Pátek 21. května - Molekulární biologie v pediatrii

Molekulární technologie v medicíně

Bóday A.

Laboratoř molekulární biologie, P&R Lab a.s., Onkologické centrum J. G. Mendela, Nový Jičín

Molekulární biologie je jedním z nejrychleji se rozvíjejících vědních oborů. Zasahuje do mnoha oblastí biologie i do medicíny, kde se analýza lidského genomu stala nedílnou součástí diagnostiky mnoha onemocnění.

Cílem molekulárně biologické analýzy u monogenních onemocnění je vyhledávat mutace (přímá molekulárně genetická diagnostika) nebo sledovat segregaci mutované alely daného genu v rodině postiženého (nepřímá molekulárně genetická diagnostika). Při použití přímé molekulárně genetické diagnostiky se záchytem kauzální(ch) mutace(í) potvrzuje klinická diagnóza a následně je analyzována rodina postiženého za účelem vyhledávání přenašečů a/nebo asymptomatických příbuzných. Při nepřímé molekulárně genetické diagnostice se nehledá mutace, ale sleduje se segregace mutovaných(é) alel(y) pomocí polymorfismů lokalizovaných kolem nebo uvnitř daného genu. Nezbytným předpokladem tohoto typu vyšetření je jednoznačná klinická diagnóza a existence biologického materiálu postiženého, od kterého se odvíjí celé laboratorní vyšetření. Následná haplotypizace určí rizikové alely a s přihlédnutím k rekombinační frekvenci se vytypují rizikoví jedinci v rodině postiženého.

Při molekulárně genetické diagnostice mutací přímo v nádorech je nutné si uvědomit, že nádor je mozaikou buněk s různou úrovní kancerogeneze a různým zastoupením jednotlivých mutací. Analýza musí být přizpůsobena tomuto poznatku. Obdobou tohoto vyšetření je i detekce genetického materiálu extrahumánního agens.

Molekulárně genetické vyšetření lze provést z jakéhokoliv (i z archivovaného) biologického materiálu. Po izolaci DNA a/nebo RNA následuje klonování úseku(ů) daného genu. V dnešní době nejběžneji používaná metoda, polymerázová řetězová reakce (PCR) (a/nebo její modifikace – ARMS, ASO, PCR/RE atd.) lokalizuje a amplifikuje sledovaný úsek DNA, cDNA nebo RNA. Následné procedury, štěpení, separace PCR fragmentů na gelu, hybridizace atd., event. sekvenování, určí nebo vyloučí přítomnost mutace. Sofistikovanější metoda real-time PCR umožňuje kromě detekce známých mutací sledovat i expresi jednotlivých genů.

Cílem této přednášky je snaha ukázat využití molekulární biologie v klinické praxi, její nároky pro kliniky a zdůraznit nezbytnost úzké spolupráce mezi laboratorním a klinickým personálem.

Molecular technology in medicine

Bóday A.

Laboratory of Molecular Biology, P&R Lab a. s., Cancer Center J. G. Mendel, Nový Jičín, Czech Republic

Molecular biology is one of the most developing science branches. It participates in many areas of biology and in medicine, where the analysis of human genome has become an integral part of the diagnosis of large number of disorders.

The aim of molecular genetic analysis of monogenic diseases is to find mutations (direct molecular genetic diagnosis) or observe the segregation of mutant alleles of the gene in affected families (indirect molecular genetic diagnosis). Direct molecular genetic diagnosis is used to capture the causal mutation(s) to confirm the clinical diagnosis. Then the affected families are analyzed for detection of carriers and/or asymptomatic relatives. By using the indirect molecular genetic diagnosis we do not look for mutations, but we observe segregation of mutant allele(s) with polymorphisms located around or in the gene. Essential of this examination is clear clinical diagnosis and the presence of biological material of patient, which is important for next laboratory process. Haplotyping is used for identification of risk alleles and risk individuals in affected families are selected.

The molecular genetic diagnosis of cancer cells mutations has some specifities. The most important difference in comparision with normal cells is that the cancer consists of cells with various level of cancerogenesis and various proportion of examined mutations. The molecular genetic analysis should reflect this fact. The similar specifity has also the molecular diagnosis of extrahuman genome.

The diagnostic procedure consists of few steps. The first one is the isolation of DNA or RNA. The further step is cloning of selected gene parts. The most frequently method is the polymerase chain reaction (PCR) and its modifications (ARMS, ASO, PCR/RE etc.). this method enables localization and amplification of studied part of DNA, cDNA or RNA. Following procedures of clevage, separation of PCR fragments, hybridization and sequening confirm or disconfirm the presence of mutation. More sofisticated real-time PCR method enables also simultaneous expression of the gene.

