Ferroptóza jako nový typ buněčné smrti a její role v léčbě rakoviny

Souhrn

Východiska:

Ferroptóza je jedním z nově objevených typů buněčné smrti. Je geneticky, morfologicky i biochemicky odlišitelná od dalších typů programované buněčné smrti, jako je nekróza, apoptóza i autofagie. Pro indukci ferroptózy je důležitá hladina volného železa uvnitř buněk a tvorba reaktivních kyslíkových radikálů (reactive oxygen species – ROS), které aktivují mechanizmy vedoucí k buněčné smrti. K indukci ferroptózy může dojít prostřednictvím inhibice jednoho ze dvou klíčových procesů. Prvním je zablokování přenosu cystinu do buněk pomocí cystin/glutamátového transportního systému (X_c^–), neboť cystin slouží jako prekurzor k syntéze glutathionu, hlavního buněčného antioxidantu. Druhým je inhibice glutathion peroxidázy 4, která chrání buňky před peroxidací lipidů. Ferroptóza bývá asociovaná s mnoha metabolickými poruchami, vč. neurologických chorob nebo rakoviny. Molekuly zapojené do drah aktivujících ferroptózu se podílejí na obraně buněk před stresovými podmínkami, napomáhají udržovat hladinu nikotinamidadenindinukleotidfosfátu, glutathionu a homeostázu železa. Důležitá je také spojitost s autofagií. Pomocí tzv. ferritinofagie dochází k uvolňování železa z lysozomů do cytosolu buněk. Následnou kaskádou reakcí uvolněných nestabilních atomů železa s jinými molekulami dochází k produkci ROS a iniciaci buněčného stresu, jež je spouštěčem ferroptózy. U onemocnění, jako je rakovina, při které jsou mechanizmy indukující buněčnou smrt, vč. apoptózy potlačeny obvykle z důvodu genetických změn, může indukce alternativního způsobu buněčné smrti představovat atraktivní léčebnou strategii.

Závěr:

V posledních letech je výzkum nových protinádorových léků směřován na aktivaci alternativních drah buněčné smrti, které mohou překonat narušené metabolické procesy uvnitř rakovinných buněk nebo rezistenci buněk k běžně podávané chemoterapii. Byla nalezena celá řada molekul, které mohou ferroptózu v nádorových buňkách indukovat, což dodává jejímu výzkumu na významu, neboť by mohl vést k objevu nových alternativ při léčbě nádorových onemocnění.

Klíčová slova:

buněčná smrt – rakovina – autofagie – ferroptóza – ferritinofagie – buněčný stres – ROS

Úvod

Buněčná smrt je klíčovým fyziologickým mechanizmem, na kterém je závislý vývoj organizmu prakticky již od počátku embryogeneze, vč. plnohodnotné funkce imunitního systému nebo udržování správné funkce tkání a orgánů u dospělých mnohobuněčných organizmů [1–5]. Původně se předpokládalo, že existují pouze 2 typy buněčné smrti, programovaná – apoptóza – nebo neprogramovaná – nekróza. Následkem vnějších faktorů, jako jsou zranění nebo infekce, buňka obvykle reaguje na nepříznivé podmínky nevratnými procesy a bývá likvidována prostřednictvím nekrózy. Spolu s nekrózou existují i další typy buněčné smrti, které jsou geneticky programované a bývají buňkou záměrně vyvolávány. Slouží převážně jako obranný mechanizmus před poškozením buněk následkem patogenů, buněčného stresu nebo např. kumulací mutací v genech důležitých pro zásadní procesy uvnitř buňky [6]. Jedním z nejlépe prostudovaných typů programované buněčné smrti (programmed cell death – PCD) je apoptóza. Důsledkem apoptózy je např. diferenciace prstů v rozvíjejících se embryích [7]. Její deregulace může vést ke vzniku vrozených vývojových vad nebo k rozvoji rakoviny [8–11]. Během posledních desetiletí se však ukázalo, že apoptóza není zdaleka jediným typem PCD. Zkoumání jejích nových typů se stalo předmětem intenzivního výzkumu. Mezi nově objevené typy PCD patří autofagie, nekroptóza, pyroptóza, pyronekróza a také ferroptóza [6,12–15].

