Meiotické vřeténko jako marker optimálního času pro vitrifikaci oocytů –  případ úspěšné léčby neplodnosti a přehled literatury

Souhrn

Cíl: V rámci procesu in vitro fertilizace (IVF) zhodnotit možnost použití stavu meiotického vřeténka jako indikátoru zralosti oocytů za účelem optimalizace načasování vitrifikace. Pacienti a metody: V rámci léčby neplodnosti 38leté ženy a 43letého muže metodou IVF-ICSI (intracytoplazmatická injekce spermie) byla zobrazena dělicí vřeténka jako markery zralosti oocytů před jejich vitrifikací z důvodu azoospermie u partnera. Oocyty, u nichž byl úhel mezi polárním tělískem a meiotickým vřeténkem ≤ 30°, případně měly špatně viditelné meiotické vřeténko, byly vitrifikovány 4 hod po vyhodnocení meiotického vřeténka (8 hod po odběru oocytů). Standardně jsou oocyty vitrifikovány 6 hod po odběru oocytů. Výsledky: Delší doba inkubace oocytů pacientky umožnila, aby oocyty před vitrifikací plně dozrály (do fáze MII) a po rozmrazení byly připraveny pro oplodnění. U partnera pacientky byly následně získány vitální spermie po léčbě tamoxifenem, oocyty byly rozmrazeny a oplodněny získanými spermiemi, s následným embryotransferem a porodem zdravého dítěte v termínu. Závěr: Meiotické vřeténko je možné použít jako marker plné zralosti u oocytů před jejich vitrifikací u starších žen. Po rozmrazení byly oocyty zralé a připravené pro oplodnění metodou ICSI.

Klíčová slova:

gravidita – oocyt – IVF – meiotické vřeténko – polární tělísko

Úvod

Oocyty mají zásadní vliv na kvalitu embrya, a tedy i na výsledky oplodnění metodou in vitro fertilizace (IVF). Nezralost oocytů je jedním z možných důvodů špatných výsledků oplození vitrifikovaných a rozmražených oocytů metodu ICSI (intracytoplazmatická injekce spermie) u starších žen > 35 let [1–3]. Kvalitu a zralost oocytu ovlivňuje nejen jaderný a mitochondriální genom, ale také mikroprostředí ve vaječníku a preovulační folikul, které ovlivňují transkripci a translaci, a v důsledku toho i zralost oocytu.

Po odstranění cumulus oophorus vč. buněk corona radiata je hodnocení kvality a zralosti oocytů přesnější. Vychází ze stavu jaderné zralosti, morfologie cytoplazmy a vzhledu extracytoplazmatických struktur. Standardní optickou mikroskopií snadno zjistitelné první polární tělísko je obecně považováno za marker zralosti oocytů [1–5]. Samotná přítomnost polárního tělíska nemusí být však pro identifikaci zralosti oocytu dostatečná, a to vzhledem ke skutečnosti, že některé oocyty s viditelným polárním tělískem mohou být ve stadiích telofáze I, příp. profáze II (interfáze mezi prvním a druhým meiotickým dělením). Konečná metafáze II (MII) oocytu je charakterizována definovaným srovnáním chromozomů do ekvatoriální roviny meiotického vřeténka. Meiotické vřeténko jako mikrotubulární struktura podílející se na segregaci chromozomů je tedy rozhodující pro správné dokončení meiózy a pro následnou úspěšnou fertilizaci. Pokud se nám v rámci procesu IVF podaří zobrazit kromě polárního tělíska i meiotické vřeténko, získáme velmi komplexní informaci o stavu zralosti oocytů [5–12].

Paralelně uspořádané mikrotubuly meiotického vřeténka jsou dvojlomné, což umožňuje snadno zobrazit meiotické vřeténko optickým polarizačním mikroskopem. Látky dvojlomné totiž polarizované světlo v mikroskopu rozdělí na dva paprsky – řádný a mimořádný. Ty jsou oproti sobě fázově posunuté. Po průchodu analyzátorem dochází k interferenci (skládání) těchto dvou paprsků do stejné roviny kmitu a obraz objektu se nám pak jeví jako světlý na tmavém pozadí (resp. při použití bílého, tedy složeného světla – barevný na tmavém pozadí).

