EPCA a EPCA-2 jako potencionální biomarkery karcinomu prostaty

Souhrn

Detekce karcinomu prostaty pomocí krevního testu dosahuje vysoké míry úspěšnosti. Navzdory pozoruhodným úspěchům však má užití hladiny prostatického specifického antigenu (PSA) v rámci screeningu a detekce karcinomu prostaty jistá omezení. PSA není specifický pro karcinom prostaty, a jeho hladina je tedy zvýšená i při dalších onemocněních vyskytujících se u stárnoucích mužů jako například při benigní prostatické hyperplaziii (BPH) nebo prostatitidě. Závažnost tohoto problému ilustruje fakt, že více než 25 milionů mužů podstoupilo na základě zvýšené hodnoty PSA alespoň 1 biopsii, která měla negativní výsledek. V mnoha případech pak není zřejmé, zda karcinom nebyl pomocí biopsie detekován, nebo zda pacient ve skutečnosti žádný karcinom nemá. Z tohoto důvodu by specifičtější marker, který by umožnil identifikovat pacienty s karcinomem prostaty a odlišil je od jedinců bez karcinomu, představoval neocenitelnou pomůcku.

Pomocí proteomického přístupu se nám v naší laboratoři povedlo identifikovat nové biomarkery související s karcinomem prostaty. Jedním z charakteristických znaků karcinomatózní buňky je změna tvaru, velikosti a morfometrie jejího jádra. Vzhledem k tomu, že nukleární změny představují jednu ze základních charakteristik, která patologům umožňuje identifikovat buňky karcinomu, bylo naším cílem nalézt faktor na molekulární úrovni, který se bude shodovat s mikroskopickým nálezem patologa. Zaměřili jsme se proto na nukleární strukturální prvky, označované termínem nukleární matrix. Přitom jsme identifikovali 2 biomarkery, umožňující detekci karcinomu prostaty, které souvisejí se strukturou jádra: Early Prostate Cancer Antigen (EPCA) a Early Prostate Cancer Antigen 2 (EPCA-2). Jedná se o 2 rozdílné proteiny, které spojuje pouze metoda jejich objevu. Zatímco EPCA představuje tkáňový marker, potencionálně účinný při detekci karcinomu, EPCA-2 je sérový marker onemocnění. V tomto článku se zabýváme rolí nukleárních strukturálních proteinů jako potencionálních markerů umožňujících detekci karcinomu prostaty.

Klíčová slova:
nukleární strukturální prvky, nukleární matrix, karcinom prostaty, biomarkery, EPCA, EPCA-2

ÚVOD

Metody užívané pro detekci karcinomu prostaty zahrnují v současnosti měření hladiny prostatického specifického antigenu (PSA) v séru a digitální rektální vyšetření (DRE). Navzdory rozšířenému měření hladiny PSA a silnějšímu povědomí o karcinomu prostaty zůstává mortalita na toto onemocnění vysoká (druhá nejvyšší po karcinomu plic). Přesto však pomalu dochází k jejímu snížení [1]. Měření hladiny PSA je však spojeno s řadou nedostatků, a tento antigen tedy nelze považovat za ideální tumor marker. PSA je normální prostatický protein, jehož typická exprese není u karcinomu vysoká, je však při onemocnění neodpovídajícím způsobem uvolňován do krve. Ke zvýšení hladiny PSA ovšem dochází i u mužů s benigním onemocněním prostaty, například benigní prostatickou hyperplaziií (BPH) a prostatitidou. Abnormální hladina PSA může být navíc detekována u mnoha jedinců, kteří nemají „klinicky signifikantní“ karcinom, a nevyžadují tedy agresivní terapii. Naopak u řady mužů s karcinomem prostaty ke zvýšení hladiny PSA vůbec nedojde. Omezení spojená s měřením hladiny PSA ukazují na nutnost odhalení nových tumor markerů, které budou klinicky relevantní a umožní objevení účinnějších možností léčby.

Patolog obvykle stanoví diagnózu karcinomu na základě alterací v buněčné a/nebo tkáňové architektuře [2]. Jedním z charakteristických buněčných znaků změny fenotypu je abnormální tvar jádra a přítomnost abnormálních jadérek. Neoplastická buněčná transformace způsobuje změnu struktury buněčného jádra a jeho morfologie. Mezi tyto změny patří zvětšení jádra, deformace jeho velikosti, přítomnost více prominentních jadérek a větších shluků heterochromatinu a alterace týkající se složení proteinů nukleární matrix (NMPs). Pokrok v proteomice, k němuž došlo v průběhu posledních 10 let, podnítil výzkum nových biomarkerů, které budou mít vyšší specifitu.

