Terapie kritické končetinové ischemie u pacientů se syndromem diabetické nohy pomocí autologních kmenových buněk

Souhrn

Cíl:
Cílem naší práce bylo ověření bezpečnosti a účinnosti terapie kritické končetinové ischemie autologními kmenovými buňkami a posouzení případných nežádoucích účinků.

Metody:
Do studie bylo zařazeno 14 pacientů (11 mužů, 3 ženy, průměrný věk 61,9 ± 9,6 roku, průměrné trvání diabetu 23,5 ± 11,1 roku, průměrný glykovaný hemoglobin 6 ± 1 %). Osm pacientů bylo léčeno buňkami z kostní dřeně, 6 pacientů buňkami z periferní krve po stimulaci filgrastimem. Získaná suspenze kmenových buněk byla pak aplikována do svalů postižené dolní končetiny. Byl hodnocen vzestup hodnot transkutánní tenze kyslíku (TcPO₂), subjektivní vnímání bolesti podle Visual Analog Scale (VAS) a hojení defektů.

Výsledky:
U všech pacientů došlo k signifikantnímu vzestupu TcPO₂ z 10 ± 8,7 mm Hg před léčbou na 39,4 ± 9,5 mm Hg po 6 měsících (p = 0,0005) od aplikace. Dále byla pozorována signifikantní redukce plochy defektů a snížení bolesti, hodnocené VAS během sledovaného období: medián plochy defektu se snížil ze 4,3 (0,7–31,7) cm² před léčbou na 0,06 (0–0,5) cm² po 6 měsících od léčby (p = 0,0078). Snížení klidových bolestí bylo pozorováno u všech pacientů, průměrná hodnota VAS se snížila z 5,3 ± 1,8 před léčbou na 1,1 ± 1,3 po 6 měsících po aplikaci (p = 0,002).

Závěr:
Léčba syndromu diabetické nohy pomocí kmenových buněk je dle našich pilotních zkušeností u pacientů s těžkou ischemií dolních končetin účinnou metodou bez závažných nežádoucích účinků, která zvyšuje transkutánní tenzi kyslíku, zlepšuje hojení defektů a vede ke zmírnění klidových bolestí.

Klíčová slova:
kmenové buňky – diabetická noha – ischemie dolních končetin – revaskularizace

Úvod

Ischemická choroba dolních končetin (ICHDK) je jedním z nejvýznamnějších prognostických faktorů ovlivňujících hojení syndromu diabetické nohy a vede často k amputacím [1]. Diabetická makroangiopatie postihuje tepny dolních končetin multietážově, typicky vynechává proximální ileofemorální oblast a koncentruje se do oblasti tepen podkolenních. Diagnostika i terapie ICHDK u diabetu je velmi obtížná vzhledem k časté periferní polyneuropatii zmírňující nebo i eliminující typickou symptomatologii ICHDK. Mezi standardní léčebné metody ICHDK patří perkutánní transluminální angio­plastika (PTA) a cévní bypassy, jejichž efekt je v některých případech pouze dočasný a dochází k recidivám klinických příznaků. Až 1/3 pacientů s ischemií dolních končetin není vhodná ke standardní revaskularizaci a může profitovat např. z terapie autologními kmenovými buňkami [2].

K terapeutické revaskularizaci ICHDK pomocí autologních kmenových buněk lze využít 2 základní zdroje, které obsahují subpopulaci cévních progenitorových buněk – mononukleární frakci stromálních buněk kostní dřeně získanou trepanobiopsií – bone marrow stromal cells (BMSC) a frakci jaderných buněk získanou separací z periferní krve po předchozí aplikaci faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (G-CSF, filgrastim, Neupogen^TM) – peripheral blood progenitor cells – PBPC. Dalším poten­ciálním zdrojem jsou mezenchymální buňky z tukové tkáně – mesenchymal adipose derived cells (MADC), s nimiž jsou zatím v klinické praxi léčby ICHDK velmi malé zkušenosti.

Mezi povrchové znaky buněk, které se podílejí na novotvorbě cév, se řadí povrchový glykoprotein CD34 [3], receptor pro endoteliální růstový faktor VEGFR2 [4] a povrchový znak CD133. Další povrchové znaky jsou stále předmětem výzkumu [5]. Cirkulující angiogenní prekurzory monocytární řady (CD14⁺) hrají důležitou roli v angiogenezi u pacientů s diabetem, u kterých často dochází k supresi CD34⁺ buněk [3].

