Variabilita buněčné populace solidních nádorů a její význam pro diagnostiku a terapii nádorových onemocnění

Souhrn

Východiska:

Nádorové onemocnění se vyvíjí na základě vzniklé somatické mutace evolučním procesem podle Darwinovských pravidel. Vývoj nádoru je proces dynamické klonální expanze a následné selekce vedoucí ke vzniku geneticky odlišných subpopulací přizpůsobených odlišným podmínkám nádorového mikroprostředí konkrétního hostitele. Genom jednotlivých nádorových buněk je utvářen různými selekčními tlaky. Evoluční dráha vývoje nádoru má ve většině případů rozvětvený charakter a jednotlivé nádorové subklony se tak vyvíjejí paralelně. Diverzita klonů v rámci jediné nádorové tkáně vede ke vzniku genetické, epigenetické a fenotypové variability, což současně představuje hlavní překážku exaktní diagnostiky a účinné personalizované léčby konkrétního nádorového onemocnění u konkrétního jedince. Pokroky v sekvenačních technikách nám v současnosti umožňují odpovědět na otázky ohledně růstu a progrese heterogenních nádorů a také jejich schopnosti odpovídat na léčbu. Porozumění mechanizmu vzniku a sledování změn na úrovni nádorových klonů v průběhu progrese nádorového onemocnění může pomoci zlepšit účinnost protinádorové léčby.

Cíl:

Tento přehledový článek se zabývá nádorovou heterogenitou a ukazuje, jak klonální diverzita ovlivňuje nádorovou heterogenitu na úrovni genetické, epigenetické i proteinové. Dále popisuje, jak fylogenetika, efektivní nástroj systémové biologie, může pomoci při sledování klonální evoluce nádoru v průběhu jeho progrese a tvorbě metastáz. Na závěr také hodnotí, jakým způsobem přispívá nádorová heterogenita k problémům v diagnostice nádorových onemocnění a jejich léčbě.

Klíčová slova:

evoluce nádorů – nádorová heterogenita – nádorová fylogenetika – klonální evoluce

Úvod

Nádorové onemocnění je tradičně vnímáno jako genetické onemocnění s charakteristickou progresivní kumulací změn v klíčových genech a signálních dráhách kontrolujících proliferaci buněk. Předpokládá se, že nádor vzniká v důsledku neletální změny genomu, přičemž ve většině případů jde o změny spontánní a méně často jsou tyto změny podmíněny zárodečnou mutací. V 70. letech minulého století byla vyslovena teorie evolučního principu nádorové progrese, která popisuje nádorové onemocnění jako evoluční proces řízený postupnou kumulací somatických mutací a následnou selekcí subklonů [1,2]. Znamená to tedy, že od prvotní události, během které dochází k transformaci zdravé buňky v buňku nádorovou, se až ke stadiu diseminovaného onemocnění nádor vyvíjí procesem selekce. Evoluční teorie progrese nádorů je však lehce odlišná od evoluční teorie druhů [3]. Nádorové buňky jsou vystaveny selekčnímu tlaku mikroprostředí, jako je působení imunitního systému, změna pH, nedostatek živin, anatomické bariéry a působení protinádorové terapie. Tyto tlaky průběžně formují evoluční dráhu nádoru a vznikajících subpopulací [4]. Vzhledem k tomu, že evoluci nádoru lze jen velmi těžko studovat u pacienta – člověka, neboť z etických důvodů není možné průběžně odebírat biopsie progredujícího nádoru, většina studií zabývajících se evoluční historií nádorů je retrospektivních, a tak vychází ze „single time-point“ vzorků. Uvedený přístup je však doposud považován za dostačující, neboť vnitřní nádorová heterogenita (intratumoral heterogeneity – ITH) představuje permanentní záznam mutací vzniklých v průběhu progrese nádoru [5]. Model nádorové evoluce využívá pro studium nádorové progrese fylogenetiku – typ analýzy, která zaznamenává změny v genomu nádoru v podobě evolučního  stromu.

