p‑ SRM, SWATH a HRM –  cílené proteomické přístupy na hmotnostním spektrometru TripleTOF 5600+ a jejich aplikace v onkologickém výzkumu

Souhrn

Vývoj dia­gnostických a terapeutických přístupů v onkologii vyžaduje, kromě jiného, citlivé kvantitativní přístupy pro stanovení proteinů souvisejících s nádorovými procesy v klinických vzorcích. V tomto článku jsou představeny nové kvantitativní metody cílené proteomiky. Hlavní potenciál metod monitorování vybraných reakcí (SRM) a pseudo‑ SRM spočívá v kvantifikaci předem vybraných proteinů ve větších souborech vzorků s vysokou citlivostí a selektivitou, čímž představují alternativu ke stávajícím imunochemickým přístupům. Potenciál HRM a SWATH spočívá naopak v získávání digitálních proteomických fingerprintů, z nichž je následně možné extrahovat kvantitativní proteomická data na podobném principu jako u SRM. Článek představuje aplikace uvedených metod v řadě studií z oblasti onkologického výzkumu, kde byly použity ke stanovení a validaci stávajících i nově navrhovaných proteinových bio­markerů a při studiu jejich úlohy v mechanizmu vzniku a vývoje nádorů.

Klíčová slova:
proteomika –  monitorování vybraných reakcí –  onkologie –  SWATH –  bio­markery – molekulární diagnostika

Úvod

Nové poznatky z oblasti molekulární bio­logie nádorů jdou ruku v ruce s vývojem nových citlivých metod, které umožňují nové analýzy na úrovni genomu, transkriptomu i proteomu a jako celek podávají komplexní obrázek o bio­logických procesech v buňce. Proteiny jsou nejen stavebními prvky živých organizmů, ale i základními bio­logickými katalyzátory, regulátory a prostředníky buněčné signalizace. Hladiny proteinů, jejich modifikace a funkce se tak odráží v základním stavu buňky, jejích fyziologických reakcích na okolní podmínky i patologických procesech včetně maligní transformace. Rozvoj proteomických metod a současně porovnávání výsledného stavu proteomu se základní informací obsaženou v genomu a regulací exprese na úrovni transkriptomu umožňují komplexně charakterizovat bio­logické procesy v buňce. Charakterizace proteinů a jejich kvantifikace je tedy jedním z předpokladů rozvoje nových dia­gnostických a terapeutických přístupů u nádorových onemocnění založených na nově získaných systémově bio­logických poznatcích [1,2].

Proteomika je vědní směr, který se zabývá identifikací a kvantifikací proteinů v různých bio­logických systémech, a představuje tak nástroj k pochopení složitých buněčných procesů. V rámci proteomiky lze rozlišit dva základní směry: 1. tzv. necílenou proteomiku, která se zaměřuje na identifikaci nových proteinových cílů v souvislosti s určitým bio­logickým stavem, např. onemocněním (srovnání vzorků pacientů s dobře definovanou dia­gnózou a zdravých jedinců); 2. tzv. cílenou proteomiku, která se zaměřuje na jeden konkrétní protein a jeho bio­logickou úlohu. Pro rozvoj cílené proteomiky hraje zásadní roli možnost citlivé, specifické a mezilaboratorně dobře reprodukovatelné kvantifikace studovaného proteinu. V této oblasti dosud dominují převážně imunochemické přístupy (western blotting spojený s imunodetekcí, ELISA), které jsou závislé na dostupnosti kvalitních a specifických protilátek. Principiálně zcela odlišná technika hmotnostní spektrometrie (mass spectrometry –  MS) v poslední době nabízí alternativní přístupy cílené kvantifikace proteinů na bázi vybraných proteotypických peptidů, jejichž představení je předmětem tohoto článku. Vychází přitom ze zkušeností s technicky ekvivalentním přístupem pro MS kvantifikaci nízkomolekulárních látek, který je řadu let využíván v oblasti farmaceutické a forenzní analýzy [3,4]. Jelikož metodický vývoj v této oblasti dosáhl úrovně potřebné k běžnému uplatnění v bio­logickém výzkumu včetně onkologického, byla cílená proteomika vyhodnocena časopisem Nature Methods jako metoda roku 2012 [5].

