Imunológia

Diagnostika ťažkých kombinovaných imunodeficiencií pomocou epizómov DNA

Čižnár P.¹, Horáková J.², Švec P.², Boďová I.², Šufliarska S.², Libai-Véghova L.², Borte S.³

¹1. detská klinika LFUK a DFNsP, Bratislava, Slovenská republika

²Klinika detskej hematológie a onkológie DFNsP, Bratislava, Slovenská republika

³Translational Centre for Regenerative Medicine, Leipzig, Nemecko 

Cieľ štúdie:U detí s klinicky a geneticky potvrdenou ťažkou kombinovanou imunodeficienciou (SCID) sa retrospektívnou analýzou krvných vzoriek z ich novorodeneckého skríningu stanovila koncentrácia epizómov DNA ako včasného markera defektu T lymfocytov.

Metódy: Segmenty DNA, ktoré vznikajú v procese dozrievania T lymfocytov odštiepením počas rekombinácie A lokusu receptora, sa označujú ako excízne krúžky T receptora – TREC (T-Receptor Excision Circles). Tieto stabilné epizómy DNA sa nedelia spolu s bunkou a ich kvantitu je možné stanoviť polymerázovou reťazovou reakciou v reálnom čase. Za hraničnú hodnotu sa považovalo 10 kópií v 1 mikrolitry. Nižšie hodnoty TREC sa považovali za dôkaz nízkej tvorby T lymfocytov v týme, ktorá môže byť spojená s diagnózou ťažkej kombinovanej imunodeficiencie.

Výsledky: V priebehu 10 rokov bolo v DFNsP celkovo liečených 11 pacientov s fenotypom ťažkej kombinovanej imunodeficiencie metódou transplantácie krvotvorných buniek. V 7 prípadoch bol potvrdený genetický defekt v známych génoch asociovaných s SCID. V troch prípadoch bola diagnóza stanovená imunologickým vyšetrením. U 4 pacientov sa jednalo o syndróm adenozín deaminázovej deficiencie, u 3 pacientov o defekt spoločného reťazca pre cytokíny IL2RG a u jedného dieťaťa sa potvrdila kompletná forma DiGeorgeovho syndrómu s mikrodeléciou 22q11. Analýza suchej kvapky krvi získaná eluáciou skríningovej kartičky potvrdila úplné chýbanie epizómov TRECu 10 detí. V jednom prípade bol počet kópií nad hraničnou hodnotou a vzorka bola vyhodnotená ako negatívna. Klinický obraz u tohto pacienta zodpovedal forme SCID s neskorým nástupom, po 1. roku života. Celková senzitivita testu bola 90,91 % (95% CI: 58,67–98,49), senzitivita pre včasné formy SCID bola 100 % (95% CI: 68,97–100,00).

Záver: Výsledky potvrdily vysokú senzitivitu testu pre včasné vyhľadávanie závažných defektov špecifickej bunkovej imunity, ktoré by bolo prínosom pre zaradenie do novorodeneckého skríningu ťažkých kombinovaných defektov imunity. 

Diagnosis of severe combined immunodeficiency by DNA episomes

Čižnár P.¹, Horáková J.², Švec P.², Boďová I.², Šufliarska S.², Libai-Véghova L.², Borte S.³

¹1st Pediatric Department LFUK and Children University Hospital (DFNsP), Bratislava, Slovak Republic

²Department of Pediatric Hematology and Oncology, Children University Hospital ( DFNsP), Bratislava, Slovak Republic

³Translational Centre for Regenerative Medicine, Leipzig, Germany 

Aim of study: By a retrospective analysis of blood samples from newborn screening of children with clinically and genetically confirmed severe combined immunodeficiency (SCID) we detected the levels of DNA episomes as a timely marker of severe T cell defect.

Methods: Segments of DNA which are produced during the process of T cell maturation, by splinting from A locus of T cell receptor recombination are assigned as T- cell receptor excision circles (TREC). These stable DNA episomes are not replicating with the cells and their quantity could be measured by a real-time polymerase chain reaction. The cut-off level for a positive sample was determined to be 10 copies per 1 micro liter. Lower levels of TREC was considered to prove low thymic T lymphocyte output associated with diagnosis of severe combined immunodeficiency.