The scope of this lecture is to present the contemporary potential of molecular biology for clinicians and to discuss the importance of close cooperation between laboratory expert and clinician.

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE SOLIDNÍCH NÁDORŮ DĚTSKÉHO VĚKU

Eckschlager T., Vícha A.

Klinika dětské hematologie a onkologie UK 2. LF a FN Motol, Praha

Dětské nádory jsou vzácné, tvoří necelé 1 % všech zhoubných nádorů, ale významně se podílí na úmrtnosti. Úspěšnost jejich léčby se zvyšuje a řadí tak pediatrickou onkologii mezi nejúspěšnější obory medicíny druhé poloviny 20. století. V současnosti dlouhodobé přežití dětí se zhoubnými nádory dosahuje u nás 80 %. K tomu přispělo zlepšení diagnostiky i léčby umožněné poznatky o molekulární biologii a genetice dětských nádorů. Molekulárně genetické vyšetření umožňuje zpřesnit histopatologickou diagnostiku, detekovat minimální množství nádorových buněk v kostní dřeni i v periferní krvi a potvrdit přítomnost terapeutických cílů. Na příkladu neuroblastomu (NBL) ukážeme možnosti aplikací molekulárních metod v diagnostice a léčbě zhoubných nádorů. NBL je maligní embryonální nádor z nezralých a nediferencovaných buněk neurální lišty osídlujících paravertebrální sympatická ganglia, dřeň nadledviny a paraganglia. Je to nejčastější extrakraniální solidní nádor dětského věku, pro který je typická biologická variabilita. Nádory nízkého rizika často samovolně regredují, případně se spontánně či při léčbě diferencují. Vysoce maligní forma se vyznačuje agresivním průběhem s obtížně ovlivnitelnou progresí, nádor rychle roste a časně metastazuje. Byly identifikovány prognostické znaky, užívané ve stratifikaci léčby: 1) poměr hladin kys. vanilmandlové k homovanilové v moči, hladina feritinu, LDH a neuronspecifické enolázy; 2) histopatologická klasifikace; 3) genetické faktory nádoru: DNA index, počet kopií MYCN, delece 1p a 11q23, exprese některých neurotrofních faktorů a jejich receptorů. V posledních letech byl prokázán význam dalších chromozomálních aberací: delece 3p a 14q23-ter. Ztráta 11q 23 je asociovaná s delecí na 3p a u nádorů bez amplifikace MYCN je známkou horší prognózy. Podle zařazení do rizikových skupin se vybírá terapie. V současnosti je u NBL vysokého rizika zařazována i terapie protilátkami proti GD2 a diferenciační terapie 13-cis retinovou kyselinou. Součástí probíhajících studií je i zhodnocení prognostického významu minimální infiltrace kostní dřeně. Současná léčba NBL je příkladem individualizace terapie na základě klinických i molekulárně genetických parametrů.

Mnohočetná léková rezistence

Kopřiva F.

Dětská klinika LF UP a FN Olomouc

Jednou z nejzávažnějších komplikací protinádorové léčby a nejdůležitější příčinou jejího selhání je schopnost nádorových buněk odolávat účinkům cytotoxických látek. Maligní buněčné populace mohou být vůči chemoterapii rezistentní již při první léčbě. V tomto případě jde o tzv. přirozenou (primární) rezistenci. Získaná (sekundární) rezistence vzniká až v průběhu cytostatické léčby, kdy se původně citlivé buňky stávají rezistentními a účinnost cytostatické léčby se snižuje. Při ztrátě citlivosti k určitému cytostatiku může však být zachována citlivost k jiným léčivům. Pokud při ztrátě citlivosti k jednomu přípravku vzniká současně rezistence na jiné, většinou strukturálně příbuzné cytostatikum, hovoříme o zkřížené rezistenci. Byly však popsány případy zkřížené rezistence mezi protinádorovými léčivy lišícími se jak strukturně, tak mechanismem účinku. Takové případy rezistence pak nazýváme mnohočetná léková rezistence (multidrug resistance, MDR).

Typická (klasická) MDR je zapříčiněna membránovým glykoproteinem, který je produktem mdrl genu. Tento P-glykoprotein (Pgp) je ATP dependentní membránová pumpa exportující toxické látky z buňky a způsobující tak sníženou intracelulární akumulaci léčiva. Z terapeutického hlediska je důležitou vlastností typické MDR možnost jejího obejití pomocí chemosenzitorů – látek obnovujících vnímavost MDR buněk k protinádorové léčbě.