Základní metodou cílené proteomiky je tzv. monitorování vybraných reakcí (selected reaction monitoring –  SRM), o níž jsme podrobně referovali již dříve [6], dále viz [7,8]. Pomocí metody SRM lze kvantifikovat až desítky předem vybraných proteinů v rámci jedné analýzy a díky širokému lineárnímu dynamickému rozsahu je tak možno stanovit proteiny obsažené v množství 45 až 1,3 × 106 kopií na buňku v jedné analýze [9]. Je však nezbytné mít pro dané proteiny optimalizované metody, což znamená především vybrané kombinace proteotypických peptidů a jejich specifických fragmentů, které poskytují dobrý signál. SRM se běžně provádí na relativně jednoduchých hmotnostních spektrometrech typu trojitý kvadrupól (QQQ) nebo hybridních systémech typu trojitý kvadrupól‑lineární iontová past (QTRAP). Se zvyšující se citlivostí vysokorozlišovacích hmotnostních spektrometrů (Orbitrap, QExactive, qTOF) se v posledních letech rozšiřují možnosti cílené kvantifikace i na této složitější, ale univerzálnější instrumentaci. V tomto článku se proto budeme věnovat cílené kvantifikaci na hmotnostním spektrometru TripleTOF 5600+, který byl nedávno instalován na pracovišti RECAMO Masarykova onkologického ústavu a který umožňuje provádět také sběr digitálních fingerprintů pomocí metody HRM (hyper reaction monitoring) neboli SWATH (sequential windowed data independent acquisition of the total high resolution mass spectra). Z těchto fingerprintů lze následně, třeba několik let po provedené MS analýze, extrahovat kvantitativní data pro později zvolené proteiny našeho zájmu. To staví proteomiku do zcela nového světla jako nástroje pro získání zcela nových proteomických dat z fyzicky již nedostupných vzorků, což žádná z dosud dostupných metod neumožňuje. Oba přístupy mají velký potenciál při verifikaci a validaci potenciálních bio­markerů nádorových onemocnění a při kvantifikaci vybraných proteinů v rámci studií zaměřených na studium bio­logické úlohy proteinů in vitro a in vivo.

Příprava vzorků pro cílenou proteomiku a chromatografická separace

Analýza vzorků pomocí cílené proteomiky probíhá podobně jako běžná proteomická LC‑ MS analýza s tím, že při přípravě vzorku je třeba zohlednit jeho charakter a typ použité kvantifikace. Proteiny se extrahují ze zmražených či archivovaných tkání, případně z bio­logických tekutin. Vzorky analyzované v rámci onkologického výzkumu jsou obecně velmi komplexní. U vzorků typu sérum nebo plazma se proto někdy provádí imunochemické odstranění proteinů o velmi vysoké koncentraci. Pro proteiny o nízké koncentraci lze provést naopak obohacení pomocí protilátky vůči cílovému proteinu [8], která zvyšuje citlivost přístupu, přičemž specifita zůstává zajištěna MS identifikací; tento přístup se pak označuje jako „immuno‑ SRM“ [10]. Důležitou otázkou je přídavek izotopově značených peptidů zajišťujících přesnou kvantifikaci. Pro SRM se přidávají izotopově značené proteotypické peptidy o známé koncentraci, které sekvencí odpovídají peptidům z kvantifikovaných proteinů [11]. Pro HRM a SWATH jsou naopak obvykle přidávány směsi ověřených peptidů, jež slouží ke kalibraci retenčních časů u následné chromatografické separace a zvyšují tím spolehlivost celého přístupu. Získaný proteinový extrakt je redukován, alkylován a štěpen trypsinem, který specificky štěpí proteiny na C‑ straně lysinu a argininu, pokud nenásleduje prolin. Peptidové směsi jsou separovány na principu reverzně fázové chromatografie on‑line propojené do hmotnostního spektrometru. Lze však použít i dvojrozměrnou (2D) chromatografickou separaci [12], která snižuje komplexitu vzorku, interference a limity detekce, prodlužuje ale dobu experimentu. Chromatografií separované peptidy vstupují do (nano)elektrospreje, kde vlivem vysokého napětí dochází k jejich ionizaci, nabité ionty poté vstupují do hmotnostního spektrometru.

