálními buňkami na chování triple negativní metastatické nádorové buněčné linie. Jelikož však planární nádorové modely postrádají dimenzionalitu a nemohou vhodně simulovat mikroprostředí nádoru [2], použili jsme chloroform polykaprolaktonovou (C-PCL) nanovláknovou membránu. Pro otestování trojrozměrných kultivačních podmínek jsme použili protinádorové léčivo – inhibitor tyrosinkináz vandetanib. C-PCL membrány byly připraveny metodou elektrostatického zvlákňování, poté byly připevněny k povrchu kultivačních nádob a použity pro kultivaci buněk. Prsní nádorová linie MDA-MB-231 byla použita samostatně nebo v kombinaci s endoteliálními buňkami linie EA.hy926 či HUVEC v poměru 1: 10 (endoteliální: nádorové). Provedli jsme testy viability, test migrační aktivity nádorových buněk při nepřímé kokultuře s endoteliálními buňkami, vizualizaci buněk immunocytochemickým barvením a měření koncentrace vaskulárního endoteliálního faktoru (VEGF) jako angiogenního faktoru. Naše experimenty ukázaly, že endoteliální buňky podporují růst buněk nádorových. Buňky v kokultuře měly invazivnější charakter, a vandetanib na ně neměl tak velký účinek jako na buňky v monokultuře. Kokultura totiž poskytuje lepší podmínky pro růst a invazivitu nádorových buněk [3]. Již po jednom dni kokultivace měly nádorové buňky méně stresových vláken a vřetenovitý tvar. Po inkubaci s vandetanibem a epidermálním růstovým faktorem buňky získaly plochý, rigidní tvar s viditelnými stresovými vlákny na povrchu, což značí omezení invazivity buněk. Vandetanib bez přidání EGF neměl tak výrazný efekt. Po inkubaci s vandetanibem byla také snížena sekrece VEGF nádorovými buňkami v monokultuře i v kokultuře. Závěrem tedy bylo zjištěno, že prsní nádorové buňky byly více invazivní a životaschopné při společné kultivaci s endoteliálními buňkami. Buňky pěstované v C-PCL 3D podmínkách měly sice pomalejší růst, ale měly také odlišnou morfologii od buněk ve 2D a ukázaly nižší citlivost vůči léčivu vandetanibu.

Literatura: [1] Uzzan B et al. Cancer Res 2004; 64 (9): 2941–2955. [2] Le BD et al. Nanomaterials (Basel) 2018; 8 (2): 64. [3] Zhang W et al. FASEB J 2018; 32 (1): 276–288.

Práce byla podpořena projektem GAČR (18-10251S).

Vliv RNA interference na expresi genů zapojených do metabolizmu sarkosinu

Šubrtová H.1, Šplíchal Z.2, Heger Z.2

1 Mendelova univerzita v Brně, 2 Ústav chemie a biochemie, Mendelova univerzita v Brně

Sarkosin je neproteinogenní aminokyselina, která je intenzivně studována v souvislosti s nádorovými onemocněními prostaty. Metabolizmus této aminokyseliny je v buňce řízen čtyřmi hlavními enzymy. Vznik sarkosinu může katalyzovat glycin N-metyltransferasa (GNMT) z glycinu, nebo dimethylglycin dehydrogenáza (DMGDH) z dimetylglicinu. Oxidativní demethylaci sarkosinu na glycin potom zprostředkovává sarkosin dehydrogenáza (SARDH) a sarkosin oxidáza (PIPOX). Práce se zabývá studiem změn v genové expresi uvedených enzymů po cílené RNA interferenci proti SARDH u vybraných nádorových i nenádorových prostatických buněčných liniích. RNA interference, zprostředkovaná pomocí malých interferujících RNA (siRNA), cílených proti SARDH, byla provedena u dvou nádorových (DU-145 a PC3) a jedné nenádorové (PNT1A) buněčné linie. siRNA byla do buněk vpravena prostřednictvím transfekčního činidla na bázi lipidů. Účinnost transfekčního protokolu byla ověřena s použitím fluorescenčně značené siRNA (siFAM) a jejího vyhodnocení pomocí fluorescenčního mikroskopu. Po 48 hod od provedení transfekce byla z buněk izolována RNA, která byla reverzní transkripcí přepsána do cDNA. Samotné změny v genové expresi byly nakonec analyzovány metodou kvantitativní PCR a statisticky vyhodnoceny. Zvolený transfekční protokol vykazoval až 70% efektivitu internalizace použité siFAM do buněk. Nejvyššího útlumu genové exprese SARDH, po aplikaci siRNA cílené proti tomuto genu, se podařilo dosáhnout u nenádorové buněčné linie, a to celkem 52 %. Naopak nejnižšího útlumu bylo dosaženo u nádorové buněčné linie DU-145, zde však byly pozorovány nejvýraznější rozdíly v expresi dalších genů kódujících klíčové enzymy sarkosinového metabolizmu. Konkrétně došlo k signifikantnímu nárůstu exprese genů PIPOX a DMGDH. Vliv RNA interference byl studován pomocí metody kvantitativní PCR. Nádorová buněčná linie DU-145 vykazovala po aplikaci siRNA cílené proti genu SARDH signifikantní nárůst exprese genů PIPOX a DMGDH. Oba tyto geny kódují enzymy, jež jsou schopny degradace sarkosinu na aminokyselinu glycin.