Results: For a period of 10 years a total number of 11 patients with phenotype of severe combined immunodeficiency have been treated in Children University Hospital (DFNsP) Bratislava. Seven of these patients have got hematopoietic stem cells transplantation. Genetic defect in one of known genes associated with SCID was confirmed in seven patients. Three other cases were diagnosed by immunologic phenotype. Four mutations in ADA genes, 3 mutations in common gamma chain LI2RG genes and 1complete form of DiGeorge syndrome with micro-deletion 22q11 have been detected. Analysis of dry blood spot eluates confirmed absence of TREC episomes in 10 children. One patient with a late onset phenotype, after the first year had the number of TREC copies over the detection limit. Total sensitivity was 90.91% (95% CI: 58.67–98.49), sensitivity of early forms of SCID was 100% (95% CI: 68.97–100.00).

Conclusion: Results confirmed high sensitivity for timely screening of severe defects of specific cellular immunity. Incorporation of this method in to the Slovak newborn screening could help to diagnoses children before severe clinical complications develop.

Hereditárny angioedém v pediatrickej praxi

Jeseňák M., Bánovčin P.

Centrum pre hereditárny angioedém, Klinika detí a dorastu, Klinika pneumológie a ftizeológie, Univerzita Komenského v Bratislave, Jesseniova lekárska fakulty v Martine, Univerzitná nemocnica Martin

Hereditárny angioedém (HAE) predstavuje raritnú vrodenú poruchu imunity, ktorú charakterizujú rekurentné nealergické angioedémy kože a slizníc. Ochorenie je dedičné autozómovo dominantne a typicky pozorujeme postihnutie členov vo viacerých generáciách rodiny. Asi 25 % pacientov má ochorenie bez pozitívnej rodinnej anamnézy (t.j. de novo). V súčasnosti rozoznávame 3 typy HAE – pričom pri prvých dvoch dochádza k nedostatočnej tvorbe funkčnej významnej inhibičnej molekuly – C1-inhibítora (C1-INH), ktorý má svoje významné funkcie v komplementovom, fibrinolytickom ako aj kalikreín-bradykinínovom systéme. Práve nadmerná aktivácia týchto systémov vedie k nadmernej tvorbe bradykinínu, ktorý je príčinou vzniku angioedémov. Tretí typ HAE je vyvolaný dysfunkciou koagulačného faktora XII. Angioedémy sa vyskytujú najmä na koži (asymetrické opuchy končatín, tváre), v tráviacom trakte (často pod obrazom náhlej brušnej príhody) či v dýchacom systéme (laryngeálny edém). Opuchy nie sú typicky sprevádzané urtikáriou, nesvrbia, neodpovedajú na štandardnú antialergickú liečbu. Pacienti udávajú bolestivosť opuchov, prípadne pocit tlaku. Záchvat trvá obvykle 2–5 dní. U časti pacientov sa ako prodromálny príznak objavuje špecifický nesvrbivý kožný príznak označovaný ako erythema marginatum. Ochorenie ohrozuje pacientov predovšetkým sufokáciou v dôsledku laryngeálneho edému. Na základe frekvencii príznakov ako aj ich lokalizácie sa indikuje profylaktická liečba (androgény, kyselina tranexámová, koncentrát C1-inhibítora). Akútne záchvaty liečime koncentrátom ľudského alebo rekombinantného C1-INH, prípadne antagonistom bradykinínového receptora. V Amerike sú registrované aj iné lieky (napr. inhibítor kalikreínu). Vzhľadom na potenciálne a nepredikabilné riziko laryngeálneho angioedému je nevyhnutné ochorenie čo najskôr diagnostikovať a pacientovi poskytnúť pohotovostnú liečbu. Ak sa v rodine vyskytuje HAE, potrebné je vyšetrenie všetkých pokrvných príbuzných, a to aj asymptomatických. V súčasnosti na Slovensku evidujeme približne 80 pacientov s HAE, avšak predpokladá sa, že minimálne rovnaký počet ostáva nediagnostikovaný. 

Práca bola podporená projektom Martinské centrum pre biomedicínu (BioMed Martin, ITMS 26220220187), ktorý je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ.

Hereditary angioedema in paediatric praxis

Jeseňák M., Bánovčin P.