Princip SRM a p‑ SRM

Základní princip SRM měřeného v hmotnostním spektrometru typu trojitý kvadrupól spočívá ve výběru peptidového iontu (prekurzorového iontu) v prvním hmotnostním analyzátoru (kvadrupól Q1).Peptid je následně fragmentován v kvadrupólu Q2, specifické peptidové fragmenty (produktové ionty) jsou pak vyfiltrovány díky nastavení kvadrupólu Q3 (obr. 1A, B), kterým tyto prochází na detektor [13]. Při SRM se tedy kvantifikují určité vybrané peptidy, typické pro daný protein. Z kvantitativních dat těchto peptidů se poté vypočítá kvantifikace celého proteinu. Modifikovaný přístup cílené kvantifikace u vysokorozlišovacího hmotnostního spektrometru typu TripleTOF se označuje jako pseudo‑ SRM (p‑ SRM). Modifikace spočívá v tom, že namísto měření jednotlivých předem vybraných fragmentů peptidů je měřeno celé peptidové spektrum pomocí analyzátoru „time‑ of‑ flight“ (TOF). Výhodou tohoto přístupu je jednodušší vývoj metod pro kvantifikaci konkrétních peptidů a lepší kontrola selektivity, nevýhodou je horší citlivost ve srovnání s přístroji typu QQQ nebo QTRAP obdobné generace.

Princip HRM/ SWATH

Metoda HRM neboli SWATH je modifikací metody p‑ SRM. Zatímco při měření metodou p‑ SRM jsou pro získávání spekter vybírány pouze určité peptidy typické pro proteiny našeho zájmu, metoda SWATH je navržena k získání digitálního fingerprintu, z něhož lze později vyčíst kvantitativní data až pro několik tisíc peptidů. Pro sběr SWATH digitálních fingerprintů se škála m/ z rozdělí na okna o šířce typicky 25 Da. Kvadrupól Q1 funguje jako hmotnostní filtr, který postupně propouští ionty o určitém rozsahu m/ z do kolizní cely (obr. 1C). Nejedná se zde o jednotlivé ionty, jak je tomu v případě SRM a p‑ SRM (šířka okna 0,7 Da, obr. 1A, B), ale oblasti m/ z o šířce 25 Da. Takto je v průběhu LC‑ MS analýzy v krátkých cca 3 s trvajících cyklech opakovaně analyzována vždy celá oblast m/ z spektra, což umožňuje získávat kvantitativní data pro všechny detekovatelné peptidy ve vzorku.