Analýza potenciálních nádorových markerů karcinomu prostaty v moči

Tóthotová Z., Uhlířová D., Staňková M., Všetičková M., Růžička J., Kizek R.

Prevention Medicals s. r. o., Brno

Východiska: Včasná diagnostika karcinomu prostaty (CaP) zahrnuje rektální vyšetření a testování hladiny prostatického specifického antigenu (PSA). Hladiny PSA u pacientů s CaP byly statisticky hodnoceny v řadě studií. Bylo zjištěno, že PSA nemusí striktně souviset pouze s CaP. Zvýšenou hladinu může způsobit hyperplazie prostaty, prostatitida nebo jiné poškození prostaty. Pro přesnější diagnostiku je nezbytné hledat další biomarkery. Jako slibní kandidáti se jeví metalothionein (MT), Caveolin-1, p53, miRNA nebo sarkosin (SAR). V případě MT byla zaznamenána jeho zvýšená hladina právě při CaP, prsu, ledvin, jater, plic aj. U proteinu Caveolin-1 byla zvýšená hladina pozorována u agresivních forem CaP. Ukazuje se, že aminokyselina SAR je velmi slibným kandidátem jako nádorový marker v moči. Cílem práce bylo statisticky vyhodnotit dostupná literární data o hladině SAR v moči. Výsledky: Z databáze Web of Science, MEDLINE, BIOSIS, SciELO byly za využití klíčových slov: „prostate cancer, marker“ vyhledány dostupné literární záznamy 1945–2020 v počtu 18 487. Při zadání klíčových slov do názvu studie bylo vyhodnoceno 34 článků. Hodnotili jsme, které markery mají potenciál být využity v klinické praxi. Zjistili jsme, že MT, p53, KLK3, HOXC4, DLX1, SAR, miRNA měly vztah k CaP. Ve studiích byly markery určovány z krve, moči a tkáně. Data ve studiích vykazovala značnou heterogenitu jak v získávání probandů, použitých analytických technik, vyhodnocení získaných výsledků a jejich interpretace. Pro uvedené molekuly však bylo k dispozici velmi málo dostupných dat. V další analýze jsme se zaměřili především na analýzu SAR v moči (n = 55 studií). I přes výše uvedené byla data statisticky hodnocena metaanalýzou (11 studií). Pouze jedna studie (studie 6) prokázala sníženou hladinu SAR u pacientů s CaP a ostatní studie prezentovaly zvýšenou hladinu SAR u CaP. Studie 8 ukázala velmi významný rozdíl mezi kontrolou a CaP. Do metaanalýzy bylo zařazeno 818 probandů s potvrzeným CaP a 760 kontrolních probandů. Bylo zjištěno, že hladina SAR v moči je zvýšená u CaP (test celkového efektu: Z = 9,6933, P = 0,00000, vysoce významný; heterogenita: df = 10, Q (²) = 162,48, P = 0,00000, I2 (%) = 93,85, vysoká, Tau2 (²) = 0,5599). Jak ukázala získaná data, pro posouzení SAR jako nádorového markeru bude nezbytné uspořádat podrobnou plošnou studii. Závěr: Metaanalýzou dostupných dat byla zjištěna statisticky významná odlišnost mezi hladinou SAR u kontrolní skupiny a u pacientů s CaP.