Jak BMSC, tak PBPC byly opakovaně využity k revaskularizaci ischemických končetin v klinických studiích. Dosavadní zkušenosti s terapií ICHDK pomocí kmenových buněk jsou pozitivní [6–9].

Při novotvorbě cév se uplatňují 3 hlavní mechanizmy [10]. Prvním je angiogeneze, fyziologický děj, který je indukován hypoxií a vede k tvorbě nových kapilár z preexistujících cév. Podstatou tohoto procesu je proliferace a migrace endotelových buněk spojená s inhibicí apoptózy. Druhým mechanismem je arteriogeneze – proces remodelace preexistujících arterioarteriálních anastomóz v maturované arterii stimulovaný hydrostatickým tlakem při cévní obliteraci a zvýšení průtoku kolaterálami. Třetím procesem je de-novo formace cév, která je zatím nejméně prozkoumaným dějem; jedná se o tvorbu vnitřních endote­liálních vrstev s následným zráním arteriol vrstvou svalových buněk. Není zatím jasné, jakou roli hraje diferenciace a exprese jednotlivých růstových faktorů produkovaných autologními kmenovými buňkami při jejich intramuskulární aplikaci ani které typy dřeňových nebo periferních kmenových buněk jsou v procesu revaskularizace nejefektivnější.

Cílem naší práce bylo ověření bezpečnosti a účinnosti terapie kritické končetinové ischemie autologními kmenovými buňkami 2 různými metodami jejich izolace a posouzení případných nežádoucích účinků v případech individuálně indikované léčby pacientů se syndromem diabetické nohy a závažnou ICHDK, neřešitelnou standardní revaskularizací.

Metodika

Do hodnocení byli zařazeni pacienti s klinickými projevy ICHDK u syndromu diabetické nohy (bolesti končetin a/nebo defekty nebo stav po nízké amputaci) a s nedostatečným efektem nebo nemožností provést standardní revaskularizaci. Nedostatečný efekt byl definován jako přetrvávající ischemie stanovená transkutánní tenzí kyslíku pod 30 mm Hg nebo hodnotou indexů kotníkového tlaku pod 0,6 – tj. stupeň ischemie PEDIS 3 dle mezinárodní klasifikace [11]. Pacienti s recentní hlubokou žilní trombózou, těžkým otokem končetiny, závažnou neléčenou retinopatií nebo s diagnostikovaným neoplastickým postižením jakéhokoli orgánu nebyli k této léčby indikováni.

Celkem bylo zhodnoceno 14 pacientů léčených v podiatrické ambulanci IKEM od ledna roku 2008 do března roku 2010 (11 mužů, 3 ženy, průměrný věk 61,9 ± 9,6 roku, průměrné trvání diabetu 23,5 ± 11,1 roku, průměrný glykovaný hemoglobin 6 ± 1 %) (tab. 1). Všichni pacienti byli podrobně vyšetřeni z hlediska virologie a genetických poruch srážlivosti. Byl proveden onkologický screening, včetně mammografického a gynekologického vyšetření u žen.

Osm pacientů bylo léčeno pomocí BMSC; odběr kostní dřeně byl proveden na operačním sále ve svodné nebo celkové anestezii. Technika odběru byla provedena standardní metodou dle Jamshidiho – odběr se prováděl z obou lopat kostí kyčelních několika vpichy na každé straně. Odebraná kostní dřeň byla transportována do laminárního boxu, kde byla provedena urychlená sedimentace pomocí gelofusinu a centrifugace.

Šest pacientů bylo léčeno PBPC – pacientům byl po dobu 3–6 dnů podáván G-CSF (filgrastim, Neupogen^TM) pro vyplavení buněk kostní dřeně do periferní krve. Po dosažení dostatečné koncentrace CD34 pozitivních buněk v periferní krvi byla provedena leukaferéza na autotransfuzní jednotce s použitím přístroje Haemonetics MCS+ v intermitentním režimu s opakovanými recirkulacemi a s končeným objemem buněčné suspenze 40–90 ml.

Získaná suspenze kmenových buněk byla pak v epidurální nebo celkové anestezii aplikována do svalů postižené dolní končetiny, nejčastěji do m. gastrocnemius v celém rozsahu, dále do svalů na dorzu a plantě postižené dolní končetiny. Po aplikaci byla provedena šetrná bandáž končetiny a zajištěna prevence flebotrombózy.

