XXVII. Hematoonkologie

XXVII/328. Využití metod strojového učení a hmotnostní spektrometrie při analýze vzorků periferní krve pacientů s mnohočetným myelomem a extramedulárním onemocněním

Vlachová M.1, Pečinka L.2, Gregorová J.1, Moráň L.3, Kovačovicová P.3, Hampl A.3, Štork M.4, Havel J.2, Vaňhara P.3, Ševčíková S.1

1 Babákova myelomová skupina, Ústav patologické fyziologie, LF MU Brno, 2 Ústav chemie, Přírodovědecká fakulta, MU Brno, 3 Ústav histologie a embryologie, LF MU Brno, 4 Interní hematologická a onkologická klinika, LF MU a FN Brno

Mnohočetný myelom (MM) je druhým nejčastějším hematoonkologickým onemocněním. Je charakterizován klonální proliferací plazmatických buněk v kostní dřeni a tzv. CRAB symptomy (hyperkalcemie, renální insuficience, anemie, kostní léze). Pokud subklon maligních plazmatických buněk migruje mimo kostní dřeň, popř. infiltruje měkké tkáně, je stav nazýván extramedulární onemocnění (EMD). Patogeneze uvedených onemocnění dosud není zcela objasněna a jejich léčba zůstává obtížná, což podtrhuje důležitost rozlišení mezi různými diagnózami prostřednictvím analýzy vzorků periferní krve. MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) je metodou často používanou např. v klinické mikrobiologii k identifikaci mikroorganizmů. V posledních letech, zejména s rozvojem přístupů strojového učení (machine learning, ML), však nabývá většího významu a nachází využití také v dalších oblastech, jako je např. imunologie či studium nádorových onemocnění. Cílem naší práce bylo vyvinout metodu kombinující MALDI-TOF MS a algoritmy ML, kterou by bylo možno použít k rozlišení vzorků plazmy periferní krve získaných od pacientů s MM, EMD nebo PCL. Za tímto účelem jsme vytvořili dvoukrokový protokol, při jehož použití vzrůstá intenzita v celém použitém rozsahu m/z až 50× oproti přímému měření plazmy periferní krve. Extrakcí získaný supernatant obsahující peptidy a proteiny byl 1: 1 smíchán s matricí (kyselina sinapová), pro každý vzorek bylo měření provedeno v pěti technických replikátech. Hmotnostní spektra byla zaznamenána pomocí přístroje MALDI-7090 TOF-TOF (Shimadzu Kratos Analytical) vybaveného pevnolátkovým UV laserem (Nd-YAG: 355 nm), a to v lineárním kladném módu a v hmotnostní oblasti 2-20 kDa. Tímto způsobem naměřená hmotnostní spektra byla statisticky hodnocena v RStudiu s pomocí nástrojů ML, jmenovitě např. prostřednictvím analýzy hlavních komponent (PCA), částečné diskriminační analýzy nejmenších čtverců (PSL-DA) a umělých neuronových sítí (ANN). Výsledky prokázaly, že použití MALDI-TOF MS ve spojení s metodami ML lze využít k rozlišení mezi pacienty s odlišnými diagnózami. Díky volbě použitého biologického materiálu se navíc jedná o minimálně invazivní metodu, která by mohla být využitelná v klinické praxi.

Podpořeno AZV ČR (grant NU21-03-00076) a projektem Národního ústavu pro výzkum rakoviny (Program EXCELES, ID: LX22NPO5102) – Financováno Evropskou unií – Next Generation EU.

XXVII/345. Genetická diagnostika familiárních onemocnění krvetvorby

Vrzalová Z.1,2, Radová L.2,3, Staňo Kozubík K.1,2, Štika J.2,3, Trizuljak J.1^–3, Pospíšilová Š.1^–3, Doubek M.1^–3

1 Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno, 2 Středoevropský technologický institut (CEITEC), MU Brno, 3 Ústav lékařské genetiky a genomiky LF MU a FN Brno