Center for Hereditary Angioedema, Department of Paediatrics, Department of Pulmonology and Phthisiology, Comenius University in Bratislava, Jessenius Faculty of Medicine, University Teaching Hospital in Martin 

Hereditary angioedema (HAE) represents a rare form of primary immunodeficiency, which is characterized by recurrent non-allergic angioedemas of skin and mucosal membranes. HAE is inherited in autosomal dominant way and typically, involvement of several family members in different generations can be observed. Approximately 25% of the patients has the diseases de novo – without positive family history. Today, three types of HAE can be discriminated –1st and 2nd type is caused by deficiency of functional important inhibitory protein C1-inhibitor (C1-INH), which has many important functions in complement, fibrinolytic and kallikrein-bradykinin system. Overactivation of these system without the inhibition by C1-INH leads to the increased production of bradykinin, which leads to the development of angioedemas. 3rd type of HAE is caused by dysfunction of coagulation factor XII. Angioedemas are localized on skin (asymmetric oedemas of limbs or face), gastrointestinal tract (under the picture of sudden abdomen events) or in respiratory tract (laryngeal oedema). Oedemas are typically without urticaria, without pruritus and they do not respond to the standard anti-allergic treatment. Attacks of angioedemas are painfult and tense and last for 2–5 days. In certain patients, the prodromal skin rash called erythema marginatum can be seen. HAE could lead to the suffocation due to laryngeal oedema. Based on the severity and frequency of the attacks, prophylactic therapy could be applied (androgens, tranexamic acid, concentrate of C1-INH). Acute attacks can be treated by concentrate of human or recombinant C1-INH or by antagonist of bradykinin receptor. In America, also another potential therapies are registered (e.g. kallikrein inhibitor). Regarding the dangerous laryngeal angioedema, it is essential to establish the diagnosis as soon as possible with administration of adequate rescue therapy to each patient. It there is a patient with HAE in family, it is necessary to screen also other family members, also those asymptomatic. Currently, approximately 80 patients with HAE have been revealed in Slovakia, however, the same number of the patients are probably non-diagnosed and non-treated.

Úspešná liečba alergickej bronchopulmonálnej aspergilózy omalizumabom u dieťaťa s cystickou fibrózou

Urbanová V., Feketeová A.

Klinika detí a dorastu, Univerzita Pavla Jozefa Šafárika v Košiciach, Lekárska fakulta a Detská fakultná nemocnica, Košice 

Alergická bronchopulmonálna aspergilóza (ABPA) patrí k zriedkavým ale závažným komplikáciam cystickej fibrózy. Príčinou stavu je hypersenzitívna reakcia na Aspergilový antigén, ktorá vyvoláva agresívnu, zápalovými mediátormi indukovanú deštrukciu pľúcneho tkaniva a dýchacích ciest s progresívnym poklesom pľúcnych funkcií. Charakteristickými prejavmi sú zvýšené sérové koncentrácie celkového IgE, vysoký titer IgE protilátok proti Aspergilovým antigénom, pískanie a bronchiektázie. Štandardnou líniou liečby ABPA sú systémové kortikosteroidy a antimykotiká. V ojedinelých prípadoch však ani intenzívna kombinovaná liečba nie je dostatočne efektívna a prináša závažné vedľajšie účinky. Novšou terapeutickou voľbou je monoklonálna anti-IgE protilátka (omalizumab), ktorá blokuje väzbu IgE na receptory efektorových buniek, čím sa oslabuje nežiadúca imunitná reakcia v pľúcnom tkanive. Klinické skúsenosti s  liečbou omalizumabom u kortiko-dependentných pacientov s cystickou fibrózou sú v začiatkoch a opierajú sa len o anekdotálne kazuistické prípady.

Autori uvádzajú zaujímavú kazuistiku 15-ročného chlapca s cystickou fibrózou (homozygot pre mutáciu delta F508) s komplikovanou klinicky závažnou ABPA. V laboratórnom obraze dominovali vysoké celkové IgE (>1000 IU/mL) a silne pozitívne špecifické IgE protilátky na Aspergillus fumigatus, CT pľúc preukázalo signifikantné zhoršenie chronických zmien a peribronchovaskulárne šírenie drobných nodulácií. Napriek intenzívnej terapii kortikoidmi a antimykotikami (Itrakonazol) sa v krátkom období 6 mesiacov opakovali závažné exacerbácie ABPA s dramatickou alteráciou celkového stavu. Navyše sa u chlapca plne rozvinul kortikoidmi indukovaný diabetes, ktorý bol ťažko kontrolovateľný inzulínom. Po zlyhaní štandardnej liečby sme u pacienta indikovali omalizumab, ktorý viedol k signifikantnej úprave respiračných prejavov. Je pozoruhodné, že v priebehu 8-mesačnej terapii omalizumabom nemal pacient ani jednu exacerbáciu ABPA, pľúcne funkcie sa stabilizovali a kortikosteroidy vysadili. Naša kazuistika podporuje dobrý účinok anti-IgE protilátky pri exacerbujúcej ABPA rezistentnej na kombináciu systémových steroidov a antimykotík.