Jako atypická MDR (at-MDR) jsou souhrnně označovány všechny mechanismy mnohočetné lékové rezistence, na kterých se neúčastní Pgp. Atypická MDR může být způsobena změnou subcelulární distribuce léčiva, poškozením cílové struktury léčiva, rozdílnou kapacitou DNA opravných procesů či změnami detoxifikačních metabolických drah buňky. Od typické se odlišuje především tím, že nezahrnuje rezistenci na vinca alkaloidy. Atypická MDR je asociována zejména s následujícími proteiny: multidrug resistance associated protein (MRP), lung resistence related protein (LRP) a sp izoformou enzymu glutathion- S-transferazy (GST-p).

Multidrug Resistance

Kopřiva F.

Department of Paediatrics, Faculty of Medicine, Palacky University and University Hospital Olomouc, Czech Republic

One of the most serious anticancer complications is resistance of cancer cells to cytotoxic substances. The ATP binding cassette superfamily of membrane transportes is one of the largest protein classes known, and counts numerous protein involved in trafficking of biological molecules across cell membranes.

These proteins are ATP-dependent drug efflux pumps for xenobiotic compounds with broad subtrate specificity. It is responsible for decreased drug accumulation in multidrug-resistant cells and often mediates the development of resistence to anticancer drugs. Hypothesis trying to explain its broad specificity are given as well as its presence in organisms ranging from bacteria to man.

Criteria are given to divide MDR to 2 groups: typical (classical) multidrug resistance and atypical multidrug resistence (MDR). Classical MDR is caused by membrane P-glycoprotein (Pgp). This 170 kDa protein belongs to a superfamily of ABC-transport proteins.

Atypical MDR

The human MRP1 is the ATP-dependent efflux pump that was originally cloned from a multidrug-resistant small cell lung cancer cell line in 1992. MRP1 has a very broad spectrum relative to many other ABC drug transporters. One of the most well characterized substrate of MRP1 is the cysteinyl leukotriene, leukotriene C4. Additionaly increased activity of glutathion-Stransferase enzyme (GST-p) followed by increased concentration of reduced form of glutathion (GSH) protects tumor cells from oxidative damage.

KLINICKÝ VÝZNAM PROGNOSTICKÝCH ZNAKŮ V LÉČBĚ DĚTSKÝCH LEUKÉMIÍ

Mihál V.

Dětská klinika LF UP a FN Olomouc

Cíle studie: Paralelně se stoupající incidencí maligních onemocnění čelí klinická onkologie a onkohematologie v posledních několika letech stoupajícímu počtu výsledků plynoucích z molekulárního výzkumu patogeneze maligních onemocnění. Tyto informace jsou bohužel velmi pomalu implementovány jak v oblasti diagnostické, tak terapeutické. Cílená terapie, založená na poznání biologických charakteristik nádoru i jeho nositele, tak představuje nový přístup, který byl umožněn rozvojem moderních vyšetřovacích metod, zvláště cytogenetických a molekulárně biologických. Vzhledem k širokému spektru protinádorových léčebných možností existuje v současném onkologickém výzkumu snaha identifikovat zejména prediktivní faktory, na základě kterých je možné sestavit léčbu „šitím na míru“ (therapy tailoring). Tato metoda je základním principem prediktivní onkologie, která představuje posun od cytotoxické destrukce nádorových i nenádorových buněk k cílenému působení na maligní buňky na základě biologických markerů a znalosti onkogeneze.

Závěry: U dětských hematologických malignit je více než kde jinde cytogenetická a molekulárně biologická diagnostika klíčem ke správné stratifikaci a léčbě. Autor informuje o vývoji a významu prediktivních znaků u dětské leukémie. Investice do kvalitní a správně načasované prediktivní diagnostiky se ukazuje nanejvýš etická, ekonomická a vysoce perspektivní.

Molekulárně biologické aspekty anémií

Pospíšilová D.

Dětská klinika Lékařské fakulty Univerzity Palackého a Fakultní nemocnice Olomouc

Molekulární biologie významně přispěla nejen k odhalením podstaty celé řady onemocnění, ale současně k objevu nových léčebných metod včetně genové léčby, a k upřesnění prognózy jednotlivých chorob. Hematologie byla prvním odvětvím medicíny, které metod molekulární biologie používalo, a to při diagnostice hemoglobinopatií. Jedním z prvních významných úspěchů bylo odhalení mutací globinových genů u talasémií. Později se rychle rozvíjela i molekulární diagnostika leukémií, hemofilie a v posledním desetiletí i diagnostika anémií s dosud nejasnou podstatou.