Východiska: Familiární onemocnění krvetvorby (FHD) jsou vzácnou a heterogenní skupinou onemocnění, do které se řadí dědičné anemie, dědičné trombocytopenie (IT), vrozené neutropenie a vrozené syndromy selhání kostní dřeně. Pro FHD je charakteristická variabilní klinická expresivita a neúplná penetrance fenotypu i v rámci jedné rodiny, což znesnadňuje určení správné anamnézy. Molekulární genetické defekty FHD se nachází ve více než 300 genech zodpovědných zejména za buněčné procesy, jejichž funkční poruchy vedou k symptomatické cytopenii, dysfunkci orgánů, poškození tkání a k rozvoji syndromů. Některé varianty genů predisponují ke vzniku závažných hematologických malignit či vzácněji solidních nádorů. Na našem pracovišti jsme zavedli genetickou analýzu u rodin s podezřením na dědičné hematologické onemocnění. Naše zaměření je v rámci ČR unikátní. Soubor pacientů a metody: Od roku 2017 se věnujeme výzkumu a diagnostice vzácných nemocí FHD. Celkem jsme analyzovali 92 rodin s podezřením na FHD pomocí moderních genomických přístupů, jako je celoexomové sekvenování (WES), predikční analýza in silico, metoda MLPA a Sangerovo sekvenování. Výsledky: U 70 rodin jsme detekovali již známou patogenní či pravděpodobně patogenní variantu nebo novou variantu nejasného klinického významu (VUS), jejichž záchyt vedl k potvrzení nebo upřesnění diagnózy. Pozitivní nálezy poukázaly na výskyt dědičných trombocytopenií (geny TUBB1, ETV6 a ANKRD26 – riziko rozvoje hematologických malignit), Glanzmannových trombastenií (ITGA2B), anemií, talasemií, ale také na výskyt vzácných syndromových onemocnění v ČR, např. Bernard-Soulier (GP1BA); Heřmanský-Pudlák (HPS1); Wiskott-Aldrich (WAS – zvýšené riziko výskytu malignit); Shwachman-Diamondův syndrom (SBDS – 30% riziko myeloidních malignit) a Sebastianův syndrom (MYH9) apod. Závěr: Genetická diagnostika se stala součástí standardního vyšetření pacientů s dědičným hematologickým onemocněním. Zároveň pomohla objasnit mnohé nevyřešené případy a poukázala na výskyt vzácných variant klasifikovaných jako VUS, u nichž je nutné prokázat jejich funkční dopad pomocí proteomických technologií. Potvrzení diagnózy pacienta má také kladný dopad na jeho individualizovanou péči a na stanovení rizika vzniku malignit či jiných přídavných onemocnění.

Práce byla podpořena grantovým projektem MZ ČR (grant AZV NU20-08-00137), grantovým projektem A-C-G-T z EFRR (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008448), MZ ČR – RVO (FNBr, 65269705) a MUNI/A/1224/2022.

XXVII/346. Naše zkušenosti s vyšetřováním buněčného chimérizmu

Hulínová T., Faldynová L., Havránková E.

ÚKMPLG, FN Ostrava

Molekulárně genetická analýza buněčného chimérizmu po transplantaci hematopoetických kmenových buněk (HSCT) je založena na sledování podílu autologní krvetvorby pacienta před transplantací k podílu dárcovské krvetvorby. Vyšetřovaná DNA je izolována z buněk periferní krve nebo kostní dřeně. Před samotnou transplantací se odebírá vzorek periferní krve pacienta a v den transplantace je na oddělení molekulární genetiky odeslán vzorek periferní krve dárce. Přihojení štěpu lze sledovat stanovením genotypů informativních polymorfizmů DNA – STR (short tandem repeats) a indel markerů. Proto po izolaci DNA probíhá typizace vhodných markerů, které jsou specifické pro pacienta a specifické pro dárce. Na základě typizace vhodných markerů probíhá následné monitorování přihojení štěpu pomocí kvantitativní PCR v reálném čase. Přežívání a množení dárcovských buněk svědčí o úspěšnosti HSCT především v bezprostřední době po transplantaci. Vyšetření buněčného chimérizmu je nezbytné pro včasné odhalení návratu krvetvorby pacienta, což naznačuje riziko návratu onemocnění a možnost odhojení dárcovského štěpu. Při včasném záchytu lze pomocí imunosuprese celý proces ovlivnit. Testování buněčného chimérizmu probíhá v přesně daných časových intervalech po transplantaci.