Význam metabolitů vitaminu D a správnost jejich stanovení – editorial

Komentář k | Editorial on

Vaňuga A et al. Úskalia stanovenia vitamínu D. Vnitř Lék 2017; 63(6): 403–408.

Vitamin D je neaktivním prekurzorem biologicky účinného 1α,25-dihydroxyvitaminu D [1α,25(OH)₂D], který spolu s parathormonem a kalcitoninem řídí homeostázu vápníku. Do organizmu se vitamin D dostává exogenně ve formě vitaminu D₂ (ergokalciferol) přítomného např. v rybím oleji a mléce, ale hlavním zdrojem vitaminu D je jeho endogenní biosyntéza z prekurzoru 7-dehydrocholestrolu, u kterého je fotolyticky po expozici plazmatické membrány keranocytů v kůži slunečním světlem o vlnových délkách 285–320 nm otevřen kruh B. Z tohoto previtaminu D₃ vzniká spontánní izomerací při tělesné teplotě vitamin D₃ (cholekalciferol).

Z hlediska biologické funkce je otázkou, zda je vitamin D₂ rovnocenný s vitaminem D₃. Někteří autoři uvádějí, že vitamin D₂ zvyšuje hladinu 25(OH)D méně účinně než vitamin D₃ a že nutriční efekt obou vitaminů D není ekvivalentní, popř. že podávání D₃ starším pacientům vedlo k redukci počtu zlomenin, přičemž tohoto výsledku nebylo dosaženo podáváním D₂ apod. Obvykle je koncentrace cirkulujícího vitaminu D₂ a jeho metabolitů více než 10krát nižší než koncentrace vitaminu D₃ a jeho metabolitů. Oba druhy vitaminu D, tj. D₂ a D₃, se liší v postranním řetězci molekuly na 17β-pozici sekosteroidu (vitamin D₂ má jednu dvojnou vazbu a jednu metylovou skupinu navíc), jejich další metabolická cesta je ale stejná, tj. pomocí hydroxyláz patřících do rodiny cyto­chrom P450 enzymů nejprve probíhá hydroxylace vitaminu D v poloze C25 prostřednictvím v játrech produkované 25-hydroxylázy za vzniku 25-hydroxyvitaminu D [25(OH)D]. Koncentrace tohoto biologicky ještě ne­účinného metabolitu vitaminu D v krvi odráží míru zásobení organizmu vitaminem D z exogenních (D₂) i endogenních (D₃) zdrojů.

Biologicky aktivní, hormonálně účinný 1α,25-dihydroxyvitamin D [1α,25(OH)₂D] vzniká v ledvinách účinkem hormonálně [PTH stimuluje, 1α,25(OH)₂D vykazuje negativní zpětnou vazbu] regulované 1α-hydroxylázy. V ledvinách, ale i ve většině dalších tkání, existuje enzym 24-hydroxyláza, která katalyzuje syntézu 24,25(OH)₂D z 25(OH)D, především však inaktivuje 1α,25(OH)₂D jeho přeměnou na 1α,24,25(OH)₃D. Na vlastní inaktivaci se 1α,25(OH)₂D podílí tím, že stimuluje expresi 24-hydroxylázy.

Málo je známo o dalších metabolitech vitaminu D, ať již se jedná o 23,25(OH)₂D, nebo o různé oxidované formy typu 25-OH-24 oxo-D₃, 23,25(OH)₂–24-oxo-D₃, a také o glukuronidové nebo sulfátové konjugáty. Dalším potenciálně biologicky aktivním metabolitem vitaminu D nalezeným v řadě tkání je epimer 1α,25(OH)₂D, tj. 3-epi-1α,25(OH)₂D vznikající z 25(OH)D účinkem hydroxylázy nepatřící do rodiny cytochrom P450 enzymů. Celkem bylo izolováno a chemicky charakterizováno více než 37 různých metabolitů vitaminu D. 1α,25(OH)₂D realizuje svoji biologickou funkci interakcí s jaderným receptorem specifickým pro vitamin D (VDR), ale i negenomicky interakcí s membránovými receptory cílových buněk.

Ledviny jsou téměř výlučným zdrojem cirkulujícího 1α,25(OH)₂D, ale i řada dalších buněk a tkání exprimuje 1α-hydroxylázu, a mohou tak lokálně autokrinním či parakrinním mechanizmem vytvářet 1α,25(OH)₂D. Tento hormon je klíčovým regulátorem homeostázy kalcia a fosforu ve smyslu absorpce střevního kalcia a mobilizace kalcia z kosti, ale má také silné antiproliferativní, prodiferenciační, proapoptické a imunomodulační (suprese humorální odezvy, aktivace celulární odezvy) účinky. Tyto vlastnosti 1α,25(OH)₂D jsou úzce spjaté s karcinogenezí a dostupnost 25(OH)D pro lokální biosyntézu 1α,25(OH)₂D v extrarenálních buňkách je významná v prevenci maligních onemocnění.