Kazuistika popisuje úspěšnou léčbu neplodnosti 38leté ženy a 43letého muže metodou oplodnění IVF, při níž jsme zobrazením dělících vřetének upřesnili stupeň zralosti oocytů a upravili dobu inkubace oocytů před jejích zamražením (indikací k zamražení byla azoospermie partnera po odběru oocytů). Oocyty, u nichž byl úhel mezi polárním tělískem a meiotickým vřeténkem ≤ 30°, případně měly špatně viditelné meiotické vřeténko, byly inkubovány a následně vitrifikovány až 8 hod po odběru oocytů. Oocyty s dobře viditelným meiotickým vřeténkem, u nichž byl úhel mezi polárním tělískem a meiotickým vřeténkem ≤ 30° jsou běžně inkubovány (následně vitrifikovány) 6 hod po odběru oocytu. Meiotická vřeténka byla vizualizována optickým mikroskopem s polarizačním filtrem [6,7].

Kazuistika

V Centru asistované reprodukce Kliniky gynekologie, porodnictví a neonatologie 1. LF UK a VFN v Praze byla v roce 2019 vyšetřena 38letá žena kavkazského původu (G0/P0, index tělesné hmotnosti: 22,5 kg/m²) a její manžel pro 2 roky trvající primární neplodnost páru. V osobní anamnéze neměla žádné závažné onemocnění, nebyla operována a neužívala žádné léky – menarché ve 12 letech, antikoncepci užívala 15 let, po vysazení pravidelný 26denní menstruační cyklus. Při ultrazvukovém vyšetření byla zjištěna nízká ovariální rezerva, což jsme potvrdili laboratorním vyšetřením (FSH 2. den 8,11 IU/l, AMH 0,6 ng/ml). Partner pacientky byl 43letý muž kavkazské národnosti, který v anamnéze neměl žádnou nadměrnou konzumaci alkoholu, nebyl vystaven působení toxických látek a nebyl trvale léčen. Neměl žádné genitální onemocnění, varikokélu ani poranění varlat. Při prvním spermiogramu byla zjištěna těžká nekrozoospermie, v nativním spermatu nebyly žádné živé spermie, ale při kontrolním spermiogramu o 2 měsíce později byly nalezeny živé spermie, malý počet oddělených spermií (OTA – oligoathenoteratozoospermie). Dostupnými vyšetřovacími metodami nebyla zjištěna žádná dostupná imunologická a genetická příčina pacientovy neplodnosti. Pár se rozhodl podstoupit cyklus IVF/ICSI jako léčbu první volby.

Dne 24. ledna 2021 proběhl první cyklus IVF léčené pacientky (byl použit krátký protokol rFSH 300 IU + antagonista). Nakonec byly odebrány dva oocyty. Pro oplodnění nebyly k dispozici žádné vitální spermie a partneři odmítli použití dárcovských spermií. Vzhledem k tomu, že pacientce bylo 38 let a nebyly získány vhodné spermie k oplození oocytů, bylo pro optimalizaci načasování vitrifikace oocytů a zpřesnění jejich zralosti použito zobrazení meiotického vřeténka v polarizovaném světle (mikroskop s polarizačním filtrem Nikon CEE GmbH). V jednom případě bylo vřeténko sotva viditelné, v druhém jsme meiotické vřeténko neviděli. Šest hodin po vyhodnocení meiotického vřeténka (8 hod po odběru) byly oba oocyty kryokonzervovány vitrifikací (oocyty, které mají úhel a mezi polárním tělískem a meiotickým vřeténkem ≤ 30° nebo mají špatně viditelné meiotické vřeténko, jsou vitrifikovány 4 hod po vyhodnocení meiotického vřeténka – 8 hod po odběru oocytů). Standardně se oocyty vitrifikují 6 hod po odběru. V našem případě delší doba inkubace umožnila, aby oocyty před vitrifikací plně dozrály (fáze MII) a po rozmrazení byly plně připraveny pro oplodnění metodou ICSI [8].