The successful treatment of allergic bronchopulmonal aspergiollosis by the means of omalizumab in a child with cystic fibrosis

Urbanová V., Feketeová A.

Department of Paediatrics and Adolescent Medicine, Pavol Jozef Šafárik University in Kosice, Faculty of Medicine and Children Faculty Hospital, Košice 

Allergic bronchopulmonal aspergiollosis (ABPA) is one of the rare but a very serious complication of cystic fibrosis. The cause of the disease is a hypersensitive response to the Aspergillus antigen that induces an aggressive destruction changes in the airways induced by inflammatory mediators with the progressive decline in pulmonary function. ABPA is characterized by increased of the concentration of total serum IgE level, the high titer of serum IgE antibody to Aspergillus fumigatus, wheezing and bronchiectasis. Approved treatments for ABPA include systemic steroids and antifungal agents. Not even the intensive combined treatment is effective enough in sporadic cases and it brings on the serious sides effects. The monoclonal anti-IgE antibody (omalizumab) is a new therapeutic choice that prevents binding of IgE to the receptor effector cells which reduces adverse immune reaction in the pulmonary tissue. The clinical experiences with omalizumab treatment in steroid-dependent cystic fibrosis patients are only at the beginning and they are based only on anecdotal case reports.

The authors present an interesting case of 15 years old child with cystic fibrosis (homozygous dF508) complicated by the clinically serious ABPA. The highly elevated levels of total IgE (>1000 IU/mL) and the positive specific IgE antibodies to Aspergillus fumigatus were found in the laboratory findings, and CT of the lungs demonstrated significant deterioration of the chronic changes and peribronchovaskcular spread of small nodules. The serious exacerbation of ABPA returned 5 times during the short period of 6 months with dramatic alteration of the clinical condition despite of the intensive steroids and antifungal (Itraconazole) treatment. Additionally, there appeared corticoid-induced diabetes mellitus which was difficult to control with insulin. After the failure of standard treatment we indicated omalizumab that led to a significant improvement of the respiratory manifestations. Remarkably, during the 8 months therapy with omalizumab our patient had no exacerbation of ABPA, the pulmonary function were stabilized and corticosteroids were discontinued. Our case report supports an effect of anti-IgE antibody in exacerbation of resistant ABPA to the combination of systemic steroids and antifungal agents.

Alergia na bielkoviny kravského mlieka – súčasný praktický pohľad

Jeseňák M.¹, Havlíčeková Z.¹, Košturiak R.^1,2, Petrovičová O.¹, Jakušová Ľ.¹, Bánovčin P.¹

¹Klinika detí a dorastu, Univerzita Komenského v Bratislave, Jesseniova lekárska fakulty v Martine, Univerzitná nemocnica Martin