Dlouhodobý nedostatek vitaminu D a z něho vyplývající snížení hladiny 1α,25(OH)₂D způsobuje křivici u dětí a osteomalacii u dospělých. Spolu s nedostatkem kalcia a dalšími změnami souvisejícími se vzrůstajícím věkem se podílí i na osteoporóze, alopecii, slábnutí svalů, vývoji sekundárního hyperparatyreoidizmu u pacientů s chronickou renální nedostatečností a současný výzkum naznačuje i jeho spojení se zvýšeným krevním tlakem, s depresí, s poruchami imunitního systému vedoucími k mnohočetné skleróze, k revmatické artritidě a k diabetu. Všechny buňky imunitního systému exprimují VDR a jeho stimulace má za následek aktivaci vrozené imunitní odezvy realizované obecným obranným mechanizmem (makrofágy apod), naopak ale dochází k potlačení specifické imunitní odezvy selektivní inhibicí antigenem aktivovaných T buněk. Nedostatek vitaminu D má za následek nedostatečnou aktivaci VDR, což umožňuje vývoj autoreaktivních T-lymfocytů, naopak přítomnost 1α,25(OH)₂D a funkčního VDR nastoluje rovnováhu a zabraňuje vývoji autoimunity. Téměř všechny VDR pozitivní buňky odpovídají na interakci s 1α,25(OH)₂D utlumením buněčné replikace v důsledku snížení hyperfosforylace proteinů podílejících se na buněčném cyklu a u většiny tkání dochází k indukci diferenciace. V současné době roste počet studií, ze kterých vyplývá vztah mezi prevalencí výskytu rakoviny především tlustého střeva, prostaty a prsu, ale i řady dalších maligních onemocnění, a mírou zásobení organizmu vitaminem D.

Z výše uvedeného je patrné, že správné stanovení vitaminu D a jeho metabolitů z hlediska přesnosti, ale především pravdivosti, je velkou výzvou do budoucnosti a vývoj technik, které toto správné stanovení umožní, bude odrážet potřeby, které neustále vzrůstají vzhledem k významu vitaminu D a jeho metabolitů. Výhodou imunoanalytických postupů je velká kapacita stanovení a analytická citlivost v řádu pg/zkumavku. Imunoanalytické stanovení hydroxylovaných metabolitů vitaminu D je ale také zatíženo řadou problémů, přičemž největším je specificita použité protilátky, která může zkříženě interagovat jak s metabolity vitaminu D₃, tak i s metabolity vitaminu D₂. Poměrně vysoké zkřížené reakce mají protilátky některých výrobců vůči 24,25(OH)₂D, přičemž v cirkulaci je tento metabolit v nanomolovém množství. Zásadní je rovněž problém se specificitou protilátky při stanovení 1α,25(OH)₂D, jehož koncentrace je přibližně o 3 řády nižší než koncentrace 25(OH)D. Nedostatečně účinný proces separace 1α,25(OH)₂D od 25(OH)D nebo použití protilátky vykazující i jen nízkou zkříženou reakci vůči 25(OH)D bude mít za následek falešně vysoké výsledky stanovení 1α,25(OH)₂D. Velmi málo je diskutována specificita používaných protilátek vůči konjugátům (sulfát, glukuronid) hydroxylovaných metabolitů vitaminu D, přičemž v cirkulaci může být i stejné množství např. 25(OH)D₃ a 25(OH)D₃–3-sulfátu. Dalším problémem může být silná vazba metabolitů vitaminu D na vitamin D vazebný protein (VDBP), který váže přibližně 85–88 % metabolitů vitaminu D v cirkulaci, zbytek cirkulujících metabolitů je vázán na albumin, pouze 0,03 % 25(OH)D a 0,4 % 1α,25(OH)₂D je v cirkulaci volných. Precipitace séra organickými rozpouštědly nebo kyselinami může vést ke ztrátám způsobeným koprecipitací metabolitů vitaminu D s vazebnými proteiny. Problémem je tedy standardizace použitých imunoanalytických kitů, kdy různé typy esejí dávají různé výsledky, na jejichž základě jsou odvozovány i různá referenční rozmezí a přijímají se klinická rozhodnutí, která nemusí odrážet skutečný stav zásobení populace vitaminem D.

Chromatografické postupy mají velkou výhodu ve skutečnosti, že umožňují separaci jednotlivých odlišně hydroxylovaných a jinak derivatizovaných (různé typy konjugátů, např. sulfáty a glukuronidy) metabolitů vitaminu D včetně rozlišení metabolitů cholekaciferolu (D₃) od metabolitů ergokalciferolu (D₂), nebo např. stanovení 3-epi-24,25(OH)₂D₃ vedle 24,25(OH)₂D₃. Nevýhodou mohou být v oblasti rutinních analýz relativně složité přípravy vzorků před vlastní chromatografickou analýzou (extrakce organickými rozpouštědly často spojená s extrakcí na pevné fázi a další chromatografickou předseparací), metody jsou limitovány kapacitně, a dihydroxylované metabolity vitaminu D [především 1α,25(OH)₂D] vyžadují citlivější postup detekce, než je obvyklá spektrofotometrická detekce v ultrafialové oblasti.

Obecně výhodné z hlediska univerzálnosti, citlivosti detekce, specificity, i z časového hlediska jsou postupy založené na kombinaci vysokoúčinného kapalinového chromatografu (HPLC) pracujícího v režimu reverzní fáze (RP-HPLC) s detekcí analytu provedenou na hmotovém detektoru (MS), který většinou pracuje v tandemovém zapojení (MS/MS). Je zde dvojí separační princip, tj. chromatografický a hmotově-spektrometrický, založený na poměru hmoty iontu k jeho náboji. Jednoznačnost stanovení jednotlivých metabolitů ve spektru řady dalších metabolitů vitaminu D, použití izotopicky značených standardů eliminujících vliv biologické matrice při kvantifikaci a další vývoj spojený s automatizací vedou k závěru, že imunoanalytické postupy stanovení metabolitů vitaminu D jsou nebo v blízké budoucnosti budou technikou MS překonány, a již nyní jsou postupy HPLC-MS/MS užívány jako vhodná referenční metoda stanovení metabolitů vitaminu D. Limitujícím faktorem je vysoká pořizovací cena přístroje, který zatím není běžnou součástí klinicko-biochemické laboratoře.

doc. Ing. Radovan Bílek, CSc.

rbilek@endo.cz

Endokrinologický ústav, Praha

www.endo.cz

Doručeno do redakce 20. 6. 2017