V populaci pacientů s nádorovým onemocněním je třeba rozlišovat ITH (intratumoral) a mezinádorovou heterogenitu (intertumoral). Mezinádorová heterogenita označuje různorodost nádorů stejného histologického typu mezi různými pacienty a předpokládá se, že vychází z lokalizace tumoru v rámci orgánu a z původu buněk. Je také ovlivněna specifickými vlastnostmi hostitele, jako je věk, hormonální status, zárodečné genetické variace, komorbidity a souběžné medikace a environmentální faktory [6]. ITH charakterizuje různorodost nádorových buněk v nádorové tkáni jediného pacienta. Zahrnuje prostorovou heterogenitu, která vychází z nerovnoměrné distribuce geneticky odlišných buněčných populací v nádoru a současně i změny v čase, neboť změny v genomu nádorových buněk probíhají dynamicky [7].

Vnitřní heterogenita nádorů

Nádor jako makroskopicky heterogenní systém popsali již v 19. století Johannes Muller a Rudolf Virchow, kteří pozorovali výrazný pleomorfizmus buněk nádorové tkáně [8,9]. V 70. letech 20. století Heppner a další autoři popsali v rámci jedné nádorové tkáně přítomnost odlišných subpopulací, které se od sebe lišily odpovědí na léčbu a schopností metastazovat [10]. Odlišné histologické obrazy je možné v nádorové tkáni pozorovat poměrně často a odpovídají odlišnému stupni diferenciace a metaplastickým změnám. Morfologická heterogenita je významnou součástí prognostického skórovacího systému, např. u karcinomu prostaty [11].

Nádorová heterogenita je častý jev objevující se u množství nádorových diagnóz [12,13], avšak otázkou stále zůstává, jakým mechanizmem vzniká. ITH je formována množstvím vnějších sil působících na nádorový genom a ovlivňujících strukturu nádorové tkáně. Nádorové mikroprostředí tak vytváří tlak, na základě kterého přežívají buňky nejlépe adaptované na podmínky okolí [7].

V poslední době, kdy k významnému posunu v chápání evoluce nádorů přispěl velký pokrok ve využívání sekvenování druhé generace (next generation sequencing – NGS), se upouští od tradičního paradigmatu progrese nádoru jako jednoho klonu s postupně narůstající agresivitou. Nádorová populace je chápána jako komplexní systém tvořený obvykle mnoha jednotlivými geneticky příbuznými subklony, které se vyvíjejí paralelně [14,15] (srovnání s modelem lineární evoluce v kapitole Klonální evoluce nádorů).

Heterogenita nádorové populace se může rozvíjet v důsledku změn v genomu v rámci klonu nádorové populace, pod tlakem změn v nádorovém mikro-prostředí, nebo na pozadí kombinace uvedených faktorů [16]. Mutace vzniklé v nádorových buňkách lze rozdělit do dvou typů – 1. funkčně důležité „driver“ mutace a 2. neutrální „passenger“ mutace, které je pouze doprovázejí a nemají zásadní vliv na agresivitu nádoru. „Driver“ mutace, také označované jako kmenové mutace, představují změny vyskytující se v raných fázích nádorové transformace a je možné je identifikovat ve všech oblastech nádorové tkáně, zatímco „passenger“ mutace jsou aberace lokalizované pouze do určitých menších regionů nádorové populace [17]. Odlišnosti v nádorovém genomu mohou dát vzniknout nádorům s podobným fenotypem, které se však geneticky nepřekrývají. To je dáno především skutečností, že odchylky v buněčném metabolizmu a signalizaci mohou být v buňce navozeny prostřednictvím různých mechanizmů. Na druhou stranu i fenotyp geneticky identických buněk může být odlišný, neboť přestože jsou nádory architektonicky komplexní, liší se v míře regionální vaskulatury, infiltrace hostitelskými (nenádorovými) buňkami zánětlivými nebo buňkami imunitního systému, složkami pojivové tkáně a dalšími vlastnostmi. Tyto specifické regionální vlastnosti vedou ke vzniku rozdílných mikroprostředí a tím k rozvoji fenotypové heterogenity [18]. ITH se tedy projevuje nejednotností na mnoha úrovních, vč. genetické, epigenetické a fenotypové.

