Exprese a funkční charakterizace miR-34c u karcinomu děložního hrdla

Souhrn

Východiska:

Karcinom děložního hrdla je čtvrtým nejčastějším onkologickým onemocněním u žen a v drtivé většině případů je spojen s infekcí lidskými papilomaviry. Virové infekce jsou obvykle doprovázeny morfologickými změnami epiteliálních buněk, avšak pomocí stávajících dostupných vyšetřovacích metod není lehké rozlišit, zda se jedná o projevy produktivní infekce, nebo změny vedoucí ke vzniku maligního onemocnění. Z toho důvodu stále narůstá potřeba nalézt vhodné diagnostické biomarkery karcinomu děložního hrdla, např. ve formě miRNA, tj. malých nekódujících molekul RNA regulujících genovou expresi.

Materiál a metody:

Hladina miR-34c v cervikálních nádorových liniích byla stanovena pomocí kapkové digitální polymerázové řetězové reakce. Zvýšení a inhibice exprese miR-34c in vitro bylo dosaženo pomocí transientní transfekce s využitím specifických oligonukleotidů, a to miRNA mimikujících, nebo miRNA inhibujících. Buněčná proliferace byla analyzována barvením krystalovou violetí s následným spektrofotometrickým měřením. Změny v migračních vlastnostech byly studovány pomocí „scratch“ testu. Exprese vybraných proteinů byla stanovena imunochemicky.

Výsledky:

Inhibice exprese miR-34c byla spojena s mírným zvýšením buněčné proliferace a především s výrazným zvýšením schopnosti buněk migrovat. Analýza exprese miR-34c prováděná na souboru 39 dysplastických tkání a 35 vzorků zdravých kontrol následně ukázala signifikantní rozdíl (p < 0,01) v hladině této miRNA.

Závěr:

Komparativní expresní analýza prokázala signifikantně sníženou expresi miR-34c u prekanceróz děložního hrdla v porovnání s normálním netransformovaným epitelem. Při modulaci exprese miR-34c in vitro byla potvrzena tumor supresorová úloha miR-34c u cervikálních malignit.

Klíčová slova:

karcinom děložního hrdla – HPV – miRNA – HSIL – hsa-miR-34c – prekanceróza

Úvod

Karcinogeneze děložního hrdla je vícestupňový proces, který je započat infekcí lidskými papilomaviry (human papillomavirus – HPV) s následnou epizomální perzistencí viru v hostitelské buňce a jeho začleněním do genomu. Ačkoli bylo popsáno více než 200 různých kmenů lidských HPV [1], se vznikem prekanceróz a následným nádorovým onemocněním jsou spojovány tzv. high-risk kmeny, především HPV16 a HPV18, které jsou původcem přibližně 70 % všech karcinomů děložního hrdla [2]. Samotnému vzniku karcinomu předchází vývoj přes prekancerózu, tzv. high-grade dlaždicobuněčnou intraepiteliální lézi (high-grade squamous intraepithelial lesions – HSIL). Za iniciaci maligní transformace jsou zodpovědné zejména virové onkoproteiny rané fáze E6 a E7, které inhibují tumor supresorové proteiny p53 a pRb (retinoblastomový protein). Protein p53 se aktivně podílí na celé řadě protinádorových funkcí, vč. regulace apoptózy, buněčného cyklu, genomové stability, angiogeneze a dalších procesů spojených s maligní transformací. pRb především blokuje buněčný cyklus v G1 fázi, čímž brání buňkám, aby se nekontrolovaně množily. V případě, že je buňka připravená k dělení, dochází k fosforylaci pRb a tím jeho inaktivaci [3].

Vzhledem ke skutečnosti, že stávající dostupné vyšetřovací metody nedokáží rozlišit, zda morfologické změny v epitelu děložního hrdla povedou ke vzniku nádoru či nikoli, roste akutní potřeba nalézt diagnostické biomarkery umožňující stanovit riziko vzniku karcinomu děložního hrdla. Aktuální a značně atraktivní možnost v tomto směru představují malé nekódující RNA molekuly zvané mikroRNA (miRNA). miRNA se obvykle váží na 3‘ UTR oblast (3‘ untranslated region), tedy 3‘ nepřekládanou oblast cílové mRNA, a indukují její degradaci nebo inhibují její translaci [4–6]. Mohou tudíž plnit funkci onkogenů, kdy inhibují expresi nádorových supresorů a jejich hladina je v nádorové tkáni zvýšená, nebo mohou mít naopak funkci antionkogenní a inhibovat expresi onkogenů, v tomto případě se v maligní tkáni obvykle setkáváme s jejich sníženou hladinou. Právě díky změnám exprese v nádorové tkáni mohou miRNA sloužit jako diagnostické, prediktivní a prognostické biomarkery, či dokonce i jako léčebné modality uplatnitelné při terapii nádorových onemocnění [7].