Práce byla realizována za podpory projektu SarkoTest 165/2015 a The European Technology Platform for Nanomedicine.

Stanovení sarkosinu v artificiální a reálné moči jako potenciálního markeru zhoubného nádoru prostaty

Uhlířová D.1, Tóthová Z.1, Staňková M.1, Všetičková M.1, Ruttkay Nedecký B.2, Kizek R.1

1 Prevention Medicals s. r. o., Brno, 2 Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Východiska: Sarkosin (SAR) je aminokyselina, která je studována jako potenciální marker zhoubného nádoru prostaty a dalších onemocnění. Běžně je obsažena ve svalovině, dalších tělesných tkáních a tekutinách. Kromě toho je SAR využíván v léčbě schizofrenie. Cílem této práce bylo optimalizovat referenční metodu pro stanovení SAR v biologickém vzorku, především v moči. SAR byl stanoven iontově výměnnou kapalinovou chromatografií (IEC) s postkolonovou derivatizací ninhydrinem. Materiál a metody: Pro analýzu SAR jsme použili analyzátor AAA500 od firmy Ingos. Separace probíhala ve skleněné koloně s ionexem. Průtok mobilní fáze byl 0,25 ml/min a průtok ninhydrinu byl 0,2 ml/min. Teplota reaktoru byla nastavena na 131 °C. Nástřik vzorku do mobilní fáze byl 200 µl. Pro analýzu byla použita umělá moč AU-7 a vzorek Mixed Urine (n = 6). Vzorky byly upravovány HCl na požadované pH a následně přefiltrovány přes membránový filtr. Výsledky: Separované aminokyseliny reagují s ninhydrinem obsaženým v detekčním činidlu. Vzniklý produkt je stanoven detektorem při 440 nm. Metoda byla optimalizována na detekci SAR (0, 2, 5, 10, 25, 50 a 100 µmol/l) v ultračisté vodě. Bylo možné stanovit SAR s LOD 1,7 µmol/l a LOQ 5,7 µmol/l. V případě analýzy SAR v pufru (72,9 mmol/l kyselina citronová, 196,8 mmol/l NaCl a 0,5% thiodiglykol) byly limity SAR asi 3× nižší (LOD je 0,5 µmol/l a LOQ 1,8 µmol/l). Při použití umělé moči AU-7 jsme testovali stanovení sarkosinu v pH 6 (neupravený roztok) a v pH 2. Při pH 6 byl LOD 6,0 µmol/l a LOQ 19,7 µmol/l. pH 2 jsme vybrali podle elučního pufru, ten má pH kolem 2–2,2. V případě, že vzorek byl upraven na pH 2, došlo k mírnému zlepšení limitů na LOD 3,9 µmol/l a LOQ 12,9 µmol/l. U Mixed Urine byly vzorky upraveny (HCl) na pH 2,0; 2,1 a 2,2. V těchto vzorcích jsme přidali SAR o koncentracích 62,5; 31,3; 15,6; 7,8; 3,9 a 0 µmol/l. Návratnost signálu SAR se pohybovala v rozmezí 95–105 %. Při pH 2,0 byla nejnižší koncentrace SAR, kterou bylo možné analyzovat 7,8 µmol/l. Limity byly určeny LOD 14,2 µmol/l a LOQ 46,8 µmol/l. Při pH 2,1 byla nejnižší koncentrace, kterou bylo možné spolehlivě určit 3,9 µmol/l. Limity byly stanoveny LOD 10,9 µmol/l a LOQ 35,9 µmol/l. Při pH 2,2 byla nejnižší koncentrace, kterou bylo možné spolehlivě určit, 15,6 µmol/l. Limity stanovení SAR byly určeny LOD 73,0 µmol/l a LOQ 241,2 µmol/l. Závěr: Vyvinuli jsme citlivou metodu pro stanovení SAR pomocí IEC. LOD byly v ultračisté vodě do 2 µmol/l, v pufru až 0,5 µmol/l a ve vzorku moči kolem 10 µmol/l sarkosinu.

Práce byla financována projektem SARKO TEST 165/2016.