Základem vyšetřovacích metod používaných v diagnostice anémií patří DNA analýza (geny) nebo RNA analýza (exprese genetické informace v buňkách). Jsou využívány následující postupy: izolace DNA, gelová elektroforéza, transfer nukleových kyselin a proteinů pro hybridizaci: Southern blot (DNA), northern blot (RNA), western blot (proteiny), hybridizace nukleových kyselin, PCR metody, sekvenování.

Složitost a význam molekulárně genetických analýz je možno demonstrovat na příkladu Diamondovy-Blackfanovy anémie (DBA) a mikrocytární anémie vznikající na podkladě mutací genů regulujících DMT1 protein. DBA je prvním onemocněním v hematologii způsobeným poruchou funkce ribosomů. Nález mutací v ribosomálních proteinech (RP) u pacientů s DBA byl jedním z nejzajímavějších objevů v hematologii v posledních letech. U více než 50 % pacientů jsou mutovány geny pro různé RP: RPS19, 17, 24, RPL5, 11, 35a. Mutace v RP negativně ovlivňují účinnost proteosyntetického aparátu, a to zejména ve tkáních s rychlým obratem proteosyntézy, jako je právě erytropoéza.

Divalent metal transporter 1 (DMT1) je jedním z klíčových proteinů v regulaci metabolismu železa (Fe). Umožňuje transport Fe do duodenálních buněk a do makrofágů a export Fe z endozomů do cytoplazmy erytroblastů. Od prvního popisu pacientky českého původu s mikrocytární anémií způsobenou homozygotní mutací DMT1 v roce 2005 byli popsáni další 4 pacienti se stejným typem anémie. Přesto, že se jedná o důsledek mutace jednoho proteinu, liší se pacienti v řadě klinických i laboratorních nálezů. Velká variabilita klinických a laboratorních nálezů ukazuje na rozdílný vliv jednotlivých typů mutací na funkci proteinu.

Odhalení molekulární podstaty anémií je základem pro vývoj nových léčebných přůstupů.

MOLECULAR-BIOLOGICAL BASIS OF ANEMIAS

Pospíšilová D.

Department of Paediatrics, Palacky University, Olomouc, Czech Republic

Molecular biology has contributed substantially to elucidating the basis of a large number diseases, and to discovery of new treatment modalities which include gene therapy, to more exact prognostis and genetic counseling. Haematology was the first branch of medicine, in which molecular genetic methods were used, in the diagnosis of hemoglobinopathies. Discovery of globin gene mutations was one of the most important succcesses. The molecular genetic diagnosis of leukaemias, hemophilias and anemias of unknown etiology rapidly followed. Currently the basic methods widely used in the diagnostics of anaemias are: DNA analysis (genes), or RNA analysis (expression of intracellular genetic information). The methods used include: DNA isolation, gel electrophoresis, protein and nucleic acid transfer for hybridization: Southern blot (DNA), northern blot (RNA), western blot (proteins), hybridization of nucleic acid, PCR methods and sequencing.

The complexity and significance of molecular-genetic analyses can be demonstrated in the case of Diamond-Blackfan anemia (DBA) and microcytic anemia whch is due to mutations of the genes coding for the DMT1 protein. DBA was the first disease in hematology caused by impaired ribosomal function to be uncovered. The ribosomal protein mutations (RP) found in DBA patients was one of the most suprising discoveries in hematology over the last decade. In more than 50% of patients, several genes coding for RP (RPS19, 17, 24, RPL5,11, 35a) are mutated. In the remaining patients the genetic background of the disease is still unknown. RP mutations have negative influence on proteosynthetic capacity and        lead to the decreased level of proteosynthesis. The result of this process is insuficient synthesis of key proteins necessary for cellular differentiation and proliferation. It is hypothesized that various tissues show different sensitivity to decreased levels of proteosynthesis. Insufficient protein synthesis has the greatest impact on processes with the highest proteosynthetic demand, especially erythropoiesis.

Divalent metal transporter 1 (DMT1) is a key protein in Fe metabolism regulation, enabling transport of Fe to duodenal cells, macrophages and hepatocytes. It also necessary for Fe export from endosomes to the cytoplasm of erythroblasts. Since the first description of a Czech patient with DMT1 mutation in the year 2005, a further 4 patients were described with the same type of anemia worldwide. Despite the same protein gene mutation, the clinical and laboratory findings are different. This large variability is caused by different impact of these mutations on protein function. Finally, given the rapid development of molecular genetics, we anticipate discovery of the basis of more anemias of unknown etiology with development of new treatment approaches.

DNA microarrays

Srovnal J., Benedíková A., Špenerová M., Hajdúch M.