Pomocí proteomického přístupu jsme vykreslili profil nukleárních strukturálních prvků buněk karcinomu prostaty, a díky tomu se nám povedlo identifikovat nové biomarkery související s tímto onemocněním. Rozdíly ve složení proteinů ve struktuře jádra (NMPs) byly prokázány v normální prostatě a prostatě zasažené karcinomem u krys [3], na transgenetickém modelu myši [4], u benigní prostatické hyperplaziie (BPH) a karcinomu prostaty [5-7]. Na základě tohoto proteomického přístupu jsme identifikovali 2 vzájemně nesouvisející biomarkery: Early Prostate Cancer Antigen (EPCA) a Early Prostate Cancer Antigen 2 (EPCA-2). V této kapitole se zaměříme na charakteristiku nukleárních strukturálních prvků (nukleární matrix) a roli EPCA a EPCA-2 jako biomarkerů karcinomu prostaty.

NUKLEÁRNÍ STRUKTURÁLNÍ PRVKY (NUKLEÁRNÍ MATRIX)

Buněčný/tkáňový pojivový systém nebo síť v tkáni/buňkách je definována jako integrovaná trojrozměrná skeletální síť, která podmiňuje buněčnou strukturu a její funkci z periferní sítě až do DNA [8]. Tyto systémy jsou interaktivní a dynamické a jsou tvořeny vzájemnými spojeními a vazbami jednotlivých nukleárních matrix, cytoskeletu a periferie buňky, včetně extracelulární matrix. Tyto interaktivní systémy třídí a zpracovávají prostorové a časové informace, čímž koordinují buněčnou funkci a expresi genů [8]. Jedním z charakteristických rysů změny fenotypu jsou alterace nukleární struktury a stavby. Skladba nukleární struktury/stavby, která představuje dynamickou podporu jádra, se u normální a karcinomatózní buňky liší. Rozdíly mezi těmito nukleárními strukturálními prvky u normálních a karcinomatózních buněk mohou ovlivňovat rozdílnou expresi genů během transformace. Vzhledem k tomu, že struktura/stavba jádra hraje významnou roli v organizaci DNA, mohou vést alterace v struktuře/stavbě jádra ke změnám v DNA topologii. To může následně vést ke změnám ve vzájemném působení různých genů a jaderné struktury/architektury, které se mohou podílet při procesech, jako jsou například replikace a transkripce DNA a kombinování RNA.

Bylo zjištěno, že gen retinoblastom (Rb) souvisí s p84 – proteinem nukleární matrix [9]. Dále bylo prokázáno, že velký T-antigen viru SV40 napadá strukturu/stavbu jádra buněk, které jsou infikovány nebo transformovány SV40 [10].

Existuje několik odůvodnění pro užívání jaderných strukturálních proteinů jako markerů karcinomu prostaty. Za prvé se snažíme soustředit na proteiny, které mají podle našeho mínění zásadní význam při procesu vzniku karcinomu – proteiny nukleární matrix, které jsou zodpovědné za některé významné změny probíhající v karcinomatózní buňce. Za druhé se jedná o proteiny, které se vyskytují v jaderné matrix pouze v malém množství a představují méně než 1 % celkového obsahu proteinů v buňce a přibližně 10 % proteinů v jádře. Vzhledem k jejich malému množství jsou tyto proteiny obtížně identifikovatelné pomocí běžně užívaných přístupů. Díky nerozpustnému charakteru mnoha proteinů je obtížné je pomocí běžných metod oddělit. Díky koncentraci na nukleární matrix jsme byli schopni eliminovat některé hojně se vyskytující proteiny, které jsou často přítomny v komplexních směsích, například v krvi a tkáních. Přestože přesný mechanizmus detekce nukleárních strukturálních proteinů není ještě zcela objasněn, domníváme se, že jsou uvolňovány do krve buněčným štěpením nebo apoptózou a po uvolnění jsou poměrně stabilní [11].

Rozdíly jednotlivých proteinů v nukleárních strukturálních prvcích byly prokázány u normální a karcinomatózní prostaty u krys [3,7], u BPH a karcinomu prostaty u lidí [5,7,12]. Pomocí karcinomatózních buněk získaných z adenokarcinomu Dunningových krys naše laboratoř identifikovala řadu proteinů v Dunningově podlinii: G, H, AT2, AT6, a MLL [3]. Pomocí proteomického přístupu s užitím dvojrozměrné gelové elektroforézy o vysokém rozlišení bylo zjištěno, že 2 proteiny (G-1 a G-2) jsou specifické pro na androgenech senzitivní a nemetastazující G a H nádorové podlinie [3]. V metastazujících na androgenech nesenzitivních liniích AT2, AT6 a MLL byly detekovány další 2 nukleární strukturální proteiny AM-1 a AM-2 [3]. Další 3 proteiny (D1-D3) byly specifické pro všechny Dunningovy tumory a nebyly identifikovány v normální prostatě [3].