Sledovanie alostérických zmien proteínu HDM2 u fosfomimetického mutanta S395D

Uhrík L.1, Hároniková L.1, Wang L.2, Chen S.2, Vojtěšek B.3, Fåhraeus R.4, Hernychová L.3, Olivares-Illana V.5

1 MOÚ, Brno, 2 Department of Medical Biosciences, Umeå University, Sweden, 3 RECAMO, MOÚ, Brno, 4 Équipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, Université Paris, France, 5 Laboratorio de Interacciones Biomoleculares y cáncer. Instituto de Física Universidad Autónoma de San Luis Potosí, Mexico

E3 ubiquitín ligáza HDM2 (human double minute 2) má zásadnú úlohu v regulácii bunkového cyklu a vývoji onkogenézy. Najznámejšou funkciou tohto proteínu je regulácia hladiny tumor supresorového proteínu p53. Za normálnych podmienok pôsobí HDM2 ako negatívny regulátor p53, ubiquitinuje ho a ten je následne degradovaný proteazómom. V prípade bunkového stresu, napr. pri poškodení DNA, dochádza k aktivácii kinázy ATM (ataxia telangiectasia mutated), ktorá fosforyluje HDM2 v pozícii serínu 395. Touto fosforyláciou je spustená funkcia HDM2 ako pozitívneho regulátora p53, kedy HDM2 viaže p53 mRNA a podporuje jej transláciu. Toto prepnutie HDM2 z pozitívneho na negatívny regulátor proteínu p53 zatiaľ nebolo zo štruktúrneho hľadiska preskúmané. V našej štúdii sme sa zamerali na štruktúrne zmeny vyvolané fosforyláciou HDM2 v mieste S395. Využili sme metódu vodík-deutériovej výmeny (HDX) spojenej s hmotnostnou spektrometriou k porovnaniu wild-type proteínu (HDM2-wt) a proteínu mutovanom v pozícii serínu 395 (HDM2-S395D), ktorý napodobňuje fosforyláciu v tejto pozícii. E3-ligázová aktivita proteínu HDM2, resp. HDM2-S395D bola sledovaná schopnosťou týchto proteínov ubiquitinovať proteín p53. Výsledky HDX analýzy preukázali štruktúrne odlišnosti medzi HDM2-wt a HDM2-S395D. Zatiaľ, čo v okolí miesta fosforylácie vykazoval proteín HDM2-S395D zníženú hladinu inkorporácie deutéria oproti HDM2-wt proteínu, v oblasti p53 väzbovej domény bol zaznamenaný opačný efekt a teda zvýšenie deuterácie u HDM2-S395D. Testovanie E3-ligázovej aktivity preukázalo, že HDM2-S395D má vyššiu ubiquitinačnú aktivitu voči proteínu p53. Tieto výsledky ukazujú, ako zmena (fosforylácia) v jednej doméne proteínu môže vyvolať zmeny štruktúry v odľahlej doméne a tým regulovať jeho funkciu. Náš výskum bude naďalej zameraný na objasnenie fungovania dráhy p53-HDM2, čo by potom mohlo prispieť k vývoju nových postupov terapie nádorových ochorení.

Táto práca bola podporená projektmi GAČR 19-18177Y a MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).

Studium vlivu zvýšené exprese vybraných dlouhých nekódujících RNA na klonogenicitu glioblastomových buněk

Večeřa M.1, Lipina R.2, Smrčka M.3, Jančálek R.4, Hendrych M.5, Hermanová M.5, Křen L.6, Šána J.7, Slabý O.7

1 CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno, 2 Neurochirurgická klinika, LF UO a FN Ostrava, 3 Neurochirurgická klinika, LF MU a FN Brno, 4 Neurochirurgická klinika, LF MU a FN u sv. Anny v Brně, 5 I. ústav patologie, LF MU a FN u sv. Anny v Brně, 6 Ústav patologie, LF MU a FN Brno, 7 CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno; Ústav patologie, LF MU a FN Brno; Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ, Brno

