Mikroprostředí nádoru –  možnosti výzkumu v podmínkách in vitro

Souhrn

Tumorogeneze je vždy doprovázena změnami v mikroprostředí příslušné tkáně. Nádorové mikroprostředí představuje heterogenní komplex, který širokou škálou vnějších podnětů kontroluje buněčnou proliferaci, diferenciaci, nekrózu nebo apoptózu a může vést k vývoji agresivního fenotypu buněk nádoru. Vliv nádorového mikroprostředí je také často spojován s rezistencí k běžně používaným léčebným postupům. Specifika nádorového prostředí jsou těsně spojena se strukturními i funkčními abnormalitami cévní sítě v nádoru, stejně jako se změnami v buněčném metabolizmu. Pro nádorové tkáně je typické zejména zvýšení podílu glykolýzy, zvýšený příjem glukózy, produkce laktátu a CO₂, rovněž jako přítomnost hypoxických oblastí a oblastí se sníženým pH. V současné době existuje množství metod vhodných pro in vitro simulaci a výzkum ně­kte­rých z těchto podmínek a množství nových metod se nadále vyvíjí. Bližší poznání specifik nádorového mikroprostředí tak bude stále více ovlivňovat vývoj nových léčebných prostředků pro nádorová onemocnění u člověka.

Klíčová slova:
mikroprostředí nádoru –  hypoxie –  acidické pH –  glukózová deprivace –  podmínky in vitro

Specifika nádorového mikroprostředí

Původní redukcionistický pohled na bio­logii solidních nádorů předpokládal, že nádorové onemocnění vzniká pouze v důsledku mutací, které následně způsobují progresi nádoru. Podle této teorie nádorová masa, v jejíchž buňkách se kumulují mutace, existuje víceméně izolovaně a s okolním prostředím ve tkáni komunikuje jen minimálně. Současné pojetí vychází ze skutečnosti, že tkáň nádoru je tvořena buňkami transformovanými i buňkami nenádorovými, což jsou zejména buňky stromální nebo buňky imunitního systému. Tato tkáň přijímá množství signálů ze svého okolí, které v konečném důsledku rozhodují o metabolizmu, růstu a přežívání nádorově transformovaných buněk [1,2].

Zatímco přímé vzájemné interakce nádorově transformovaných buněk s buňkami netransformovanými lze v současnosti v systémech in vitro zkoumat jen obtížně, při kultivaci nádorových buněk je možné využít úprav kultivačního prostředí tak, aby co nejvíce odpovídalo podmínkám uvnitř nádorové tkáně. V praxi to znamená zejména nižší obsah kyslíku a glukózy v kultivačním prostředí, protože nekontrolovaný růst nádorové masy všeobecně vede k nedostatečnému zásobení jednotlivých buněk kyslíkem a živinami. Současně se jedná o snížené pH kultivačního média, což odpovídá podmínkám v nádorové tkáni, kde je pokles pH způsoben hromaděním odpadních produktů buněčného metabolizmu a CO₂ [3]. Buňky nádorové tkáně in vivo se s těmito problémy vyrovnávají pomocí specifických změn metabolizmu a stimulací neoangiogeneze [4].

Oproti normálně diferencovaným buňkám, které pro získání energie potřebné k buněčnému metabolizmu upřednostňují mitochondriální oxidativní fosforylaci, většina nádorových buněk přechází i za přítomnosti kyslíku na glykolýzu –  tento fenomén se označuje jako Warburgův efekt [5]. Aerobní glykolýza ovšem představuje ve srovnání s oxidativní fosforylací poměrně neefektivní cestu, jak energii ve formě ATP vyprodukovat. Proto se neustále diskutuje o tom, jaké další výhody může využívání aerobní glykolýzy nádorovým buňkám poskytovat. V současné době se má za to, že meziprodukty glykolýzy jsou důležité pro bio­syntetické procesy, které jsou nezbytné při rychlé proliferaci nádorových buněk [1,6,7]. Navíc produkce a hromadění laktátu přispívá k agresivnímu chování nádoru. Ukázalo se, že tvorba a akumulace laktátu narušuje metaboliz­mus T lymfocytů a tím brání nádorovou tkáň před imunitním systémem. Laktát také funguje jako antioxidant a přispívá tak k rezistenci vůči léčebným postupům, které využívají indukci reaktivních kyslíkových radikálů (reactive oxygen species –  ROS). Produkce laktátu dále indukuje degradaci extracelulární matrix a usnadňuje tak migraci nádorových buněk. Je také známo, že laktát je schopen indukovat angiogenezi [8–11].