Spektrum miRNA spojených s karcinomem děložního hrdla není kompletně popsáno, stejně tak ani úloha doposud popsaných miRNA ve vzniku a rozvoji tohoto onemocnění. V naší práci jsme se zaměřili na rodinu miR-34, především miR-34c, jejíž členové se uplatňují jako nádorové supresory, neboť často zastávají úlohu prostředníků v rámci signalizace mezi proteinem p53 a jeho cílovými molekulami a podílejí se tak na regulaci buněčné proliferace, migrace, invazivity, angiogeneze a apoptózy [8,9].

Materiál a metody

Buněčné linie odvozené od karcinomu děložního hrdla C-4I, HeLa (obě HPV18+), Ca Ski a SiHa (obě HPV16+) byly kultivovány v D-MEM (HeLa), RPMI (Ca Ski, SiHa) a McCoy‘s (C-4I) médiu s přídavkem 10 % fetálního bovinního séra (fetal bovine serum – FBS) při 37 °C a 5 % CO₂. Buňky byly transfekovány s využitím polyethyleniminu (PEI) specifickými oligonukleotidy (miRVana microRNA), které napodobují   (miR-34c mimic, kat. číslo – 4464066) nebo inhibují endogenní miRNA (miR-34c inhibitor, kat. číslo – 4464084). V prvním kroku transfekce bylo smícháno bezsérové médium s oligonukleotidy a k nim se pak přidal PEI. Po 15min inkubaci za pokojové teploty se směs přikapala k buňkám.

Klinický materiál

V rámci studie bylo analyzováno celkem 74 vzorků – 39 pocházelo z dysplastické a 35 z přilehlé normální tkáně děložního hrdla. Jednalo se o vzorky z konizací prováděných v letech 2011–2014. Všechny pacientky podepsaly informovaný souhlas s využitím klinického materiálu k vědeckým účelům.

Kvantifikace nukleových kyselin

Celková RNA byla izolována z buněk pomocí TRIZOL reagentu (VWR). Po izolaci RNA byla stanovena její čistota a koncentrace pomocí spektrometru NanoDrop 1000. Pro určení čistoty byl stanoven poměr absorbancí A_260nm/A_280nm a pouze RNA, u kterých byl poměr v rozmezí hodnot 1,9–2,1, pak byly přepsané (10 ng RNA) do cDNA pomocí kitu   (TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit) s využitím specifických primerů pro miR-34c (Applied Biosystems). Kapková digitální polymerázová řetězová reakce (droplet-digital polymerase chain reaction – ddPCR) byla použita pro absolutní kvantifikaci molekul nukleových kyselin. Vzorky cDNA byly smíchány s fluorescenčními sondami (TaqMan MicroRNA Assays, Applied Biosystems), mastermixem (ddPCR Supermix for Probes, Bio-Rad) a olejem (ddPCR Droplet Generation Oil for Probes, Bio-Rad). Pomocí generátoru mikrokapek (QX200 droplet generátor, Bio-Rad) se vytvořily olejové mikrokapky, které pak byly podrobeny PCR reakci dle instrukcí výrobce. Mikrokapky byly následně analyzovány fluorescenčním detektorem (QX200 droplet reader, Bio-Rad).

Analýza buněčné proliferace

Transfekované buňky byly po 24hod inkubaci spočítány a přesný počet buněk (5 000) byl nanesen na jamku 96jamkové desky. Buňky byly kultivovány dalších 24 hod, médium následně odsáto a buňky promyty. Poté byly buňky fixovány a obarveny ve fixačně-barvicím roztoku složeném z formaldehydu, metanolu a krystalové violeti po dobu přibližně 20 min. Po odstranění zbytku barvicího roztoku byly buňky promyty vodou a vysušeny. Obarvené buňky byly rozpuštěny v 2% dodecylsíranu sodném (SDS) a modré zbarvení bylo měřeno spektrofotometricky při vlnové délce 595 nm. Měření proliferace bylo opakováno ve 3 nezávislých opakováních.