Genetická heterogenita

Genetická heterogenita označuje strukturní a kvantitativní chromozomální změny. Somatické buňky kumulují v průběhu života mutace, které jim dávají selektivní výhodu, jsou to již zmíněné „driver“ mutace, které zvyšují přežití a proliferaci buněk, dále pak mutace neutrální a nakonec mutace, které jsou pro buňky nevýhodné a vedou k jejich smrti nebo senescenci. Ačkoliv má většina mutací jen malý vliv na celkový stav buňky, i několik málo „driver“ mutací může udělit buňce evoluční výhodu, která jí umožní prosperovat více než ostatním [19]. Rozsáhlé analýzy dat exomového sekvenování ukázaly, že každý nádor dospělého věku nese přibližně 20–300 jednonukleotidových změn (single nukleotide variant – SNV) nebo krátkých inzercí či delecí [20–26]. Kromě toho nádory nesou i změny v počtu kopií genu (copy number variants – CNV) a translokací [27,28].

Epigenetická heterogenita

O epigenetické heterogenitě mluvíme v případě, že nádorová populace vykazuje variabilitu v profilu metylace DNA, acetylace histonů a změny v konformaci chromatinu. Geny kódující regulátory epigenomu patří k nejčastěji mutovaným genům v nádorech. Jejich výsledkem je snížený obsah 5-metylcytosinu, zvýšená metylace normálně nemetylovaných dinukleotidů cytosin-fosfát-guaninu (cytosin-phosphatidyl-guanin – CpG) v promotorech genů kódujících nádorové supresory, genů odpovědných za reparaci DNA a genů souvisejících s metastazováním [29–34]. I když se obecně předpokládá, že se evoluční historie nádoru odvozená z genetických a epigenetických dat může lišit (metylace DNA je reverzibilní proces a je také mnohem více náchylná k chybám než replikace DNA), studie provedené na nádorech mozku a prostaty ukazují shodné profily aberantní metylace DNA, somatických mutací i změn v počtu kopií genů [35,36].

Fenotypová heterogenita

Fenotypová heterogenita vychází z integrace genetických i negenetických vlivů. Hlavní faktory ovlivňující nádorový fenotyp je možné rozdělit na vnitřní – genetická, epigenetická variabilita a míra diferenciace nádorových buněk, a vnější, u níž je výrazným hráčem nádorové  mikroprostředí (fibroblasty, buňky imunitního systému, novotvořené cévy, extracelulární matrix a hypoxie). Vnější (tj. hostitelské) faktory často formují diverzitu nádorových buněk výrazněji než faktory vnitřní [37]. Například u kolorektálního karcinomu a světlobuněčného karcinomu vaječníku není heterogenita klonů vždy navázaná na genetickou poruchu, ale často je závislá na podmínkách daného mikroprostředí [38–40].

Klonální evoluce nádorů

Nádorový klon je z definice skupina nádorových buněk, které sdílejí vysoce podobný genotyp a mutační profil, zatímco subklon je skupina buněk, které se oddělily v evoluční linii a získaly další mutace [41] (obr. 1). Populace subklonů nádorových buněk tedy dávají vzniknout heterogennímu prostředí uvnitř nádoru, přičemž jednotlivé subklony nejsou izolované entity. Z hlediska geografického se populace subklonů mohou v rámci nádoru prolínat nebo mohou být naopak prostorově odděleny [42]. Interakce mezi subklony v průběhu nádorové evoluce může být na úrovni kompetice, ale i kooperace. Jeden z klonů může vytlačit ostatní na základě přísunu kyslíku, živin a prostoru, kterých se mu dostává ve větší míře než ostatním klonům [43]. Některé studie také ukazují, že jednotlivé subklony jsou schopny vzájemně interagovat na základě parakrinní signalizace [44,45].

Selekční tlak se v průběhu nádorové progrese mění, což přispívá ke změně subklonální architektury a dominance v průběhu vývoje nádoru [42]. Obrovské změny v zastoupení klonů v průběhu času lze pozorovat např. u množství hematologických malignit, jako je chronická lymfocytární, akutní myeloidní nebo akutní lymfoblastická leukemie, u nichž se diagnostické vzorky liší od vzorků získaných v pokročilém stadiu onemocnění [46–49]. Stejně tak u solidních nádorů jsou změny v organizaci nádoru pozorovány na základě srovnání diagnostických vzorků se vzorky rekurencí nebo z porovnání tkáně primárního nádoru s metastázou. Byly popsány čtyři základní mechanizmy evoluce nádorů.