Laboratoř experimentální medicíny DK FN a LF UP Olomouc

Cíl studie: Cílem sdělení je seznámit posluchače s technologií DNA microarrays a s jejím potenciálem nejenom v oblasti experimentální, ale zejména v oblasti klinické. Metoda DNA microarrays umožňuje stanovit míru genové exprese všech genů lidského organismu, v dnešní době tedy kolem 23 tisíc genů. Metoda dále umožňuje stanovit, které varianty genu jsou exprimovány, dále dokáže analyzovat genové polymorfismy či chromozomální mikropřestavby. Již před několika lety se na základě výsledků z DNA microarrays změnilo patologické členění karcinomů prsu a lymfomů, což mělo i zásadní dopad na léčbu pacientů. Základním cílem naší studie je analýza polymorfismu glukokortikoidního receptoru u dětí s akutní lymfoblastickou leukémií a zhodnocení prognostického a prediktivního významu zjištěných polymorfismů.

Metody: Fenol-chloroformovou metodou bude izolována RNA a DNA ze vzorků kostní dřeně v 0. a 8. den léčby pacientů s ALL, a dále ze stejných vzorků po inkubaci lymfoblastů s prednisonem anebo dexamethasonem v rámci testu chemorezistence (MTT). Po izolaci bude následovat DNA microarrays analýza pomocí GeneChip Human Exon 1.0 ST Array a Genome-Wide SNP Array 6.0 (Affymetrix). Následně bude provedeno statistické hodnocení dat.

Výsledky: V přednášce budou prezentována pilotní data projektu. Posluchači budou srozumitelně seznámeni s technologií DNA microarrays na konkrétním projektu, budou diskutovány přínosy a perspektivy metody v možnostech individualizace terapie dětí s ALL.

Závěr: Metoda DNA microarrays umožňuje identifikovat profily genové exprese vztahující se k chemorezistenci pacienta nejenom na glukokortikoidy. Projekt umožňuje díky korelacím s in vitro odpovědí buněk v rámci MTT testu eliminovat interindividuální variabilitu v metabolismu, farmakokinetice, farmakogenetice a vylučování cytostatik v podmínkách in vivo. Budeme-li schopni predikovat chemorezistenci na glukortikoidy, můžeme návazně individualizovat kortikosteroidní terapii u dětí s ALL s cílem zlepšit léčebné výsledky anebo minimalizovat nežádoucí účinky léčby.

Práce na tomto projektu je podporována granty MŠMT CZ.1.07/2.3.00/09.0089, EHP CZ 0099 a IGA MZ ČR NS 9939.

DNA microarrays

Srovnal J., Benedikova A., Spenerova M., Hajduch M.

Laboratory of Experimental Medicine, Department of Paediatrics, Palacky University and University Hospital Olomouc, Czech Republic

Objective: The aim of this lecture is the introduction to DNA microarrays technology and show its potential not only for experimental, but especially for the clinical purposes. The DNA microarrays allows gene expression analysis of whole human genes, today is around 23 thousand genes. The method also allows to determine which gene variants are expressed, it can also analyze gene polymorphisms and chromosomal rearrangements. Few years ago, DNA microarrays results changed pathological classification of breast cancers and lymphomas, which had a major impact on the patients treatment. The primary aim of our study is the analysis of corticoid receptor polymorphism in children with acute lymphoblastic  leukaemia (ALL) and assessment of the prognostic and predictive value of the identified polymorphisms.

Methods: RNA/DNA will be isolated from bone marrow samples of ALL patients in the treatment day 0 and 8 using fenol-chloroform method. RNA/DNA will be also isolated from the same samples after incubation of leukocytes/lymphoblasts with prednisone/dexamethasone using chemoresistance test (MTT). After isolation, DNA microarrays will be followed by analysis using GeneChip Human Exon Array 1.0 ST and Genome-Wide SNP Array 6.0 (Affymetrix). Statistical analysis of the data will be processed.

Results: This presentation will show a pilot project data. Auditory will be comprehensively  briefed on the technology of DNA microarrays, the benefits and perspective possibilities of DNA microarrays in ALL patients therapy individualization will be discussed.

Conclusion: The DNA microarrays methods can identify chemoresistant patient not only for corticoids. The project can eliminate interindividual variability in metabolism, pharmacokinetics, pharmacogenetics and excretion of cytostatics in conditions in vivo. If we would be able to predict corticoids chemoresistance, we could subsequently individualize steroid therapy in children with ALL, in order to improve therapeutic results or minimize the adverse effects of treatment.

This project is supported by grants MSMT CZ.1.07/2.3.00/09.0089, EHP CZ 0099 and IGA MZ CR NS 9939.