„Scratch“ test

Buňky byly 24 hod po transfekci nasazeny na 6jamkovou desku tak, aby se vytvořila konfluentní vrstva buněk, ve které byla vytvořena rýha pomocí plastové špičky. Postupné zacelování rýhy bylo pozorováno pod mikroskopem, snímáno každé 4 hod a následně vyhodnoceno pomocí Tscratch software [10] (CSElab, ETH). Byly provedeny vždy celkem 3 nezávislé experimenty.

Western blotting analýza

Buňky byly po transfekci lyzovány v lyzačním pufru, který obsahoval NP-40 detergent, proteázové a fosfatázové inhibitory. Proteiny byly separovány pomocí SDS polyakrylamidové gelové elektroforézy a poté přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Cílové proteiny byly detekovány pomocí specifických primárních protilátek rozeznávajících – p21 (118, vlastní), p53 (DO-1, vlastní), aktin (Santa Cruz Biotechnology), MDM2 (2A9, vlastní) a následně vhodných sekundárních protilátek (Santa Cruz Biotechnology, USA) konjugovaných s peroxidázou. Signály navázané protilátky byly detekované pomocí chemiluminiscence.

Statistika

Komparativní analýza exprese miRNA pocházející z prekanceróz děložního hrdla vzhledem ke kontrolám tvořeným přilehlými netransformovanými tkáněmi byla provedena pomocí neparametrického Mann-Whitney U testu.

Výsledky

Na panelu čtyř nádorových buněčných linií odvozených od cervikálního karcinomu byla pomocí ddPCR stanovena hladina miR-34c. Nejvyšší hladina miRNA byla detekována u buněčné linie Ca Ski, a to téměř desetinásobně vyšší v porovnání s ostatními testovanými buněčnými liniemi (graf 1). Znatelně nižší hladina miR-34c byla pozorována u HPV18+ buněčných linií HeLa a C-4I. U buněčné linie SiHa se exprese miR-34c pohybovala na hranici limitu detekce. Pro další studium byla vybrána HPV16+ buněčná linie Ca Ski, vykazující nejvýraznější  expresi miR-34c, a buněčná linie HeLa jako představitel HPV18+ buněk.

V rámci funkční analýzy úlohy miR-34c během maligní transformace a progrese cervikálního karcinomu byl do nádorových buněk vnesen buď specifický inhibitor miR-34c (34I) s cílem redukovat expresi endogenní miR-34c, nebo naopak specifický oligonukleotid mimikující přítomnost miR-34c (34M). Následné stanovení proliferace u buněčných linií Ca Ski a HeLa ukázalo, že v případě inhibice miR-34c lze u obou buněčných linií pozorovat obdobný trend, neboť buňky transfekované 34I vykazovaly v porovnání s kontrolními buňkami intenzivnější proliferaci (graf 2). V případě transfekce 34M nebyly výsledky konzistentní. Buněčná proliferace byla měřena také po 36 a 48 hod s podobným výsledkem.

Možnost, že se miR-34c nějakým způsobem účastní mechanizmů zodpovědných za citlivost/rezistenci nádorových buněk karcinomu děložního hrdla k chemoterapeutikům, byla analyzována pomocí testu viability (MTT test). Buňky transfekované 34I nebo 34M byly vystaveny působení cytostatik běžně používaných při chemoterapii, konkrétně topotekanu, cisplatině a paklitaxelu. Bylo však zjištěno, že změna v hladině miR-34c zásadním způsobem neovlivnila citlivost buněk odvozených od cervikálního karcinomu k testovaným cytostatikům (data neuvedena).

Vliv miR-34c na buněčnou migraci byl stanoven pomocí tzv. scratch testu. Buňky transfekované 34I migrovaly výrazně rychleji než kontrolní buňky (obr. 1). Naproti tomu buňky transfekované 34M sloužícím jako umělá exogenní miRNA vykazovaly pomalejší migraci. Z těchto výsledků je patrné, že miR-34c se v epiteliálních buňkách děložního hrdla přímo podílí na inhibici buněčné migrace.