Lineární model evoluce nádorů (linear evolution)

Lineární model nádorové progrese je pravděpodobně nejznámější a podle něj k mutacím dochází postupně krok za krokem v lineárním sledu. „Driver“ mutace v tomto případě poskytují buňkám tak silnou selektivní výhodu, že předčí všechny předchozí klony a v nádorové tkáni pak převládá jako dominantní klon (obr. 2a). Typickým příkladem lineárního modelu nádorové progrese je Fearon-Vogelsteinova teorie nádorové progrese karcinomu tlustého střeva. Ukazuje, jakým způsobem přispívá po sobě následující zisk „driver“ mutací k posunu onemocnění do pokročilejších stadií s vyšší malignitou [50]. Tento model podporují také histopatologická pozorování nádorové progrese vedoucí od adenomu přes vývoj karcinomu až ke vzniku metastáz u některých nádorových diagnóz.

Rozvětvený model evoluce nádorů (branching evolution)

Model větvící se evoluce popisuje klony mající společného předka, přičemž se tyto klony vyvíjí paralelně a dávají vzniknout mnoha klonálním liniím. Nedochází zde k vytlačení submisivních klonů, jako je tomu u lineární evoluce, a všechny klony expandují současně (obr. 2b). Pomocí NGS byl typický mutační profil zahrnující kmenové mutace, mutace specifické pro jednotlivé subklony a další mutace v jednotlivých buňkách identifikován u nádorů prsu, prostaty, jater, ledvin, vaječníku, melanomu a u kolorektálního karcinomu [51–63]. Počet klonů a tvar evolučního stromu se mezi diagnózami liší, nicméně u některých diagnóz lze pozorovat společné rysy (dlouhé větve evolučního stromu u některých typů nádorů prsu) [55,57,64]. Rozvětvená evoluce nádorů byla popsána u mnoha nádorů, vč. progrese adenomu na karcinom u nádorového onemocnění tlustého střeva, karcinomu slinivky břišní a prsu [51,65–67].

Model neutrální evoluce nádorů (neutral evolution)

Hypotéza neutrální evoluce vychází z představy, že nedochází k selektivní výhodě v průběhu vývoje nádoru a jedná se spíše o kumulaci náhodných mutací vedoucí ke genetickému driftu a výrazné heterogenitě (obr. 2c). Ta je pak vedlejším efektem bez funkčního významu pro nádorový růst. Jedná se však o extrémní teorii, která má poměrně málo důkazů v klinické praxi [68].

Model přerušované evoluce nádorů (punctuated evolution)

U některých nádorů se na začátku progrese kumuluje velké množství genetických aberací způsobujících extenzivní heterogenitu nádorové tkáně s velkým počtem subklonů. Postupně pak dochází k jejich redukci díky expanzi jednoho nebo několika dominantních klonů [69,70] (obr. 2d).

Kromě celkem přesně definovaných modelů může nádorová progrese probíhat i hybridním způsobem, kdy je paralelně aplikováno více modelů (může být typické pro určité skupiny mutací), nebo tyto modely mohou následovat v průběhu času (některé převažují v raných stadiích progrese) [71].

Fylogenetika nádorů

První pokusy využít fylogenetický model stromu v onkogenezi se objevily v 90. letech 20. století [72,73]. Tento druh analýzy dal postupně vzniknout novému odvětví označovanému jako nádorová fylogenetika. V současné době využívá nádorová fylogenetika mnohem sofistikovanější analytické přístupy, než tomu bylo na jejím počátku, a tento posun je také dokumentován narůstajícím množstvím publikací využívajících fylogenetické přístupy pro studium nádorových onemocnění za poslední 4 roky.

V současnosti dominuje představa darwinovské evoluce uplatňující se jako hlavní síla formující nádorovou heterogenitu, avšak tato teorie je v určitých směrech limitovaná. Její omezení vychází z rozdílných vlastností populací nádorových buněk a populací organizmů. Nádorové buňky představují populaci s nepohlavním dělením (tzn. neprobíhá zde meiotická rekombinace, neuplatňuje se Hardy-Weinbergův zákon o frekvenci genotypů ani teorie pohlavního výběru), jejíž vývoj je ovlivňován evolučními procesy, které se projevují v normální populaci – mutace, genetický drift a přirozený výběr. Ačkoliv evoluční teorie značně pomáhá v pochopení dějů v průběhu nádorové progrese, rozdíly v evolučním procesu nádorů spočívají především v – 1. četnosti mutací; 2. míře selekce; 3. typicky vysoké heterogenitě vznikajících nádorových klonů a 4. typu vzniklé mutace [74].