EARLY PROSTATE CANCER ANTIGEN (EPCA)

EPCA je protein v nukleární matrix, jehož exprese byla prokázána ve tkáni karcinomu prostaty. Imunohistochemická analýza prokázala, že k expresi EPCA dochází v prostatě a že tento protein představuje „field effect“ spojený s karcinomem prostaty [13,14]. Při imunohistochemické analýze vzorků z negativních biopsií, následných biopsií a vzorků získaných při prostatektomii byla zaznamenána 84% senzitivita a 85% specifita EPCA [13].

Exprese EPCA u mužů s „negativní biopsií“ může pomoci určit, zda je karcinom lokalizován uvnitř prostaty. Tento test může navíc sloužit jako doplněk k současně užívanému diagnostickému přístupu u pacientů podstupujících biopsii a může umožnit detekci karcinomu prostaty o 5 nebo dokonce více let dříve, než běžný diagnostický přístup. Imunohistochemická analýza EPCA byla následně potvrzena další skupinou [14]. V jejich studii byl prokázán pozitivní výsledek barvení na EPCA u 94 % pacientů s karcinomem prostaty a negativní výsledek u vzorků prostaty mužů s karcinomem močového měchýře. Nebyla prokázána žádná souvislost mezi intenzitou barvení na EPCA a Gleasonovým skóre nebo stadiem onemocnění [14]. V 86 % případech bylo barvení na EPCA pozitivní v nekarcinomatózní tkáni sousedící s hlavními ohnisky karcinomu [14]. Tyto studie prokazují, že EPCA může zrcadlit alterace ve struktuře jádra, k nimž dochází v časném stadiu karcinomu prostaty.

Hladina EPCA v plazmě byla testována u 46 jedinců, zahrnujících muže s karcinomem prostaty, normální zdravé muže, muže s prostatitidou, pacienty s poraněním míchy a pacienty s dalšími druhy karcinomu [15]. Při stanovení hranice absorpce 1,7 při 450 mm, byla hladina EPCA vyšší než 1,7 prokázána pouze u mužů s karcinomem prostaty [15]. Závěrem lze říci, že EPCA představuje plazmatický marker indikující přítomnost karcinomu prostaty s 92% senzitivitou a 94% specifitou [15]. Přestože je nutné provedení větších studií, které by potvrdily dosavadní výsledky, ELISA prokázala potencionální význam tohoto vysoce specifického markeru při detekci karcinomu prostaty. Tento marker není tak spolehlivý sérový marker jako EPCA-2.

EARLY PROSTATE CANCER ANTIGEN-2 (EPCA-2)

Přestože s výjimkou svého názvu a techniky užité při jeho identifikaci nemá tento antigen žádnou souvislost s EPCA, řadí se mezi markery, u nichž je v současné době testována jejich souvislost s karcinomem prostaty. Na rozdíl od EPCA není EPCA-2 spojen s „field effect“ a je přítomen pouze ve tkáni karcinomu prostaty. V současnosti testujeme význam EPCA-2 jako vysoce specifického a senzitivního sérového markeru umožňujícího detekci karcinomu prostaty. Pomocí protilátek proti EPCA-2 naše laboratoř vyvinula test ELISA, který umožňuje detekci tohoto biomarkeru v krvi a prokazuje jeho schopnost rozlišit pacienty s karcinomem prostaty a pacienty, kteří jsou považovány za „normální“ podle několika různých kategorií [16]. Ve studii zahrnující více než 300 mužů byly protilátky proti EPCA-2 užity pro hodnocení jeho hladiny v séru u různých skupin mužů, zahrnujících normální muže, muže s BPH nebo karcinomem prostaty a muže s ostatními benigními onemocněními a karcinomy. Studie zahrnovala i skupinu mužů s normální hladinou PSA, u nichž nebyl důvod k dalšímu sledování. Další skupina zahrnovala muže se zvýšenou hladinou PSA ale opakovaně negativním výsledkem biopsie, kteří prokazovali absenci karcinomu v prostatě. Do studie jsme zahrnuli i skupinu mužů s BPH, kteří nepodstoupili biopsii prostaty a muže s prostatitidou. Abychom mohli zjistit, zda se EPCA-2 vyskytuje častěji u karcinomu prostaty než dalších typů onemocnění, pokoušeli jsme se vyšetřit velké množství pacientů s dalšími onemocněními. EPCA-2 je při hraniční hodnotě 30 ng/ml specifický pro karcinom prostaty. V naší studii jsme zaznamenali 97% specifitu [16]. Při takto vysoké míře specifity umožnil EPCA-2 detekci 94 % karcinomů prostaty [16].