Ferroptóza je relativně nově objeveným typem PCD, která je morfologicky, biochemicky i geneticky odlišitelná od dalších typů buněčné smrti. Morfologické odlišnosti byly prokázány transmisní elektronovou mikroskopií, která potvrdila, že ferroptotické buňky mají jasné substrukturní změny [14]. Pro buňky podléhající ferroptóze jsou charakteristické menší mitochondrie s nižší hustotou mitochondriálního obsahu a naopak zvýšeným mitochondriálním membránovým potenciálem [14,16]. Naopak klasické znaky objevující se u ostatních typů buněčné smrti, jako je kondenzace chromatinu u apoptózy nebo ruptury buněčné stěny u nekrózy, nebyly u ferroptotických buněk pozorovány [14]. Z biochemického hlediska dochází při ferroptóze k produkci cytosolických a lipidových reaktivních kyslíkových radikálů (reactive oxygen species – ROS), jejichž tvorba ústí k vyčerpání antioxidantů v buňkách a následné buněčné smrti [14].

Historie objevu ferroptózy

Pojem ferroptóza byl poprvé zaveden v roce 2012 americkými vědci pod vedením profesora Brenta R. Stockwella [14] během výzkumu malých molekul erastinu, RSL3 a RSL5. Jedná se o sloučeniny selektivně letální pro nádorové buňky nesoucí mutace v onkogenu RAS. Z tohoto důvodu byly pojmenovány jako RAS-selektivně letální molekuly (RSL) [17,18]. Jejich význam podtrhuje skutečnost, že geny rodiny malých GTPáz RAS (HRAS, NRAS a KRAS) jsou mutovány přibližně u 30 % všech nádorů [19], vč. nemalobuněčných nádorů plic [20], nádorů tlustého střeva [21], slinivky [22] nebo štítné žlázy [21,23]. Současně jsou pak tyto mutace u řady nádorů spojeny i se špatnou prognózou [23].

U nových RSL molekul však bylo třeba objasnit mechanizmus účinku, neboť nebyly pozorovány klasické rysy apoptózy, jako je aktivace kaspáz, fragmentace chromatinu nebo uvolňování cytochromu c z mitochondrií [17,18,24]. Všechny tři sloučeniny naopak indukovaly RAS-RAF-MEK-závislou oxidativní buněčnou smrt [17,24]. Dále bylo zjištěno, že erastin spolu s RSL5 pro svoji funkci vyžadují přítomnost mitochondriálního anion-selektivního kanálu 3 (voltage-dependent anion channel – VDAC3), kdežto RSL3 funguje nezávisle na VDAC kanálech [24]. U všech tří molekul pak dochází k potlačení účinku po použití různých chelátorů železa. To úzce souvisí se skutečností, že mutantní Ras zvyšuje hladinu transferinových receptorů (TfR1) [24], které převádějí komplexy železa do cytoplazmy, kde následně dochází k jeho uvolnění (schéma 1) [25,26]. Stejně tak mutantní Ras snižuje množství ferritinu, jehož molekula slouží ke skladování železa v buňkách [27]. Zesíleným transportem a současně snížením množství molekul, které udržují železo v navázaném stavu, pak dochází ke zvyšování volného železa v buňce [24]. Volné reaktivní železo Fe²⁺ uvolněné z endozomů nebo lysozomů je zapojeno do produkce ROS prostřednictvím Fentonovy reakce [28]. Smrt indukovaná prostřednictvím RSL je tedy spojena se zvýšením produkce ROS díky zabránění chelatace železa, popř. genetickou inhibicí hladiny železa v cytoplazmě [17,24]. I další proteiny zapojené v podobně působících drahách mohou rovněž aktivovat ferroptózu [17]. Dokonce bylo prokázáno, že jeden z nejdůležitějších nádorových supresorových proteinů, protein p53, často označovaný jako strážce genomu [29], může být zapojen do některých mechanizmů iniciujících ferroptotickou buněčnou smrt [30].