Aplikace cílené proteomiky v onkologickém výzkumu

SRM je jednou z nejcitlivějších kvantitativních metod hmotnostní spektrometrie. V současnosti získává nenahraditelné postavení v oblasti validace proteinů, které by mohly hrát úlohu bio­markerů bio­logických stavů. Například Fortin et al [14] použili SRM v kombinaci s imunodeplecí vzorku pro stanovení klinicky rutinně užívaného markeru, prostatového specifického antigenu (PSA), v sérech pacientů s benigní hyperplazií prostaty a pacientů s nádory prostaty. Výsledky ukázaly dobrou korelaci výsledků uvedeného přístupu cílené proteomiky a běžně užívaného ELISA testu [14]. Hembrough et al [15] s pomocí SRM přístupu kvantifikovali epidermal growth factor receptor (EGFR) v buňkách linie odvozené z nádoru plic fixované v parafinu a ukázali dobrou shodu mezi daty získanými EGFR‑ SRM a ELISA daty ze vzorků nefixované kultury. Dále demonstrovali možnost SRM stanovení EGFR ve vzorcích mikrodisekovaných z formalinem fixované tkáně xenograftů a tkání nemalobuněčného karcinomu plic. Bylo prokázáno, že získaná data jsou velmi specifická pro EGFR a jednoznačně odlišují kvantifikaci EGFR od kvantifikace dalších příbuzných proteinů (např. IGF‑1R, cMet, Her2, Her3 a Her4) [15]. Metoda SRM má dále potenciál ve validaci nových potenciálních bio­markerů. Hladiny tří z pěti SRM validovaných proteinů (14- 3- 3σ, gelsolin, lumican, transglutaminasa 2 a tissue inhibitor of metalloproteinase 1) vykázaly schopnost odlišení nádorů pankreatu od kontrol v daném souboru pacientů, přičemž nejlepších výsledků bylo dosaženo pro gelsolin [16]. Podobně byla testována včasná detekce hepatocelulárního karcinomu u pacientů po infekci hepatitidou C.V souboru 50 pacientů byly skupiny pacientů s nádorem a bez nádoru jednoznačně rozlišeny pomocí hladin apolipoproteinu A1 stanovených pomocí SRM, přičemž data byla potvrzena dalšími nezávislými metodami [17]. Pro vývoj stanovení nových proteinů pomocí SRM jsou dále vyvíjeny nové rychlejší a efektivnější přístupy. Jeden z nich [18] umožnil vývoj metod pro kvantifikaci jak klinicky rutinně užívaného markeru nádorů vaječníku, CA125, tak i dalších zvažovaných bio­markerů (beta‑2- mikroglubulin, apolipoprotein A1, transthyretin a transferrin). Vyvinuté metody jsou k dispozici ve formě veřejně přístupné SRM knihovny [18].

V signalizaci u nádorových procesů mají velký význam posttranslační modifikace proteinů, jako je fosforylace, ale také acetylace či glykosylace. Wolf-Yadlin et al [19] demonstrovali velmi efektivní SRM přístup pro analýzu fosforylací na 222 fosforylačních místech proteinů po stimulaci buněk EGF. Bylo přitom identifikováno a sledováno 31 fosforylačních míst, která dosud s EGF stimulací nebyla spojována. Publikovaný přístup umožňuje rutinní analýzu stovek fosforylačních míst za různých volitelných bio­logických podmínek [19]. Griffiths et al [20] dále zjistili, že metoda SRM je 10násobně citlivější v porovnání s ostatními metodami pro sledování acetylace, a tímto způsobem byli schopni identifikovat pět nových acetylačních míst u cytokeratinu 8 [20]. Hülsmeier et al [21] studovali pomocí SRM vrozenou poruchu glykosylace. Cíleně se zaměřili na glykosylace u α- 1- antitrypsinu a transferrinu a pomocí SRM zjistili vztah mezi sníženou glykosylací a závažností CDG syndromu [21]. Glykosylace mají rovněž význam z toho důvodu, že řada sekretovaných proteinů použitelných jako neinvazivní bio­markery je glykosylovaných.