Dominantním mechanizmem evoluce druhů podle Darwina je selekce přirozeným výběrem. U nádorových buněk se jedná převážně o pozitivní selekci, která probíhá ve prospěch mutací podporujících všechny znaky nádorové buňky [75], zatímco negativní selekce je v průběhu vývoje nádoru velmi slabá. Toto také vysvětluje extrémní toleranci nádorových buněk k hypermutabilitě. Typickou vlastností nádorů je hypermutabilní fenotyp spojený s typem mutací, které nejsou časté při evoluci druhů. Hypermutabilita zahrnuje chromozomální nestabilitu (chromosomal instability – CIN), mikrosatelitovou nestabilitu (microsatellite instability – MIN), vysokou četnost bodových mutací a také CNV [74]. Kvantitativní hodnocení selekce chybí – není známý počet mutací potřebný k rozvoji nádoru ani zda se liší mezi různými typy nádorového onemocnění [76]. Z hlediska evoluční teorie přirozeným výběrem je však třeba zdůraznit, že selektivní výhoda podle Darwina probíhá pouze na úrovni nádorové populace, a nikoliv na úrovni jedince – hostitele. V poslední době bylo publikováno i několik prací, které místo darwinovské evoluce nádorové heterogenity navrhují model neutrální evoluce (non-Darwinian model). Opět se tedy otevírá diskuze ohledně role selekcionizmu a neutralizmu v procesu evoluce přirozeným výběrem, tentokrát však na úrovni nádorových buněk [59, 77–79].

Původně byly k sestavení fylogenetického stromu nádoru použity variace mikrosatelitových markerů u hereditárního nepolypózního karcinomu kolorekta [72]. V současnosti jsou k analýze fylogenetických dat nádorů využívány počítačové metody, které pomáhají rekonstruovat evoluční procesy nádorů. Vstupní data pro fylogenetickou analýzu představuje genomový profil. Původně byla získaná pomocí komparativní genomové hybridizace (comparative genomic hybridization – CGH) nebo fluorescenční in situ hybridizace (fluorescence in situ hybridization – FISH) [73,77], avšak postupně byly tyto metody vytlačeny NGS. Většina dat je vyhodnocována standardními algoritmy využívanými při fylogenetické analýze druhů, jako je metoda maximální úspornosti (maximal parsimony), metoda minimální evoluce (minimal evolution), metoda nejbližšího souseda (neighbour joining) nebo bayeneiovské metody stanovení fylogenetických vztahů [74].

Přístup k analýze fylogenetických dat nádorů vychází především z typu studie, kterou může být – 1. kohortová studie zahrnující data z mnoha nádorů a popisující nejčastější dráhy progrese pro danou diagnózu (cross-cohort studies) (obr. 3a); 2. studie nádorových regionů pocházejících z odlišných lokalit jediného nádoru (regional bulk phylogenetics) (obr. 3b) nebo 3. analýza individuálních nádorových buněk získaných z jediného nádoru (single-cell tumour phylogenetics) (obr. 3c) [74]. Přehled dostupného softwaru pro analýzu fylogenetických dat členěný na základě typu studie je uveden v publikaci Schwartz et al [74].

Výstupní data pak představují fylogenetický strom, který odhaduje pořadí, ve kterém docházelo ke vzniku mutací v průběhu oddělování klonů v linie. Společné uzly fylogenetického stromu představují společné předky, jejichž genotyp může být vyvozen na základě společných rysů mezi jejich potomstvem [71].

Nádorová fylogenetika ukazuje minulost nádorů a pomáhá analyzovat data heterogenních nádorů. Pomocí tohoto přístupu je možné odhadnout načasování „driver“ mutací a zdůraznit tak klíčové události v iniciaci a progresi nádorového onemocnění. Velké kohortové studie mohou ukázat, které mutace v genech nebo drahách mají za následek vznik nádorového klonu (potenciálně dřívější události) nebo nádorového subklonu (pozdější události) [80].