Východiska: Glioblastom (GBM) je primární intrakraniální nádor mozku s původem v astrocytech, charakterizovaný nejvyšší frekvencí výskytu ze všech gliomů, vysokou malignitou a velmi nepříznivou prognózou. Medián celkového přežívání pacientů je i navzdory konvenční léčbě pouze 12–16 měsíců od určení diagnózy, proto je mimořádně důležité identifikovat nové terapeutické cíle. Vhodnými kandidáty mohou být dlouhé nekódující RNA (lncRNA), jejichž role v regulaci genové exprese již byla popsána v kontextu fyziologických i patofyziologických procesů. V rámci naší studie jsme se zaměřili na lncRNA LINC00632 a LINC00634 s doposud neznámou funkcí v GBM, jejichž patologicky sníženou expresi v GBM jsme v minulosti odhalili pomocí NGS a validovali s využitím qRT-PCR. Materiál a metody: LINC00632 a LINC00634 byly samostatně transfekovány jako součást plazmidového konstruktu EF1ap-lncRNA-SV40-eGFP-IRES-BSD do stabilní GBM linie U251. Buňky, do kterých byl transfekován prázdný vektor, sloužily jako negativní kontrola. Individuální klony pak byly odvozeny dvoukrokovou selekcí s použitím antibiotika blasticidinu S. V prvním kroku a následně metodou FACS s využitím exprese eGFP jako pozitivního markeru stabilního začlenění vložené genetické informace do genomu buněk. Zvýšená exprese obou lncRNA molekul byla analyzována pomocí qRT-PCR a její vliv na schopnost tvořit kolonie byl studován u vybraných klonů se zvýšenou expresí a kontrolních klonů se stejnou morfologií pomocí testu klonogenicity. Výsledky: Signifikantně stabilně zvýšená exprese LINC00632 a LINC00634 v odvozených klonech byla úspěšně validována. Vliv zvýšené exprese obou lncRNA vedoucí ke snížené schopnosti tvořit kolonie v porovnání s kontrolními klony byl pozorován u vybraných klonů s pozměněnou expresí. Závěr: Pozorovali jsme sníženou klonogenicitu u klonů se zvýšenou expresí LINC00632 nebo LINC00634 derivovaných ze stabilní linie U251. Naše studie naznačuje, že tyto lncRNA by mohly sloužit jako slibné terapeutické cíle u GBM.

Tato studie byla vypracována s grantovou podporou MZ ČR AZV – grant č. NV18-03-00398, GAČR – grant č. 17-17636S a MŠMT ČR z projektu CEITEC 2020 (LQ1601).

Využití molekulárního dokování pro identifikaci nových antiestrogenů a popis vztahů mezi jejich strukturou a funkcí

Voňka P.1, Rárová L.2, Bazgier V.2, Berka K.3, Kvasnica M.2, Oklešťková J.2, Kudová E.4, Strnad M.2, Hrstka R.1

1 Regionální centrum aplikované molekulární onkologie, MOÚ, Brno; Laboratoř růstových regulátorů, Centrum regionu Haná pro bio technologický a zemědělský výzkum, Ústav experimentální botaniky AV ČR, v.v.i., a UP v Olomouci, 2 Laboratoř růstových regulátorů, Centrum regionu Haná pro bio technologický a zemědělský výzkum, Ústav experimentální botaniky AV ČR, v.v.i., a UP v Olomouci, 3 Katedra fyzikální chemie, PřF UP v Olomouci, 4 Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i., Praha

Východiska: V případě karcinomu prsu představuje estrogenový receptor alfa (hER) klíčový biomarker tohoto onemocnění, neboť jeho přítomnost či nepřítomnost se významně promítá jak do prognózy onemocnění, tak i způsobu léčby. hER je aktivován vazbou ligandu. Poté je translokován do jádra, kde spouští transkripci cílových genů. hER tedy představuje velmi důležitý cíl protinádorové léčby. Předmětem této studie je najít vhodné ligandy pro hER. Důvodem je skutečnost, že mnohé z těchto látek mohou vykazovat i protinádorové účinky. Materiál a metody: Pomocí dokování byly z přibližně 3 000 steroidních sloučenin vybrány látky, které potenciálně interagují s hER. Jejich účinek byl experimentálně posouzen jednak pomocí MTT (3[4,5 dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyl tetrazolium bromid) testu a dále pak imunochemicky na buněčné linii MCF-7. Především pak byl vliv analyzovaných sloučenin studován vzhledem k aktivitě hER pomocí luciferázového reportérového testu, který byl za tímto účelem vyvinut. Výsledky: Pomocí dokování bylo vybráno 20 látek s nejvyšší afinitou k hER. Výsledky validačních testů naznačily, že především látky MU-5562 a MU-5611 mají účinky srovnatelné s již známými inhibitory hER, jako je tamoxifen či fulvestrant. Rovněž aktivita luciferázy v reportérovém testu byla snížená podobně jako u komerčních inhibitorů. Inhibiční efekt těchto látek na hER je pravděpodobně způsoben přítomností dvojné vazby v jejich D kruhu, která vede ke snížení elektronové hustoty na keto skupině. To brání vzniku vodíkových vazeb zodpovědných za změnu konformace  helixu H12, čímž běžně dochází k aktivaci hER. Navíc imunochemická analýza ukázala, že MU-5611 snižuje hladinu hER (podobně jako fulvestrant), což je spojeno se snížením hladiny proteinu AGR2, jehož expresi hER reguluje. Dále jsme zjistili, že tyto látky ovlivňují buněčný cyklus, což je spojeno se zvýšením hladiny proteinu p21, jak potvrdila imunochemická analýza. Rovněž se nám povedlo identifikovat další mechanizmus, kterým tyto látky působí, neboť barvení pomocí JC-1 sondy ukázalo, že dochází k interakci s mitochondriálními strukturami. Závěr: Zvolená kombinace výpočetních a experimentálních metod představuje vhodný a rychlý způsob, jak určit, zda daná látka ovlivňuje aktivitu hER. Možnosti uplatnění neleží pouze na poli výzkumném, ale rovněž je možné je využít i v klinické praxi.