Cévní zásobení nádorové tkáně se vyznačuje typickou chaotickou architekturou, postrádá lymfatické cévy a kromě jiného je také často příčinou vyššího tlaku v nádorové tkáni [12]. Neoangiogeneze tedy problémy v zásobování nádorové tkáně řeší jen částečně a chaotická architektura v kombinaci s relativně častými přestavbami cévního řečiště přispívá k heterogenitě nádorové tkáně. Pro nádorové mikroprostředí jsou charakteristické vlastnosti hypoxie, extracelulární acidóza a nedostatek glukózy, k nimž dochází právě v důsledku nedostatečného cévního zásobení. I z hlediska těchto podmínek je však nádorová tkáň značně heterogenní a jednotlivé oblasti nádoru se v uvedených parametrech mohou navzájem značně lišit [13].

Měření parametrů mikroprostředí v podmínkách in vivo

V minulosti bylo pH nádorové tkáně v podmínkách in vivo měřeno pomocí skleněných nebo ocelových mikroelektrod, nevýhodou těchto přístupů však byla jejich invazivita [14]. V současnosti jsou proto upřednostňovány neinvazivní metody, zejména pozitronová emisní tomografie (PET), magnetická rezonance (MRI), popřípadě optické měření s využitím fluorescenčně značených sond [14,15]. Obdobně tomu je i u měření parciálního tlaku kyslíku, kdy se místo jehlových elektrod [16] dnes využívají metody PET a MRI v kombinaci s exogenními, popř. endogenními markery. Jako exogenní markery jsou užívány nitrožilně nebo i orálně aplikované značené nitroaromatické sloučeniny. O nich je známo, že v buňkách dochází k redukci jejich nitro‑skupin na amino‑ skupiny, což je proces sice běžný, ovšem za nepřítomnosti kyslíku nevratný. Jako endogenní markery slouží proteiny, jejich exprese je spojena s přítomností nebo nepřítomností kyslíku a lze je detekovat např. v plazmě, krvi nebo imunohistochemicky v nádorové tkáni získané biop­­sií [17,18]. Pomocí PET a MRI, nejčastěji s využitím značených analogů příslušných sloučenin, se také stanovuje metabolická spotřeba glukózy, aminokyselin nebo lipidů v nádorové tkáni [19,20].

Změny obsahu kyslíku v nádorové tkáni

V lidských orgánech se koncentrace kyslíku významně liší mezi jednotlivými tkáněmi. V dobře prokrvených orgánech (např. játra, ledviny, srdce) se koncentrace kyslíku pohybuje v rozmezí 4– 14 %. Oproti tomu v relativně málo prokrvených orgánech, kam patří mozek (0,5– 7 %), oko (1– 5 %) či kostní dřeň (0– 4 %), jsou hodnoty nižší [21]. Hodnocení, kdy se v nádorovém mikroprostředí již jedná o hypoxii, je tedy třeba vždy poměřovat k okolní tkáni.

Hypoxie je jedním z nejtypičtějších jevů charakterizujících nádorovou tkáň. Asi polovina solidních nádorů bez ohledu na velikost a jiné parametry obsahuje hypoxické oblasti, které vznikají v důsledku exponenciální proliferace nádorových buněk v kombinaci se specifickou strukturou cévního řečiště [22]. Vzhledem k faktu, že kyslík je schopen ve tkáni difundovat pouze do vzdálenosti kolem 100 µm, se během růstu nádoru neustále zvyšuje nerovnováha mezi přísunem a spotřebou kyslíku [23–25].