Metabolizmus železa při ferroptóze

Buněčné železo se zdá být jedním z nejdůležitějších faktorů při tvorbě lipidových peroxidových radikálů během ferroptózy [14,17]. Volné atomy železa Fe²⁺ se mohou za přítomnosti peroxidu vodíku pomocí tzv. Fentonovy reakce oxidovat na Fe³⁺, z peroxidu je současně odebrán elektron a dochází k produkci hydroxylových radikálů přímo uvnitř buněk [31]. To vede k indukci buněčného stresu, poškození buňky volnými radikály a spuštění ferroptózy [14]. Z tohoto důvodu se buňky snaží chránit před vlivy volného železa hned několika způsoby. Jedním z nejdůležitějších proteinů, který plní v buňce tuto ochrannou funkci, je ferritin [32]. Jedná se o protein tvořený 24 podjednotkami lehkých a těžkých řetězců [32], přičemž těžké řetězce vykazují navíc ferroxidázovou aktivitu. Přijímané železo Fe²⁺ je pomocí těchto řetězců oxidováno na Fe³⁺ a skladováno uvnitř ferritinu v netoxických a biologicky dostupných formách [33]. Při zvýšené potřebě reaktivní formy železa je ferritin v lysozomech degradován a železo je uvolněno do  cytosolu [34,35].

Transferin je dalším důležitým proteinem, který se uplatňuje především při transportu železa. Tento extracelulární protein je schopen vázat 1–2 ionty železa Fe³⁺, které přenáší krevním řečištěm, dokud není zachycen TfR1 lokalizovaným na povrchu buněk [25,36]. Komplex receptoru s navázaným transferinem je posléze pohlcován endocytózou dovnitř buněk. Z endozomů jsou následně za účasti transmembránového transportéru DMT1 (divalent metal transporter-1), známého také jako Nramp2 (natural resistance-associated macrophage) uvolňovány do cytoplazmy nestabilní atomy železa Fe²⁺ spolu s volným transferinem a TfR1, který je připraven k dalšímu transportu [36,37].

Pro udržování správné hladiny železa v buňce je kromě transportu dovnitř důležitý také transport železa ven z buňky. Jediným známým transportérem, který převádí železo ven přes buněčnou membránu do krve, je ferroportin 1. Je kódován genem SLC40A1 [38]. Jeho správná regulace je rozhodující pro udržování optimální hladiny železa. Změny v hladině ferroportinu mohou vést k nedostatku, nebo naopak k nadbytku železa uvnitř buněk. Bylo prokázáno, že nedostatečná funkce ferroportinu může mít za následek ztrátu homeostázy a způsobit např. anémii u myší [39,40].

Mechanizmus ferroptózy

Ferroptóza, tj. na intracelulárním železe závislá regulovaná forma buněčné smrti, může být indukována dvěma různými mechanizmy. Prvním z nich je inhibice cystin/glutamátového transportního systému X_c^– (na sodíku nezávislém), který je vyžadován při transportu cystinu do buněk, kde dochází k syntéze glutathionu, hlavního buněčného antioxidantu. Narušením tohoto systému dochází k vyčerpání glutathionu a vzniku oxidativního stresu [41,42], což může být mimo jiné spouštěno i malými molekulami, tzv. induktory ferroptózy třídy I (FINs I) [42]. Druhým podnětem pro vznik ferroptotické buněčné smrti je inhibice glutathion peroxidázy 4 (GPX4), která používá glutathion k detoxikaci lipidových peroxidů [41,42]. GPX4 může být přímo inhibována tzv. induktory ferroptózy třídy II (FINs II) [42].