V dalším cyklu (stejný stimulační protokol) byly opět odebrány dva zralé oocyty (po kontrole stavu dělicích vřetének) vitrifikovány a opět nebyly k dispozici žádné spermie. Fotografie oocytů s vřeténky v proximální poloze vůči polárnímu tělísku z mikroskopu Nikon Eclipse Ti2 Series jsou prezentovány na obr. 1.

Partner pacientky byl následně léčen tamoxifenem tbl. 1-0-0 s následným zlepšením spermiogramu. V den plánovaného rozmrazení oocytů partner odevzdal čerstvý vzorek spermatu v 9: 10 hod, kde byly přítomny vitální spermie, následně jsme rozmrazili čtyři oocyty (zralost oocytů opět upřesněna zobrazením meiotického vřeténka v polarizovaném světle). Téhož dne v 11: 30 hod byly oocyty oplodněny metodou ICSI. Vývoj dvou embryí se zastavil 3. den, následoval transfer embryí 8/1 gr. 1, s graviditou a porodem zdravého dítěte v termínu.

Diskuze

V prezentované kazuistice byla v rámci léčby neplodnosti 38leté ženy a 43letého muže metodou IVF použita dělicí vřeténka jako markery zralosti oocytů před jejich vitrifikací. Pacientka měla nízkou ovariální rezervu, takže jsme předpokládali, že nižší kvalita oocytů snižuje pravděpodobnost jejich úspěšného oplodnění po vitrifikaci a rozmrazení. Pro zvýšení pravděpodobnosti klinické gravidity pacientky byla polarizačním světelným mikroskopem vizualizována opticky dvojlomná meiotická vřeténka a jejich stav a relativní poloha vůči polárním tělískům byly použity jako indikátory zralosti oocytů před jejich vitrifikací [9–17].

Nedávné studie využívající polarizovanou světelnou mikroskopii ukázaly, že oocyty, na nichž je patrné první polární tělísko, mohou být stále nezralé (v raném stadiu telofáze I [11,16,17]), přestože je polární tělísko přítomno v perivitelinním prostoru. Předpokládá se, že přítomnost a poloha meiotického vřeténka souvisí s vývojovou kompetencí oocytu [3,11]. Studie Rienzi et al. [3,11,16,17] ukázala, že není důležitá pouze přítomnost dvojlomného meiotického vřeténka, ale pro úspěšné oplození hraje roli také poloha meiotického vřeténka vzhledem k umístění prvního polárního tělíska v době ICSI.

Vzhledem k tomu, že oocyty naší pacientky s polárním tělískem a meiotickým vřeténkem v těsné blízkosti mohly být nedostatečně zralé, upravili jsme načasování vitrifikace jak podle relativní polohy polárního tělíska a meiotického vřeténka, tak podle stavu meiotického vřeténka. Pozdější vytvoření meiotického vřeténka lze vysvětlit tím, že při nepřítomnosti centrozomu je nukleace mikrotubulů pomalá a může trvat několik hodin, než se po vzniku polárního tělíska vytvoří bipolární MII vřeténko [5].

Oocyty, které měly úhel mezi polárním tělískem a meiotickým vřeténkem a ≤ 30°, byly vitrifikovány 4 hod po vyhodnocení meiotického vřeténka (8 hod po odběru oocytů). Při standardních postupech se oocyty vitrifikují 6 hod po odběru.

Závěr

Meiotické vřeténko je možné použít jako marker plné zralosti u oocytů před vitrifikací u starších žen. Modifikace doby inkubace oocytů dle stavu meiotického vřeténka umožnila, aby oocyty před vitrifikací plně dozrály (fáze MII) a po rozmrazení byly plně připravené pro oplodnění metodou ICSI.