Hypoxie výrazně ovlivňuje všechny metabolické procesy v buňce –  a to nejen způsob využívání glukózy a s tím spojený výše popsaný Warburgův efekt, ale je také příčinou využívání alternativních zdrojů energie, jako např. aminokyseliny glutaminu [5]. Dalším metabolickým procesem, který je spojován s hypoxií, je de novo syntéza mastných kyselin. Ta se u většiny nenádorových buněk vyskytuje jen ojediněle [26]. To je pro buňky nádoru jedna z možností, jak ovlivňovat redoxní rovnováhu porušenou zvýšenou glykolýzou [27]. V případě vyšší exprese syntázy mastných kyselin byla zjištěna korelace s agresivitou nádorového fenotypu [28]. Hypoxie také indukuje nebo naopak potlačuje expresi množství genů, které hrají důležitou roli v procesech angiogeneze, nádorové progrese, metastazování nebo při produkci glykolytických enzymů, růstových faktorů a transkripčních faktorů. Velmi často se tak děje prostřednictvím transkripčního faktoru HIF‑ 1α [29]. Již dlouho je také známo, že hypoxické nádorové buňky jsou 3– 5krát rezistentnější k ionizujícímu záření v porovnání s normoxií. To souvisí se schopností kyslíku vytvářet následkem ionizujícího záření ROS, které poškozují membrány buněk a mohou způsobovat i dvouřetězcové zlomy v molekule DNA. V hypoxických podmínkách tak není tvorba ROS pro efektivitu terapie dostatečná [30–32]. Stejným způsobem hypoxie zvyšuje rezistenci k ně­kte­rým léčivům, jako je cyklofosfamid, karboplatina nebo melphalan [33].

Možnosti navození hypoxie v podmínkách in vitro

Pro experimentální dosažení krátkodobého maximálního anoxického efektu je možné použít směs plynů 95% N₂/ /5% CO₂ a inkubaci ve fosfátovém pufru s přídavkem EC Oxyrase, což je bio­katalytické agens redukující zbytkový kyslík v inkubačním roztoku [34,35]. Nejčastější způsob, jak v laboratoři zajistit hypoxické podmínky, je využití hypoxické komůrky, popřípadě inkubátoru s možností úpravy a monitorování obsahu kyslíku v kultivační atmosféře. Inkubace při hladinách kritické hypoxie (1% O₂) se často využívají při výzkumu kmenových buněk, neboť hypoxie potlačuje diferenciaci a je považována za významnou vlastnost tzv. niche kmenových buněk [21,36], tedy specifického mikroprostředí okolo kmenových buněk, které se podílí na udržení bio­logických vlastností těchto buněk, zejména schopnosti sebeobnovy [37,38]. Stejně tak je hypoxie studována v souvislosti s hypotézou nádorových kmenových buněk a jejich mikroprostředí [39,40]. Tato teorie předpokládá existenci určité populace nádorových buněk s ně­kte­rými vlastnostmi buněk kmenových. Tyto vlastnosti, jako je vlastní niche, nižší frek­vence proliferace a naopak schopnost produkovat rychle se dělící progenitorové buňky, činí tyto buňky často rezistentní ke konvenční terapii.

Změny pH v nádorové tkáni

Další charakteristickou vlastností nádorové tkáně je alkalické intracelulární pH (pHi) s hodnotami v rozmezí 7,0– 7,4 a kyselé extracelulární pH (pHe), jehož hodnoty dosahují 6,2– 7,0 [41]. U nenádorových tkání je tomu naopak –  hodnoty pHi se pohybují v intervalu 6,99– 7,2 a hodnoty pHe okolo 7,4 [42,43]. Acidifikace nádorového mikroprostředí je přisuzována slabě rozvinuté cévní síti v nádorové tkáni a akumulaci kyseliny mléčné, což je produkt aerobní glykolýzy, v extracelulárním prostoru [44]. Dalším významným zdrojem acidity v hypoxickém prostředí je CO₂ [13,45], který je přeměňován pomocí anhydrázy kyseliny uhličité na hydrogen­uhličitan a proton. Kyselé pHe v okolí nádoru je spojeno s jeho progresí, konkrétně se zvýšenou produkcí angiogenních faktorů a proteáz, s pozměněnou transkripcí genů a se zvýšením invazivity nádoru [46]. Nízké pH a nahromaděná kyselina mléčná také ovlivňuje imunitní reakci organizmu, neboť T lymfocyty podobně jako nádorové buňky upřednostňují glykolýzu i za přítomnosti kyslíku a přebytečné kyseliny mléčné se zbavují transportem do okolí díky koncentračnímu gradientu. V nádorovém prostředí je ovšem tento gradient zablokován a kyselina mléčná uvnitř T lymfocytů narušuje jejich metabolizmus a znemožňuje tak jejich správnou funkci [47]. Snížené pHe také přispívá k nestabilitě genomu, a to hlavně kvůli poškození reparačních mechanizmů. V podmínkách in vitro se potvrdilo, že buňky vystavené kyselému pH a hypoxii vykazovaly nižší schopnost reparace ve srovnání s buňkami kultivovanými v normoxických podmínkách. Příčinou je inhibiční působení nízkého pH a nízkého pO₂ na reparační systém N‑ ER (nucleotide excision repair) [48]. Další genomové změny jsou zapříčiněny klastogenním působením kyselého pH, které může způsobit zlomy DNA, výměny chromatid a přestavby chromozomů [49]. V nádorovém prostředí se rovněž často vyskytují buňky s poruchou reparačního systému MMR (DNA mismatch repair), jež jsou náchylnější ke vzniku spontánních mutací. Důvodem jejich zvýšeného výskytu je skutečnost, že buňky s touto poruchou jsou rezistentní k apoptóze vyvolané hypoxií nebo nízkým pH [46]. Kyselý charakter nádorového mikroprostředí je spojován také s rezistencí nádorových buněk k ně­kte­rým chemoterapeutikům. Může za to fakt, že množství chemoterapeutik se do buněk dostává v neu­trální formě a díky působení kyselého pH dochází k protonaci chemoterapeutických činidel a tím ke znemožnění jejich prostupu přes cytoplazmatickou membránu. Mezi takto ovlivněná chemoterapeutika patří např. vinkristin a doxorubicin [44]. V nádorovém mikroprostředí in vivo je tedy jejich příjem buňkou snížen a pacient se stává k daným léčivům rezistentním. V současnosti se proto využívají různé přístupy, jak takovéto lékové rezis­tence překonat –  patří k nim např. alkalizace nádorového mikroprostředí nebo enkapsulace léčiv do micel [25].