Cystin/glutamátový transportní systém X_c^–

V roce 1980 Bannai a Kitamura poprvé zdokumentovali X_c^– transportní systém v lidských embryonálních plicních fibroblastech [43]. O 2 roky později pak v podstatě totéž ukázali Makowske a Christensen v transformovaných krysích buněčných liniích hepatomu [44]. Systém X_c^– působí jako obousměrný přenašeč aniontových forem cystinu a glutamátu a je závislý na Cl^– a nezávislý na Na⁺ [45]. I když může transportovat obě aminokyseliny v obou směrech, jeho hlavním úkolem je zásobovat buňku cystinem a odvádět glutamát ven z buňky. Intracelulární zásoba cystinu je poměrně malá, zatímco koncentrace intracelulárního glutamátu je v buňce obecně vyšší než v extracelulárním prostoru, proto jsou molekuly přenášeny především po koncentračním spádu [46]. Extracelulární glutamát pak funguje jako kompetitivní inhibitor vychytávající cystin prostřednictvím transportního systému X_c^– [44]. Bylo prokázáno, že nejen radikály, ale i různá elektrofilní činidla [47], bakteriální lipopolysacharidy a zánětlivý cytokin (faktor nádorové nekrózy α  (tumor necrosis factor – TNFα)) [48] nebo např. i pěstování buněčných kultur neutrofilů [49] nebo makrofágů [50] v podmínkách 21% hladiny kyslíku může systém X_c^– aktivovat. V roce 2012 Dixon et al prokázali souvislost mezi aktivací ferroptózy a cystin/glutamátovým transportním systémem, a to díky výzkumu zaměřenému na studium mechanizmu účinku ferrostatinu 1, který je selektivním inhibitorem ferroptózy indukované erastinem [14]. Současně byla objevena celá řada molekul, které jsou naopak schopny ferroptotickou buněčnou smrt navodit (tab. 1).

Značný vliv na hladinu transportéru systému X_c^– může mít také protein p53. Bylo prokázáno, že p53 indukuje ferroptózu snížením exprese genu SLC7A11, který kóduje cystin/glutamátový transportní systém [51–53]. V důsledku toho dochází ke snížení příjmu cysteinu, vyčerpání hladiny antioxidantu glutathionu, což vede k neschopnosti buňky bojovat s oxidativním stresem [41,42].

Glutathion peroxidáza 4

Glutathion peroxidáza 4 (GPX4) je jednou z osmi glutathion peroxidáz známých u savců. S výjimkou GPX5, -7 a -8 (a GPX6 u hlodavců) obsahují všechny glutathion peroxidázy místo cysteinu selenocystein, který má jeden atom síry nahrazen selenem [62]. Uvádí se, že selenocystein zde pravděpodobně zvyšuje účinnost v redoxních reakcích [63].

GPX4 funguje jako monomerní peroxidáza [64]. Kromě jednoduchých peroxidů a malých hydroperoxidů je schopná redukovat také hydroperoxidy v komplexních lipidech, např. fosfolipidové, cholesterolové a cholesterolesterové hydroperoxidy začleněné v biomembránách a lipoproteinech [64,65]. Vyčerpáním GPX4 tedy dochází ke snížení ochrany buněk před negativním účinkem reaktivních radikálů, hromadění lipidových peroxidů a k vyčerpání polynenasycených mastných kyselin v lipidových dvojvrstvách, což může vést k indukci ferroptózy  [14,42,56,66–68].