Práce byla podpořena MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805), Strukturálními fondy EU (projekt ENOCH: CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000868), MŠMT (projekt LM2015070), AVČR (RVO: 61388963) a grantem GAČR GA19-01383S.

Studium dynamiky vylučování sarkosinu a metalothioneinu močí

Všetičková M.1, Staňková M.1, Uhlířová D.1, Tóthová Z.1, Banáš D.2, Růžička J.1, Kizek R.1

1 Prevention Medicals s. r. o., Brno, 2 Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Východiska: Zhoubné nádory prostaty mají incidenci 150 a mortalitu 30 na 100 000 obyvatel. Při podezření na nádor patří mezi základní informace určení hladiny prostatického specifického antigenu (PSA) v krvi v kombinaci s vyšetřením per rectum. Senzitivita a specificita vyšetření je stále diskutována. Proto je hledání dalších nádorových markerů potřebné. Sarkosin (SAR), metalothionein (MT) a další potencionální molekuly mohou souviset se zhoubnými nádory prostaty. Cílem práce byla analýza obsahu SAR a MT v moči. Navíc byla určena specifita a senzitivita stanovení SAR/MT, sledována dynamika vylučování SAR do moči. Materiál a metody: Vzorky močí byly analyzovány na Mindray BS300. Mixed Urine byla připravena smísením močí dobrovolníků (n = 5), příp. byla analyzována individuální moč (n = 17). Hladina SAR byla měřena na Varioskan LUX TOP při 572 nm. Elektrochemická analýza MT byla provedena v Brdičkově základním elektrolytu na analyzátoru Metrohm. Výsledky: Sarkosin je rozkládán enzymem sarkosin oxidázou na glycin, formaldehyd a peroxid vodíku, který je stanoven fotometricky. Typická závislost signálu na koncentraci SAR byla lineární (r = 0,999) a v Mixed Urine poskytuje pro SAR LOD 0,5 µmol/l, LOQ 1,5 µmol/l a RSD 0,9 %. Metoda stanovení SAR byla využita pro analýzu v individuální moči (n = 17; vodivost 16 ± 2 mS/cm; močovina 223 ± 12 mmol/l; kreatinin 10 ± 1 mmol/l; pH 6,3 ± 0,2; Na+ 179 ± 15 mmol/l, K+ 34 ± 2 mmol/l, Cl− 98 ± 5 mmol/l). Vzorky byly obohaceny o SAR (0, 6, 10, 15, 20 a 25 µmol/l) a po 30 min byl výsledek hodnocen jako pravdivě pozitivní (TP), falešně pozitivní (FP), pravdivě negativní (TN) nebo falešně negativní (FN). AUC křivky byly od 0,5 do 1 s průměrnou hodnotou 0,84. Kromě toho byla metoda využita pro sledování dynamiky SAR po dobu 7 hod (šest odběrů), aplikace 1 g SAR. Bylo zjištěno, že v čase 0 byla hladina SAR 0,2 ± 0,1 µmol/l/mmol/l kreatininu; 1,5 hod: 722 ± 7,5 µmol/l/mmol/l kreatininu, 3 hod: 599 ± 4,2 µmol/l/mmol/l kreatininu, 4,5 hod: 31 ± 1,5 µmol/l/mmol/l kreatininu, 6 hod: 3,3 ± 0,5 µmol/l/mmol/l kreatininu; 7 hod: 0 ± 0,0 µmol/l/mmol/l kreatininu. MT byl analyzován v moči. Byly pozorovány typické katalytické signály MT v Brdičkově roztoku: RSCo2, Cat1, Cat2 a Cat3. Závěr: V práci byla ověřována metoda pro stanovení SAR v moči. Senzitivita a specificita stanovení SAR byla hodnocena jako dobrá. Byla sledována dynamika přirozeného vyloučení SAR močí. Zjistili jsme, že do 7 hod byl SAR pod LOD. Zavedla se elektrochemická detekce MT v moči.