Vnitřní nádorová heterogenita a metastazování

Metastazování je komplexní proces, při kterém jsou nádorové buňky uvolněny z primárního nádoru. Pokud přežijí transport, jsou lokalizovány na sekundárním místě, kde dochází k jejich adaptaci, proliferaci a vytvoření nádorové léze. Všechny kroky představují proces selekce, který je zdrojem heterogenity mezi primárním nádorem a metastázou [81]. Původní klasický model metastazování je jednoduchým lineárním modelem (viz kapitola Klonální evoluce nádorů), podle něhož primární nádor postupně získává vlastnosti potřebné pro diseminaci onemocnění a kolonizaci nové tkáně. Mnoho studií ukazuje vysokou genetickou podobnost mezi různými metastázami u jednoho pacienta. Tato skutečnost by tedy podporovala teorii, že k diseminaci dochází v pozdních stadiích onemocnění (pozdní diseminace) [81]. Některé novější studie však ukazují, že některé nádory prsu a slinivky břišní jsou schopné diseminovat již v preneoplastickém stadiu (raná diseminace) [82,83]. V tomto případě jsou nádorové buňky distribuovány po těle hostitele v době, kdy samotné onemocnění není ještě diagnostikováno, a po variabilní době dormance se mohou začít vyvíjet nezávisle na primárním nádoru. Takové nádory sdílejí některé původní „driver“ mutace s primárním nádorem, avšak dále rozvíjejí svoji genetickou heterogenitu nezávisle na primárním nádoru a ostatních metastatických lézích a jsou navzájem vysoce heterogenní. Zvláštní případ představuje situace, kdy metastázy pocházejí ze subklonů odvětvených v raných fázích nádorové progrese, ale diseminovaných až v pozdní fázi. V tom případě jsou metastázy vysoce heterogenní vůči sobě samotným, avšak jejich genetická výbava je blízká primárnímu nádoru. Studie zabývající se metastazováním u kolorektálního karcinomu ukázaly, že model metastazování se může u jednotlivých pacientů lišit, tzn. ve skupině pacientů se stejnou diagnózou může docházet k ranému i pozdnímu diseminovanému onemocnění [84].

Kromě již uvedeného byla u melanomu pozorována genomová variabilita mezi lokoregionálními metastázami (pocházely z jediného subklonu primárního nádoru) a vzdálenými metastázami (pocházely z odlišných subklonů primárního nádoru) [85]. Celkově lze tedy říci, že jednotlivé případy metastazování jsou unikátní a je nemožné aplikovat univerzální model na všechny případy. Situace je však ještě komplikovanější, neboť kromě uvedených klasických cest, kdy vzniklé metastázy mají původ monoklonální, existují i mechanizmy vedoucí ke vzniku polyklonálních metastáz [77].

Rozdíl v genomu primárního nádoru a metastázy představuje významný zdroj informací pro design anti-metastatické léčby. Genomová variabilita primárních nádorů kombinovaná s variabilitou vzniklou v důsledku dalších selekčních tlaků v mikroprostředí ve vzdálených orgánech hostitele vytváří obrovskou heterogenitu metastatického onemocnění, která způsobuje komplikace při nastavování vhodné léčby. Na základě mnoha studií je zjevné, že k úspěchu léčby metastatického onemocnění může přispět orgánově specifická léčba [86–89].

Heterogenita v diagnostice, terapii a lékové rezistenci

V současné době rostoucích požadavků na personalizovanou léčbu nádorového onemocnění představuje prostorová orientace a zastoupení nádorových subklonů v čase významnou výzvu pro správnou diagnostiku a léčbu nádorů [90]. Zatímco některé klony mohou být dominantními z hlediska fyzické entity nádoru, menší a často nedetekovatelné subklony mohou mít zásadní vliv na klinický průběh onemocnění, a to obzvlášť u hematologických malignit [91,92].