Následné sledování pacientů probíhalo v podiatrické ambulanci IKEM. V intervalech po 1 měsíci, 3 měsících a 6 měsících po aplikaci byla hodnocena transkutánní tenze kyslíku (TcPO₂) a subjektivní vnímání bolesti s využitím Visual Analog Scale (VAS, stupnice bolesti 0–10). Hojení defektů bylo hodnoceno zkušenou podiatrickou sestrou. U prvních 6 pacientů byla provedena digitální subtrakční angiografie (DSA) s odstupem 2 měsíců od aplikace.

Výsledky

Během sledovaného období po 6 měsících od aplikace kmenových buněk došlo k signifikantnímu zlepšení ischemie dolních končetin hodnocené měřením TcPO₂ na dorzu postižené dolní končetiny (graf 1). U všech pacientů došlo k vzestupu hodnot TcPO₂ z 10 ± 8,7 mm Hg na 30,2 ± 16,5 mm Hg po 1 měsíci (p = 0,0004); 34,3  ± 9,1 mm Hg po 3 měsících (p = 0,0002) a 39,4 ± 9,5 mm Hg po 6 měsících (p = 0,0005) od aplikace.

Dále byla pozorována signifikantní redukce plochy defektů a snížení bolesti hodnocené VAS během sledovaného období. Medián plochy defektu byl 4,3 (0,7–31,7) cm² před léčbou; 2,4 (0,2–23,4) cm² po 1 měsíci (p = 0,002); 0,27 (0–13,2) cm² po 3 měsících od léčby (p = 0,0039) a 0,06 (0–0,5) cm² po 6 měsících od léčby (p = 0,0078) (graf 2). Snížení klidových bolestí bylo pozorováno u všech pacientů, průměrná hodnota VAS před léčbou, 5,3 ± 1,8, byla snížena na 3,9 ± 1,7 po 1 měsíci (p = 0,02); 1,9 ± 1,8 po 3 měsících (p = 0,002) a 1,1 ± 1,3 po 6 měsících (p = 0,002) (graf 3).

U 13 ze 14 pacientů došlo ke zlepšení lokálního nálezu na dolní končetině, u 1 pacienta bylo nutné 2 měsíce po aplikaci vzhledem k progresi infekce provést amputaci v bérci. Jeden pacient zemřel 3 měsíce po aplikaci na srdeční selhání bez souvislosti s léčbou kmenovými buňkami. Až na přechodný edém končetiny v 1. týdnu po aplikaci jsme dosud nezaznamenali závažnější vedlejší účinky.

Nález na DSA, hodnocený po aplikaci stejného množství kontrastní látky stejnou rychlostí zkušeným intervenčním radiologem, byl zlepšen u 1 pacienta, u ostatních 5 pacientů byl beze změny nebo nehodnotitelný, dále jsme v provádění kontrolních DSA nepokračovali z důvodů rizika, které bylo vyšší než potenciální přínos tohoto vyšetření z hlediska hodnocení kolaterál.

Diskuze

Výsledky našeho hodnocení indivi­duální léčby závažné ischemie ukazují, že autologní kmenové buňky z kostní dřeně získané trepanobiopsií nebo separované z periferní krve po stimulaci mohou zlepšit ischemii končetin i hojení ulcerací a snížit bolest u pacientů se syndromem diabetické nohy.

V posledních letech bylo publikováno několik metaanalýz shrnujících výsledky klinických studií zabývajících se buněčnou terapií končetinové ischemie [9,10], z nichž vyplynulo, že léčba ischemie končetin kmenovými buňkami je účinnější než léčba samotným G-CSF, který ale může napomáhat léčbě infekce u pacientů se syndromem diabetické nohy [12].

Jedna z prvních randomizovaných studií publikovaná v Lancetu [6] hodnotila efekt terapie BMSC na ICHDK. 49 pacientů s ICHDK, definovanou jako index paže/kotník (ABI) < 0,6, s klidovými bolestmi nebo ulceracemi, bez možnosti další revaskularizace, bylo randomizováno do 2 skupin. Ve skupině A bylo 25 pacientů s převažující unilaterální ischemií; do ischemické končetiny byly aplikovány BMSC, do druhé (kontrolní) končetiny fyziologický roztok. Ve skupině B s bilaterální ischemií byly nohy pacientů randomizovány, do jedné nohy byly aplikovány BMSC, do druhé mononukleární frakce periferní krve. Následně bylo sledováno zlepšení klinického stavu, ABI, transkutánní tenze kyslíku (TcPO₂) a nálezu na angiografii. Byla prováděna digitální subtrakční angiografie (DSA) se striktně fixovanou pozicí katetru a stejným množstvím kontrastní látky. Po 24 týdnech došlo k signifikantně vyššímu vzestupu ABI a TcPO₂ u končetin léčených BSMC v porovnání s končetinami léčenými periferními mononukleárními buňkami (p < 0,0001). Angiografie byla zaslepeně hodnocena 2 radiology a jedním cévním chirurgem. Ke zlepšení angiografického nálezu došlo u 60 % ze 45 pacientů. Ke zmírnění klidové bolesti došlo u 80 % z 20 pacientů.