Aplikace metody HRM/ SWATH v onkologickém výzkumu

Metoda SWATH umožňuje i zpětnou kvantifikaci všech detekovatelných proteinů ve vzorku [22] z naměřených digitálních fingerprintů. Jelikož se jedná o metodu velmi novou, počet publikovaných prací je zatím omezený a ty se zaměřují převážně na strukturní a funkční studie proteinů na molekulární úrovni. Doposud byla metoda SWATH úspěšně využita ke studiu Her‑ 2/ neu receptoru (ErbB2) a jeho fosforylované a acetylované formy [23]. Potenciál metody SWATH byl též demonstrován na vzorcích lidské plazmy získaných od zdravých jedinců, v nichž bylo cíleně sledováno 41 N‑ glykopeptidů pomocí metod SWATH a SRM. V obou posledně jmenovaných studiích bylo zjištěno, že SWATH má sice nižší citlivost v porovnání se SRM, vývoj kvantifikačních metod však trvá kratší dobu a metoda umožňuje kvantifikovat podstatně více proteinů v jednom běhu. Reprodukovatelnost SRM a SWATH byla podobná [24]. SWATH může najít uplatnění také ve funkčním studiu pronádorových procesů, konkrétně při charakterizaci protein‑proteinových interakcí. V této oblasti byl studován vliv stimulace PI‑ 3K/ AKT signální dráhy na interaktom proteinu 14- 3- 3β. Vzorky byly připraveny pomocí „pull‑ down” afinitní purifikace, která byla prováděna v různých časech po přidání IGF1 (insulin‑like growth factor 1 –  stimulátor PI‑ 3K/ AKT dráhy). Výsledky dynamicky popisují interaktom proteinu 14- 3- 3β při aktivaci zmíněné dráhy, přičemž bylo identifikováno několik skupin interagujících proteinů, jež vykazovaly zcela odlišné chování v odpovědi na stimulaci [25]. V jiné studii se autoři zaměřili na charakterizaci změn protein‑proteinových interakcí souvisejících s mutacemi cyklin dependentní kinázy 4 (CDK4), které se vyskytují u melanomů. Metoda AP‑ SWATH odhalila 17 proteinů, jež ve zvýšené míře interagovaly s mutantními formami CDK4 v porovnání s wild type formou proteinu. Interakce mutantních forem CDK4 s Hsp90 proteiny (Hsp90α, Hsp90β) byly zvýšeny trojnásobně v porovnání s wild type. Mutantní formy CDK4 naopak téměř neinteragovaly s INK proteiny (p15INK, p16INK, p18INK a p19INK –  polypeptidové inhibitory CDK4) v porovnání s wild type [26]. Z uvedených výsledků lze říci, že metoda SWATH je robustním přístupem pro charakterizaci změn v posttranslačních modifikacích proteinů a jejich protein‑proteinových interakcích, který nevyžaduje použití značení. V současné době prováděné studie se rovněž zaměřují na koncept digitalizovaných bio­bank, který by z jedenkrát naměřených dat metodou SWATH umožnil v budoucnu kdykoliv extrahovat jakékoliv dostupné kvantitativní proteinové informace.

Závěr

Experimentálně náročné proteomické techniky vykazují v posledních letech metodický rozvoj, který stále více umožňuje splnit představy lékařů, bio­logů a dalších výzkumných pracovníků. To odráží zejména stále se zvyšující podíl proteomu, jenž může být rutinně sledován. Nové metody cílené kvantifikace přispívají výrazným zlepšením k reprodukovatelnosti, kvantifikovatelnosti a ke zvýšení počtu vzorků, které mohou být zařazeny do proteomických studií. Zde prezentované práce ilustrují úspěšné aplikace cílené proteomiky v oblasti onkologického výzkumu, jež v mnoha případech směřují k reálnému uplatnění v klinické praxi. Laboratoř hmotnostní spektrometrie Masarykova onkologického ústavu s hmotnostními spektrometry TripleTOF 5600+ a Orbitrap ELITE je připravena, ve spolupráci se specialisty napříč obory, k tomuto úsilí významně přispět.

Práce byla podpořena projektem Grantové agentury České republiky č. 14-19250S, Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky (OP VaVpI – RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101) a MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805) a BBMRI_CZ (LM2010004).

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do bi omedicínských časopisů.

Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D.

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: bouchal@mou.cz

Obdrženo: 3. 2. 2014

Přijato: 26. 3. 2014