APEX-nový přístup v molekulárně genetické diagnostice Wilsonovy choroby
Autoři:
L. Gojová; E. Jansová; S. Pouchlá; I. Blaháková; L. Fajkusová
Působiště autorů:
Centrum molekulární biologie a genové terapie FN, Brno
Vyšlo v časopise:
Čas. Lék. čes. 2008; 147: 172-173
Kategorie:
Sjezdy
Wilsonova choroba (WD) je závažné autozomálně recesivní dědičné onemocnění s incidencí 1:30 000 (70 000) vyznačující se nadměrným ukládáním mědi v organismu. Příčinou poruchy metabolismu mědi jsou mutace v genu ATP7B kódujícího měď-transportující ATPázu, která se fyziologicky účastní inkorporace mědi do ceruloplazminu a jejího vylučování do žluči.
Do současnosti bylo popsáno již cca 300 mutací v ATP7B genu, většina etnicky specifických. V současné době je molekulárně genetická diagnostika Wilsonovy choroby založena na detekci v populaci nejčastějších mutací restrikčním štěpením a sekvenováním všech 21 exonů ATP7B genu.
S cílem urychlit tento klasický přístup byla na našem pracovišti zavedena nová vyhledávací metoda na bázi oligonukleotidových microarrays. Tato metoda využívá APEX (arrayed primer extension) reakci k detekci mutací v hetero/homozygotním stavu. Kódující oblast ATP7B genu je nejprve amplifikována ve 4 multiplex PCR a následně fragmentována. Následně dochází k hybridizaci analyzovaných fragmentů genu na specificky navržené oligonukleotidové sondy imobilizované na čipu. Současně je do reakce přidána polymeráza a fluorescenčně značené ddNTPs a probíhá APEX reakce, při které je každá oligonukleotidová sonda na čipu prodloužena právě o jeden fluorescenčně značený terminátor (v místě mutace/polymorfismu) komplementárně dle sekvence nahybridizovaných fragmentů. Po nasnímání fluorescence a určení typu navázaného ddNTP je možné detekovat heterozygotní či homozygotní stav daných mutací.
V naší laboratoři byl ve spolupráci s firmou Asper Biotech Ltd. vyvinut genotypovací čip tzv. „Wilsonův čip“ umožňující souběžné stanovení 87 mutací a 17 polymorfismů v ATP7B genu.
Spolehlivost čipu správně detekovat dané mutace/polymorfismy byla ověřena ve dvou fázích. Nejdříve byl testován soubor 97 WD pacientů již s předem známým genotypem. Celkově bylo určeno 44 mutací a 15 polymorfismů reprezentujících nejčastější mutace vyskytující se v české a slovenské populaci. Zbylé mutace/polymorfismy (45) byly otestovány pomocí vzorků uměle připravených mutagenezí. Všechny sekvenční varianty byly detekovány se 100% správností. Wilsonův čip by tak mohl v budoucnu představovat vhodný nástroj pro rychlejší a levnější screening mutací v ATP7B genu u pacientů s Wilsonovou chorobou.
Grantová podpora: IGA NR 8451-3/2005, MSMT LC06023).
Štítky
Adiktologie Alergologie a imunologie Angiologie Audiologie a foniatrie Biochemie Dermatologie Dětská gastroenterologie Dětská chirurgie Dětská kardiologie Dětská neurologie Dětská otorinolaryngologie Dětská psychiatrie Dětská revmatologie Diabetologie Farmacie Chirurgie cévní Algeziologie Dentální hygienistkaČlánek vyšel v časopise
Časopis lékařů českých
![Číslo 3](https://www.prolekare.cz/media/cache/resolve/journal_issue/media/image_pdf/e435bf926ec943a9bd79bd3705521684.jpeg)
- AI místo lékaře? Výzkum zkoumal ochotu Čechů konzultovat své zdraví s umělou inteligencí
- Metamizol jako analgetikum první volby: kdy, pro koho, jak a proč?
- Nejčastější nežádoucí účinky venlafaxinu během terapie odeznívají
- Horní limit denní dávky vitaminu D: Jaké množství je ještě bezpečné?
Nejčtenější v tomto čísle
- Rubinstein-Taybi syndrom nebo-li syndrom širokých palců
- Využití PET/CT v diagnostice nádorů plic
- CADASIL: analýza mutací v genu Notch3
- Hereditární spastická paraparesa typ SPG4 – první výsledky z České republiky