²Ambulancia klinickej imunológie a alergológie, Nitra 

Alergia na bielkoviny kravského mlieka (ABKM) predstavuje obvykle prvý klinický prejav alergie u dieťaťa, s ktorým sa stretne každý pediater. Klinické prejavy ABKM môžu postihovať viaceré orgánové systémy, pričom najčastejšie sa spája s prejavmi z tráviaceho traktu a kože. Prognóza ABKM je v zásade priaznivá a do 3. roku života nadobudne toleranciu viac ako 90 % detí. Aj napriek tomu, že ide o tému známu a často diskutovanú, v diagnostike aj manažmente týchto pacientov sa stretávame s viacerými omylmi ako aj nesprávnymi postupmi. Diagnostika ABKM pozostáva tak z klinických ako aj laboratórnych testov a vyšetrení, pričom za zlatý štandard sa považuje dvojito-zaslepený, placebom-kontrolovaný orálny záťažový test, ktorému predchádza prísna diagnostická bezmliečna eliminačná diéta. U detí v prvých rokoch života pri dominancii objektívnych príznakov možno zvoliť aj otvorený záťažový test. V prípade samotného stanovenia diagnózy ABKM majú laboratórne a kožné testy len doplnkový význam popri eliminačno-expozičnom teste. V paneli laboratórnych testov možno použiť stanovenie hladiny špecifických IgE proti bielkovinám kravského mlieka (extrakty). Stanovenie špecifických protilátok iných izotypov (IgG, IgA, IgM) dnes nemá miesto v diagnostickom algoritme ABKM. Klinický význam majú aj kožné testy, či už prick testy alebo atopické (alergické) náplasťové patch testy. Súčasné možnosti laboratórnej diagnostiky rozšírili v ostatných rokoch testy stanovenia špecifických IgE proti jednotlivým alergénovým komponentom kravského mlieka (CRD, component-resolved diagnosis), ktoré sa ukazujú ako vhodný prostriedok najmä predikcie rizika reakcií ako aj predpovede nadobudnutia tolerancie v budúcnosti. Alergénové komponenty kravského mlieka sa označujú Bos d z latinského Bos domesticus (tur domáci). Senzibilizácia na termostabilný kompoment (Bos d8 – kazeín) je markerom perzistencie alergie ako aj klinickej závažnosti reakcií. Senzibilizácia na termolabilné alergény (napr. Bos d5 – β-laktoglobulín alebo Bos d4 – α-laktalbumín) ukazuje riziko reakcií na čerstvé mlieko. Pokles protilátok proti jednotlivým komponentom (najmä proti Bos d 8 – kazeínu) je sprevádzaný nástupom tolerancie. Diagnostika ABKM pozostáva najmä z eliminačno-záťažového testu s možným doplňujúcim významom kožných testov a niektorých vybraných laboratórnych vyšetrení. Súčasné možnosti predikcie rizika závažnosti reakcií ako aj perzistencie alergie rozširuje komponentová diagnostika.

Práca bola podporená grantom VEGA 1/0252/14.

Cow milk proteins allergy – current practical view

Jeseňák M.¹, Havlíčeková Z.¹, Košturiak R.^1,2, Petrovičová O.¹, Jakušová Ľ.¹, Bánovčin P.¹

¹Department of Paediatrics, Comenius University in Bratislava, Jessenius Faculty of Medicine, University Teaching Hospital in Martin

²Outpatient Clinic for Clinical Immunology and Allergology, Martin 

Cow milk proteins allergy (CMA) represents usually the first cli-nical presentation of allergy in infants, which can be seen by each paediatrician. Clinical symptoms of CMA could be focused on different organs, but skin and gastrointestinal tract are one of the most involved organ system. CMA prognosis is good and more than 90% of children achieve the clinical tolerance by the age of 3 years. Despite the fact, that this topic is well-known and frequently discussed, there are many mistakes and flaws in the diagnosis approach and clinical management of these patients. CMA diagnosis algorithm consists from both clinical and also laboratory tests and examinations. The gold standard for CMA diagnosis is double-blind placebo-controlled oral food challenge after strict exclusion milk-free diet. In children with objective symptoms during the first years of life, open oral challenge could be also used. In case of the estimation of CMA diagnosis, laboratory and skin tests have only complementary meaning besides the elimination-challenge tests. In the panel of laboratory tests, the measurement of specific IgE against proteins of cow milk (extracts) could be used. Measurement of other subtypes of milk-specific antibodies (IgG, IgA, IgM) does not have position in the current diagnostic algorithm. Skin tests (skin prick tests or atopy patch tests) can be also used. Current diagnostic possibilities are now enlarged by the measurement of specific IgE against cow milk protein components (so-called component resolved diagnosis). It was shown, that these test can be used for the evaluation of the risk of CMA persistence, severity of clinical reactions and for the detection of possible development of clinical tolerance to cow milk. Allergen components of cow milk are named Bos d (lat. Bos domesticus). Sensibilization against thermostable component (Bos d8 – casein) could be considered to be a marker of allergy persistence and severe clinical reactions to all the forms of cow milk prediction. Sensibilization to thermolabile components (e.g. Bos d5 – β-lactoglobulin, Bos d4 – α-lactalbumin) shows only the risk of reactions to fresh milk. Decline of specific IgA against particular components (especially against Bos d8) is usually accompanied by the development of clinical tolerance. Diagnostic algorithm of CMA consists from elimination-challenge tests with possible complementary contribution of skin tests and selected laboratory examinations. Current diagnosis possibilities enlarges also the measurement of specific IgE against different components of cow milk with many potential clinical applications. 

The work work was supported by Grant VEGA 1/0252/14.