Jiná studie publikovaná v Diabetes Care [7] hodnotila účinek intramuskulární aplikace PBPC separovaných z periferní krve po stimulaci G-CSF. 28 pacientů s diabetem a kritickou končetinovou ischemií, definovanou jako klidové bolesti vyžadující analgetika, kotníkovým systolickým tlakem 50 mm Hg nebo palcovým tlakem 30 mm Hg s ulcerací nebo gangrénou, klasifikace dle Fontaina III nebo IV, bylo randomizováno na pacienty léčené PBPC a kontrolní skupinu (léčená Prostagalandinem E1 i.v.). Po 3 měsících došlo k signifikantnímu zvýšení průtoku měřenému laser dopplerem a k signifikantnímu zvýšení ABI u pacientů léčených PBPC. 78 % pacientů s ulcerací bylo zhojeno (vs 39 % u kontrolní skupiny). U pacientů léčených PBPC nedošlo po dobu 3měsíčního sledování k žádné amputaci, zatímco u kontrolní skupiny došlo k amputaci u 5 pacientů. Angio­grafický nález byl v porovnání s kontrolní skupinou signifikantně zlepšen.

Recentní metaanalýza z března roku 2010 [2] shrnula klinické studie zabývající se léčbou ICHDK kmenovými buňkami do ledna roku 2009 – bylo pozorováno zlepšení parametrů ischemie po 6 měsících od terapie kmenovými buňkami, a to jak transkutánní tenze kyslíku, tak dopplerovských indexů, snížení bolesti i zlepšení hojení ulcerací a snížení počtu amputací. Autoři dosud publikovaných prací se ale shodují v tom, že je nutné provádět další studie a pacienty sledovat dlouhodoběji [9]. Hypotetické nežádoucí účinky jako zhoršení diabetické retinopatie nebo akcelerace růstu tumorů nebyly pozorovány v žádné z dosud publikovaných klinických studií [10]. V České republice je v současné době léčba ICHDK pomocí autologních kmenových buněk v počátcích, byla aplikována pouze na několika pracovištích a zkušenosti s ní jsou na úrovni pilotních studií [13,14].

Nejnovější metaanalýza [15] shrnuje všechny preklinické a klinické zkušenosti s léčbou ICHDK pomocí kmenových buněk. Ve všech publikovaných randomizovaných a kontrolovaných studiích došlo ke zlepšení jak parametrů ischemie (ABI, TcPO₂), tak ke zmírnění klidových bolestí, prodloužení klaudikačního intervalu a snížení incidence amputací dolních končetin. Několik multicentrických randomizovaných studií zabývajících se touto problematikou nyní probíhá.

Hlavní limitací naší studie je nízký počet pacientů v souboru, shrnujeme tedy pouze pilotní zkušenosti s touto novou léčebnou metodou ICHDK. Studie nebyla randomizována, jednalo se o individuální terapii pacientů bez možnosti standardní revaskularizační léčby. Mezi další limitace studií zabývajících se problematikou terapie ICHDK kmenovými buňkami patří obtížná objektivizace účinku pomocí zobrazovacích metod a dosud nejasný mechanizmus účinku autologních kmenových buněk.

Závěr

Léčba syndromu diabetické nohy pomocí kmenových buněk je dle našich zkušeností u pacientů s těžkou ischemií účinnou metodou bez závažných nežádoucích účinků, která zvyšuje transkutánní tenzi kyslíku, zlepšuje hojení defektů a vede ke zmírnění klidových bolestí. Nebyl zjištěn významný rozdíl mezi buňkami z kostní dřeně a periferní krve po stimulaci Optimální způsob klinické aplikace této metody i objektivní hodnocení účinku vyžaduje další studie.

Práce byla podpořena grantem MZO 00023001.

MUDr. Michal Dubský
www.ikem.cz
e-mail: michal.dubsky@ikem.cz

Doručeno do redakce: 6. 10. 2010
Přijato po recenzi: 3. 12. 2010