Ferroptóza a její spojení s autofagií

Autofagie (z řečtiny „vlastní stravování“) je evolučně konzervovaný homeostatický mechanizmus, který je zapojen do mnoha procesů udržujících správný chod buňky, jako je odstraňování špatně složených proteinů, poškozených organel a buněk napadených patogeny nebo také patologických stavů, vč. infekce nebo procesů souvisejících s rakovinou [69,70]. Nedávno bylo zjištěno, že aktivace autofagie je také jedním z důležitých induktorů ferroptózy v nádorových i normálních lidských buňkách [71–73]. Inhibitory autofagie jsou schopny ochránit buňky před vstupem do ferroptózy pravděpodobně prostřednictvím procesů zabraňujících tvorbě cytosolických a lipidových ROS [73]. K degradaci ferritinu jako zásobárny železa v buňkách dochází prostřednictvím lysozomů během autofagického procesu. V roce 2014 byl tento proces pojmenován jako ferritinofagie a současně s tím byl identifikován jaderný receptorový koaktivátor 4 (nuclear receptor coactivator 4 – NCOA4) přispívající k degradaci ferritinu během ferritinofagie [34]. Snížení aktivity receptoru NCOA4 stejně tak jako inhibice Atg5 a Atg7 omezuje degradaci ferritinu, snižuje hladinu reaktivního železa v cytosolu a potlačuje ferroptózu v normálních fibroblastech i nádorových buňkách [72]. Oproti tomu zvýšení hladiny NCOA4 urychluje ferroptózu, přičemž degradací ferritinu dochází k uvolnění železa do cytosolu [72]. Tato zjištění naznačují, že selektivní autofagie může hrát významnou úlohu při zprostředkování ferroptózy [72].

Ferroptóza a nádorová onemocnění

Nádorová buňka nese ve své genetické výbavě celou škálu mutací narušujících základní obranné mechanizmy. Mimo mutace v genech, jako jsou např. TP53, RB1 nebo RAS, které dovolují buňce překonat kontrolní mechanizmy zastavující buněčný cyklus či indukující buněčnou smrt, se nádorové buňky často setkávají také s nárůstem oxidativního stresu následkem změn v metabolických procesech a okolním mikroprostředí [74]. V reakci na zvýšenou hladinu ROS nádorová buňka indukuje zvýšení antioxidační aktivity s cílem udržet redoxní homeostázu [75]. To přímo souvisí také s hladinami volného železa v cytoplazmě. Bylo prokázáno, že některé onkogeny, vč. RAS a MYC, mění metabolizmus železa a jeho množství v buňkách tím, že ovlivňují expresi ferritinu nebo TfR1 [24,76–79].

Porozumění těmto procesům může mít velký vliv při hledání nových způsobů léčby rakoviny díky možnosti přesného zacílení na konkrétní části metabolických drah, které úzce souvisejí s redoxním stresem. Jednou z variant může být právě navození ferroptózy, která byla pozorována v ledvinových buňkách, neuronech a dále také v širokém spektru nádorových buněk, např. prsních, plicních, ovariálních, melanomech, gliomech a dokonce i u nádorů  kostí [14,41,42,51–54,66,67,80–82].

Závěr

Ferroptóza jako jeden z nových typů programované buněčné smrti představuje proces, který je zcela závislý na množství reaktivního železa uvnitř cytoplazmy buněk. K aktivaci dochází narušením systémů, které v buňkách odbourávají ROS a lipidové peroxidy vznikající při chemických reakcích nebo nadměrném vystavení buněk oxidativnímu stresu. Na této skutečnosti je založen i současný výzkum, který se cíleně věnuje možnosti aktivovat alternativní dráhy buněčné smrti, vč. ferroptózy, s cílem obejít narušené metabolické procesy uvnitř nádorových buněk, se kterými je často spojena i rezistence ke standardně podávané terapii. Bylo prokázáno, že velké množství nádorových buněčných linií vykazuje citlivost k induktorům vyvolávajícím ferroptózu, proto i hledání nových sloučenin spouštějících ferroptózu představuje značně atraktivní alternativu, která může vést k objevu nových, účinnějších léků.

Práce byla podpořena projekty GAČR 17- 05838S, MŠMT – NPU I – LO1413 a MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Hana Skoupilová

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7 656 53 Brno

e-mail: hana.skoupilova@mou.cz

Přijato: 31. 8. 2018