Práce byla financována projektem SARKOTest 165/2016.

Biomimetické peptidové ligandy pro cílení tropomyozinových receptorových kináz v nanomedicíně neuroblastomu

Životská H., Rex S., Haddad Y., Heger Z.

Ústav chemie a biochemie, Mendelova univerzita v Brně

Práce se zabývá potenciálním využitím speciálně navržených ligandů na bázi biomimetických peptidů v aktivní cílené terapii neuroblastomů za účelem efektivnější a bezpečnější léčby tohoto závažného a vysoce metastazujícího tumoru postihujícího především děti raného věku. Jako prostředek ověřující specifické cílení neuroblastomových buněk byl vybrán biokompatibilní apoferritinový nanotransportér (EcLHFRT) s enkapsulovaným cytostatikem elipticinem (Elli). Za účelem selektivní dopravy Elli do cílových buněk neuroblastomu byla provedena modifikace povrchu EcLHFRT cílícími biomimetickými peptidovými ligandy, vykazující vysokou afinitu vůči tropomyozinovým receptorovým kinázám (TrkA, TrkB, TrkC), exprimovaným na membránách cílových buněk neuroblastomů. Připravené nanotransportéry byly analyzovány z hlediska buněčné internalizace Elli z cílených (EcLHFRT-Elli-peptid) a necílených (EcLHFRT-Elli) nanotransportérů do cílových neuroblastomových buněk (UKF-NB-4, SH-SY5Y) a necílových nemaligních keratocytinocytů (HaCaT). Biomimetické peptidy byly odvozeny buď přímo od tropomyozinových receptorových kináz, nebo od neurotrofinů metodou in silico. Prostřednictvím standardní Fmoc syntézy byly následně syntetizovány peptidy vykazující vysokou afinitu a nízkou vazebnou energii. Připravené nanotransportéry byly nejprve charakterizovány po stránce jejich průměrné velikosti (DLS), hodnoty ζ-potenciálu (Dopplerova mikroelektroforéza), míry opětovného sestavení EcLHFRT struktury (native PAGE) a enkapsulační výtěžnosti Elli (UV/VIS spektrofotometrie). Metodou průtokové cytometrie na základě závislosti fluorescence Elli (a.u.) na době inkubace s buňkami (h) byla kvantifikována internalizace Elli do cílových a necílových buněk. EcLHFRT nanotransportéry disponovaly velikostí okolo 70 nm, průměrnou hodnotou ζ-potenciálu −17,7 mV a optimální výtěžností enkapsulovaného Elli až 82 % (2068,5 µM) při molární koncentraci samotného EcLHFRT 6,23 µM. Kvantifikace buněčné internalizace ukázala vyšší kinetiku cytostatika Elli do cílových neuroblastomových buněk ve srovnání s necílovými nemaligními buňkami. EcLHFRT nanotransportéry s cílícími peptidy a enkapsulovaným Elli dosahovaly vyšší specifické internalizace v cílových buňkách UKF-NB-4 a SH-SY5Y. Toto zjištění je stěžejní pro další nanomedicínský výzkum neuroblastomu, který by mohl vést k zvýšení efektivity léčby a minimalizaci negativních účinků aplikovaného léčiva na biologické prostředí pacienta.

Literatura: [1] Haddad Y et al. Front Mol Neurosci 2017; 10 (20): 7.

Práce byla podpořena grantovým projektem GACR 19-13628S a IGA MENDELU IP_023/2020.