Vnitřní faktory (genetická nestabilita, mutační rychlost a epigenetický status), stejně tak jako vnější faktory (vliv mikroprostředí a terapie) ovlivňují heterogenitu a odpověď na léčbu. Analýza pacientských vzorků v průběhu času ukázala alterace v nádorovém genomu po aplikaci chemoterapeutik, což ukazuje, že i samotná léčba je odpovědná za výrazné změny v genomu nádorových buněk a může přímo přispívat k progresi onemocnění [20]. Většina terapeutických látek není schopna eliminovat veškeré nádorové buňky. Ty, které léčba nezasáhne, následně často vykazují ještě větší genetickou nestabilitu nebo rozvíjejí mechanizmy odpovědné za rezistenci (samotné zvýšení genetické nestability nedává nádorovým buňkám selektivní výhodu, a naopak může být fatální v případě, že překročí práh životaschopnosti). Z toho důvodu správně odhalená genotypová a fenotypová variace mezi jednotlivými nádorovými buňkami v rámci nádorové tkáně a míra heterogenity může sloužit jako vhodný diagnostický nástroj a prediktivní biomarker [93]. Experimentálně bylo prokázáno, že množství genetických změn v nádorových subpopulacích primárního karcinomu prsu koreluje s klinicko-patologickými rysy [94,95] a vyšší míra heterogenity koreluje s horší prognózou, např. u pacientů s karcinomem hlavy a krku nezávisle na proběhlé infekci lidským papilomavirem [96,97].

Nádorová heterogenita je dynamickou vlastností nádoru, která vychází z adaptace buněk na změny a z neustálé klonální selekce. Mechanizmus lékové rezistence u cílené terapie často zahrnuje vznik sekundárních mutací a aktivaci drah přežití v cílových buňkách nebo pozitivní selekci klonů, které neexprimují cílovou molekulu. Adaptace a nikoliv eliminace buněk vystavených léčivé látce může být způsobena nejen genetickými mechanizmy, ale také mechanizmy epigenetickými [98].

V poslední době se ukazuje testování metodou tzv. „tekuté biopsie“ jako velice slibný přístup monitorování dynamiky nádorového onemocnění. Tento neinvazivní přístup využívá analýzu cirkulujících nádorových buněk (circulating tumor cells – CTCs) nebo cirkulující volné nádorové DNA (circulating tumor DNA – ctDNA) k cílené detekci konkrétních změn v sekvenci DNA nebo identifikaci celého spektra nádorových mutací. Ve vztahu k nádorové heterogenitě představuje ctDNA směsný marker odlišných nádorových klonů a podává přesnější informaci o nádorovém ložisku z hlediska genomové diverzity ve srovnání s jednotlivými nádorovými vzorky. Omezení však spočívá především v nízké senzitivitě u méně objemných nádorových ložisek. Analýza CTCs a ctDNA umožňuje v reálném čase sledovat klinickou progresi a odpověď na léčbu u nádorových diagnóz, jako je karcinom prsu, kolorekta, plic a dalších [99–100].

Závěr

Nádorový genom je formován třemi základními evolučními činiteli, jako je mutace, která dává vznik nové variantě v populaci, selekce a drift, které umožní její expanzi. Analýza genomických dat nám dovoluje sledovat tyto evoluční procesy, neboť historie nádorové evoluce je vepsána do genomu nádorové buňky. Fylogenetické analýzy pomáhají odhalit mechanizmy odpovědné za vznik heterogenity, dynamiku, kterou se vyvíjejí a nové prognostické ukazatele, avšak doposud se ve většině případů jedná o retrospektivní studie. Znalosti získané těmito studiemi umožňující stanovení klonálního statusu nádorové heterogenity, její dynamiky a identifikace rizikových subklonů, které by byly cílem protinádorové léčby, je potřeba aplikovat a testovat v klinické praxi na velkých souborech vzorků.

Fenotypová diverzita přítomná u geneticky heterogenních primárních nádorů nebo příp. diseminovaného onemocnění představuje komplikaci pro komplexní terapeutické procesy. Pro kompenzaci diagnostické variability způsobené heterogenním zastoupením nádorových subklonů v jednotlivých oblastech nádoru (sampling error) je třeba analyzovat větší množství regionálních vzorků nádorové tkáně. Exaktní identifikace složek nádorové tkáně je zásadní z hlediska stanovení vhodného terapeutického přístupu, neboť jednotlivé subklony mohou mít odlišné biologické vlastnosti a ve svém důsledku i odpověď k léčbě.

Práce byla podpořena projektem MŠMT – NPU I – LO1413. 

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Veronika Brychtová, Ph.D.

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7 656 53 Brno

e-mail: vebrychtova@mou.cz

Přijato: 8. 8. 2018