Možnosti navození změn pH v podmínkách in vitro

Pro navození acidických podmínek se v systémech in vitro využívá především upravené médium, v kterém jsou buňky kultivovány za jinak standardních podmínek. Do média se přidává specifický organický pufrovací systém, aby v kultivačních podmínkách (37°C/ 5% CO₂₎ bylo udrženo žádané pH. Nejčastěji se pH upravuje na hodnoty v rozmezí pHe 6,5– 6,8 pomocí NaOH a HCl. Pro výzkum působení alkalického prostředí používají různí autoři rozdílné hodnoty pH i odlišné pufry.

Popsáno bylo např. použití 15mM MES (2- (N‑ morpholino) ethanesulfonic acid) a Bis‑ Tris při výzkumech vlivu nízkého pH na vznik chromozomálních aberací [49,50]; 25 mM HEPES (4- (2- hydroxyethyl)- 1-piperazineethanesulfonic acid) [48] a 25 mM MOPS (4-morpholinepropanesulfonic acid); 20 mM HEPES, 20 mM MES a 10 mM tricin l [41] a také 25 mM NaHCO3 [13].

Změny koncentrace glukózy v nádorové tkáni

Specifickým rysem nádorového mikroprostředí je glukózový deficit. Zatímco průměrná koncentrace glukózy v krvi se typicky pohybuje okolo 1 220 nmol/ g, tj. asi 5,6 nmol/ l, v nádorové tkáni byly zaznamenány hodnoty několikanásobně nižší [51,52]. Hlavní příčina tohoto deficitu je nedostatečné prokrvení nádorové tkáně způsobené chaoticky řízenou angiogenezí. Další příčina může být vyšší spotřeba glukózy, ze které nádorové buňky získávají energii častěji glykolýzou než oxidativní fosforylací, a proto jí na stejné množství získané energie spotřebují více. Zvýšená spotřeba glukózy má i přímou souvislost s hypoxií, neboť ně­kte­ré enzymy důležité pro glykolýzu jsou regulovány transkripčním faktorem HIF‑ 1 [25]. Metabolizmus glukózy a s ním spojené hromadění laktátu může mít nejen vliv na agresivní chování nádoru a případnou léčbu, jak bylo zmíněno výše, ale glukózová deprivace v kombinaci s hypoxií a nízkým pH může na progresi a expanzi nádoru působit i bezprostředně, protože většina buněk vznikajícího nádoru není schopna se těmto změněným podmínkám přizpůsobit a typickým výsledkem je tak buď indukce nekrózy, nebo apoptózy. Výše zmíněné nádorové kmenové buňky ovšem mohou tuto selekci přežít a v kombinaci s rezistencí k léčbě pak představují potenciální riziko recidivy onemocnění. Identifikace takovýchto buněk a pochopení specifik jejich bio­logických vlastností otevírá nové perspektivy v protinádorové terapii [25,53–55].