Zjistili jsme při zodpovídání jedné z výše uvedených otázek, že hladina EPCA-2 v séru je u karcinomu prostaty lokalizovaného v době operace na prostatickou žlázu a karcinomu zasahujícího mimo prostatu rozdílná. Na základě ROC analýzy (Receiver Operator Characteristics) indikuje oblast pod křivkou 0,89 schopnost EPCA-2 přesně rozlišit karcinom prostaty ohraničený na orgán od karcinomu zasahujícího mimo prostatu [16]. Závěrem lze říci, že naše dosavadní zjištění prokazují, že nukleární protein EPCA-2 mající spojitost s karcinomem prostaty, lze užívat jako potencionální sérový biomarker pro detekci karcinomu prostaty. V nedávné době jsme zjistili, že EPCA-2 umožňuje detekci karcinomu prostaty dokonce u mužů s „normální“ hladinou PSA [17]. U mužů s prostatitidou navíc nedochází k falešně pozitivním výsledkům [17]. Dále se nám podařilo snížit základ vyšetřovací eseje tak, že se hodnoty EPCA-2 u pacientů bez karcinomu prostaty blíží nule.

Nezbytné je další ověření těchto nálezů ve větších, multicentrických studiích, ale je pravděpodobné, že EPCA-2 splňuje roli tolik potřebného specifického markeru pro detekci karcinomu prostaty.

ZÁVĚREČNÉ POZNÁMKY

PSA se užívá při detekci karcinomu prostaty již od 80. let 20. století. Měření hladiny PSA v séru spolu s digitálním rektálním vyšetřením (DRE) zůstává nejběžnější metodou diagnostiky karcinomu prostaty. Od roku 1990 se za hraniční hodnotu PSA považuje hladina 4,0 ng/ml [18]. Užívání této hranice je poněkud rozporuplné. Řada významných zdravotnických center tuto hranici snížila na 2,5 ng/ml. Měření hladiny PSA dokonce změnilo povahu karcinomu – v dnešní době je v době diagnózy detekováno metastazující onemocnění pouze u malého počtu pacientů. Tento „posun stadia“ lze považovat za obrovský přínos testování hladiny PSA. Jeho hlavní nedostatek však spočívá v tom, že PSA není specifický pro karcinom prostaty, což vede k provádění velkého počtu zbytečných biopsií a nejistotě při selekci pacientů vyžadujících léčbu.

Užití proteomického přístupu při hledání specifičtějších biomarkerů umožňujících detekci karcinomu prostaty nám umožnilo zaměřit se na molekulární  stránku patologických nálezů. Pomocí této metody jsme identifikovali proteiny EPCA i EPCA-2. Prokázali jsme, že EPCA umožňuje velmi specifické rozlišení pacientů s karcinomem prostaty od pacientů bez tohoto onemocnění. EPCA-2 představuje marker obsažený v krvi, umožňující detekci karcinomu prostaty s vysokou senzitivitou a specifitou. EPCA-2 představuje důkaz, že tyto markery jsou specifické pro karcinom prostaty a mohou odlišit onemocnění ohraničené na orgán od onemocnění zasahujícího mimo prostatu. Doposud prováděné studie zkoumaly chování EPCA-2 u vhodných populací pacientů. Hodnota specifity a senzitivity však vždy neodráží screeningovou populaci, což jasně prokazuje nezbytnost provedení multicentrických studií. V případě, že výsledky dalších studií potvrdí naše původní zjištění, budou mít EPCA a EPCA-2 významný přínos při identifikaci karcinomu prostaty u stárnoucích mužů i při detekci a stanovení agresivity onemocnění.

Tato práce vznikla za podpory výzkumného grantu Oncome Inc a Patana Fund Prostate Cancer Foundation.

Eddy S. Leman, Ph.D.

Department of Urology and James

Buchanan Brady Urological Institute

The Johns Hopkins

University School of Medicine

Robert H. Getzenberg, Ph.D.

Brady Urological Institute

Professor of Urology, Oncology

and Pharmacology and Molecular Sciences

Johns Hopkins Hospital