Tumor supresorovou úlohu miR-34c potvrzují i výsledky analýzy prekanceróz pocházejících z děložního hrdla. Konkrétně byla hladina miR-34c stanovena u 39 HSIL a u 35 přilehlých netransformovaných tkání. Z grafu 3 je patrné, že exprese miR-34c byla u dysplazií signifikantně snížena (p < 0,01) v porovnání s přilehlou zdravou tkání.

S cílem nastínit mechanizmus, který by se mohl uplatňovat při regulaci exprese miR-34c, bylo použito srovnání sekvencí s on-line databází MethHC [11]. Zřetelně se ukázalo, že ve vzorcích pocházejících z nádorových tkání dochází často k hypermetylaci promotoru pro miR-34c v porovnání s kontrolními zdravými tkáněmi (obr. 2A). Na základě již publikovaných článků, které úzce propojují miR-34c a p53, jsme sledovali, zda budou mít změny v hladině miR-34c vliv na expresi p53 a jeho cílových molekul. Imunochemická detekce prokázala, že po transfekci Ca Ski buněk 34M došlo k mírné indukci exprese MDM2, p53, p21 i LC3b, zatímco transfekce 34I neměla žádný efekt (obr. 2B).

Diskuze

miRNA hrají důležitou úlohu v řadě patologických procesů, vč. maligní transformace. Mnoho prací se zabývá studiem odlišné exprese miRNA v nádorových a přilehlých nenádorových tkáních se záměrem objevit miRNA, které by mohly sloužit jako biomarkery nebo konkrétní cíle využitelné při léčbě nádorových onemocnění.

Tumor supresorová úloha rodiny  miR-34, jež je tvořena miR-34a/b/c, byla prokázána v řadě studií zabývajících se funkcí této miRNA u nádorových onemocnění, konkrétně se jedná o některé epiteliální nádory (karcinom plic, slinivky břišní, mléčné žlázy, prostaty, žaludku, vaječníků, střeva a konečníku), melanomy, neuroblastomy, leukemie a sarkomy [12]. Bylo zjištěno, že hladina těchto miRNA je regulována proteinem p53, který indukuje jejich expresi při genotoxickém stresu obvykle vedoucím k poškození DNA [13]. V návaznosti na zvýšenou expresi rodiny miR-34 pak obvykle dochází k indukci apoptózy a buněčné senescence. Nejznámějším zástupcem rodiny miR-34 je miR-34a, v případě této miRNA bylo popsáno snížení hladiny i u karcinomu děložního hrdla v porovnání s přilehlými netransformovanými tkáněmi, a to hned v několika nezávislých studiích [14,15]. Stran miR-34c a cervikálních malignit jsou stávající literární zdroje značně omezenější. Expresním profilováním cervikálních prekanceróz a hierarchickou klastrovou analýzou bylo identifikováno 12 odlišně regulovaných miRNA, vč. miR-34c. Studie deklaruje, že na základě identifikovaného panelu miRNA je možné rozlišit, zda se jedná o dysplastický epitel, nebo normální tkáň [16].

V naší práci jsme se zaměřili na validaci úlohy miR-34c jako nádorového supresoru a na možnosti jejího využití při detekci cervikálních dysplazií. miR-34c potvrdila svůj diskriminační potenciál při expresní analýze, která prokázala její sníženou hladinu u prekanceróz ve srovnání s kontrolní netransformovanou tkání. Současně tato miRNA vykazovala rysy nádorového supresoru, neboť se při funkčních analýzách na modelových buněčných liniích odvozených od cervikálního karcinomu podílela na inhibici buněčné proliferace a schopnosti buněk migrovat. Tyto výsledky potvrzují důležitou úlohu miR-34c v patogenezi a progresi cervikálních malignit na molekulární úrovni a naznačují možnosti jejího budoucího využití v onkogynekologické praxi.

Závěr

Funkční analýza exprese miR-34c v lidských nádorových buněčných liniích odvozených od karcinomu děložního hrdla prokázala tumor supresorovou úlohu této miRNA. Signifikantní rozdíl v hladině miR-34c mezi HSIL a normálním dlaždicobuněčným cervikálním epitelem, kde je exprese miR-34c výrazně vyšší, zřetelně dokresluje význam miR-34c při karcinogenezi děložního hrdla.

Práce byla podpořena projektem MŠMT – NPU I – LO1413, GACR P206/12/G151 a MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

doc. Mgr. Roman Hrstka, Ph.D.

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7 656 53 Brno

e-mail: hrstka@mou.cz

Přijato: 16. 7. 2018