Možnosti navození změn koncentrace glukózy v podmínkách in vitro

Vliv snížené hladiny glukózy na nádorově transformované buňky je nejčastěji studován pomocí inkubace v bezglukózovém médiu pouze s přídavkem fetálního telecího séra (10– 15 %) se sérovým obsahem glukózy [56,57], nebo s přidanou glukózou v nižším množství, než je v běžném médiu s nízkým obsahem glukózy (5 mM). Například Raffaghello et al [58] popisují, že prostředí se sníženým množstvím glukózy (2,5 mM) může chránit savčí buňky před vysokými dávkami oxidativního poškození nebo před působením chemoterapeutik. Další možností studia je využití ně­kte­rých induktorů proteinů regulovaných glukózou (GRP), jako jsou např. deoxyglukóza, glukosamin či Calimycin A23187 [59].

3D kultivace

V poslední době se výzkumu nádorového mikroprostředí in vitro otevírají nové možnosti v podobě kultivací v 3D strukturách. Výhoda takových kultivací je možnost simulovat nejen bio­chemické faktory, ale zároveň i mechanické podněty, u kterých bylo také zjištěno, že jejich modifikace může mít vliv na buněčný růst, migraci a invazivitu stejně jako na proliferaci a apoptózu [60]. Pochopitelně nejpřesnější simulací 3D prostředí je kultivace s využitím kompletních organizmů nebo jejich embryí. Mezi úskalí těchto přístupů ovšem patří nemožnost přesně definovat kultivační prostředí, nesnadné zobrazování kultivovaných buněk a také s těmito přístupy spojené otázky ekonomické a etické. V prostoru mezi 2D kultivačními modely a využitím kompletních organizmů se tak lze setkat nejčastěji s kultivacemi formou buněčných sfér a nebo s různými modely tkáňového inženýrství [61].

Tkáňové inženýrství bylo původně rozvíjeno ve snaze vyvinout funkční náhražky tkání a orgánů. To vedlo k vytvoření 3D matric a lešení, na která jsou v laboratoři nanášeny různé typy buněk za přítomnosti požadovaných růstových faktorů [62]. Lešení imituje podmínky podmínky přirozeně se nacházející v extracelulární matrix, což umožňuje buňkám nabýt přirozený tvar a zajistit přirozenou tkáňovou organizaci [63]. Tyto 3D kultivace rychle zaujaly své místo ve výzkumu, kde jsou využívány především pro sledování angiogenních a tumorigenních mechanizmů nádoru [62].

Buněčné sféry jsou v porovnání s tkáňovým inženýrstvím jednoduché 3D modely, založené na schopnosti adhrentních buněk agregovat. Tyto modely nevyžadují lešení a mohou být jednoduše pozorovány mikroskopem. Svoje uplatnění nacházejí především v modelaci růstu solidních nádorů a studiu schopností metastazovat [64]. Nevýhodou sfér je neschopnost transportu látek a tak se díky hladovění a toxicitě nahromaděných metabolitů ve sférách větších než 1 mm tvoří centra s odumřelými buňkami [63].

Problém s transportem látek, přísunem kyslíku a živin v 3D kulturách v současnosti řeší bio­reaktory. Tyto přístroje jsou integrovány s výše uvedenými 3D modely a umožňují přesnou a reprodukovatelnou kontrolu podmínek požadovaných při kultivaci, jako je teplota, pH, střední průtok, hladina kyslíku, přívod živin nebo odstranění metabolitů [63].

Ačkoliv mají přístupy 3D kultivace stále ještě ně­kte­ré limity, oproti běžným 2D kultivacím v podmínkách in vitro jsou schopny poskytovat informace, které mnohem lépe reflektují specifika bio­logie solidních nádorů, a to navíc rychleji a levněji v porovnání se zvířecími modely.

Práce byla podpořena projektem CEB: OP VK CZ.1.07/2.3.00/20.0183, dále projektem MUNI/C/0944/2013 a Evropským fondem pro regionální rozvoj a státní rozpočet České republiky (RECAMO; CZ.1.05./2.1.00/03.0101).

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

RNDr. Petr Chlapek, DiS., Ph.D.

Laboratoř nádorové biologie

Ústav experimentální biologie

Přírodovědecká fakulta MU

Kotlářská 2

611 37 Brno

e-mail: chlapek@sci.muni.cz

Obdrženo: 15. 1. 2014

Přijato: 5. 5. 2014