Možnosti využití p63 v bioptické diagnostice

Souhrn

Východiska:

Transkripční faktor p63 je homologem p53, nicméně jeho role ve vývoji a onkogenezi není tak jednoznačná. Gen TP63 kóduje množství N-a C-koncových izoforem proteinu, jejichž exprese a funkce se navzájem liší. Nejlépe prostudované jsou N-koncové varianty DNp63 (p40) a TAp63. p40 je charakteristickým markerem bazálních nebo myoepiteliálních buněk víceřadých epitelů a podílí se na regulaci proliferace a diferenciace. TAp63 izoforma je více exprimována v buňkách suprabazální vrstvy a kromě epitelů také v primárních oocytech, lymfocytech a stromálních buňkách, je schopná indukovat apoptózu a hraje roli v udržování genomové integrity. Role jednotlivých izoforem se liší také v nádorové progresi, kdy p40 je obecně považována za onkoprotein zapojený do regulace nádorových kmenových buněk, zatímco exprese TAp63 je spojována s lepší prognózou onemocnění.

Cíl:

Jaderná exprese p63 je markerem používaným v klinické patologii k diagnostice různých typů malignit, nejčastěji dlaždicobuněčného karcinomu plic či karcinomů urogenitálního traktu, svou roli hraje také ve vyšetření bioptických vzorků karcinomu prsu (breast carcinoma – BC) a prostaty (prostate carcinoma – PC). U neoplastických buněk lze však při použití protilátky 4A4 pozorovat expresi p63 také v cytoplazmě či v extracelulárním materiálu. Tento přehledový článek stručně shrnuje možnosti a nástrahy použití p63 v bioptické diagnostice, zejména u BC a PC, poukazuje také na potenciál využití specifických protilátek proti izoformám p40 a TAp63. Zabývá se rovněž dalším klinickým využitím p63 v histogenetické klasifikaci nádorů.

Klíčová slova:

p63 – DNp63 (p40) – TAp63 – karcinom prsu – karcinom prostaty

Úvod

Protein p63 patří do rodiny transkripčního faktoru a nádorového supresoru p53, kam se kromě p53 řadí také p73. Tyto proteiny navzájem vykazují vysokou sekvenční homologii a sdílejí stejnou doménovou strukturu, což jim umožňuje navzájem interagovat či vázat se na transkripční cíle ostatních členů rodiny. Role jednotlivých proteinů se ve vývoji tkání a onkogenezi liší, odlišná je dokonce i funkce jednotlivých izoforem. Gen TP63 kóduje nejméně 10 různých izoforem p63. Transkripce ze dvou různých promotorů umožňuje vznik dvou N-koncových izoforem, plnodélkové TAp63 a N-koncově zkrácené DNp63 izoformy, která bývá rovněž označována jako p40 a postrádá N-koncovou transkripčně aktivační doménu. Alternativním sestřihem pak vznikají C-koncové varianty (a, b, g, d, e) [1,2]. Převládající izoformou v tkáních je p40, která je exprimovaná ve vysoké míře v bazálních a myoepiteliálních buňkách vrstevnatého dlaždicového a žláznatého epitelu různých orgánů [3] a je také známa pro svou roli v udržování proliferativního potenciálu epiteliálních kmenových buněk [4,5]. S mírou buněčné diferenciace exprese p40 klesá. TAp63 se naopak vyskytuje v bazálních epiteliálních buňkách pouze zřídka, vyšší expresi lze pak pozorovat v buňkách umístěných suprabazálně, což naznačuje odlišnou roli obou izoforem v průběhu diferenciace [6]. Exprese TAp63 je také charakteristická pro jádra primárních oocytů [7], byla detekována v lymfocytech a stromálních buňkách [8]. Nedávno byla popsána nová izoforma GTAp63 vyskytující se u prekurzorů samčích zárodečných buněk, kde přispívá k udržování integrity genomu [9]. Z hlediska onkogeneze je TAp63 obecně považována za nádorový supresor díky schopnosti indukovat zástavu buněčného cyklu a apoptózu [10], zatímco p40 vykazuje vlastnosti onkoproteinu a její vysoká exprese je charakteristická zejména pro dlaždicobuněčné karcinomy [11], uroteliální karcinomy [12] a karcinomy bazálního typu [13–15]. O p40 se také diskutuje jako o markeru nádorových kmenových buněk u různých typů nádorových onemocnění [16]. Nicméně TAp63 se rovněž může chovat jako onkoprotein a bylo prokázáno, že je převládající izoformou u některých typů hematologických malignit [17] (tab. 1). O jednotlivých C-koncových izoformách p63 se ví zatím pouze málo, což je také způsobeno komerční nedostupností specifických protilátek (s výjimkou p63a a g), současné studie však naznačují jejich rozdílné funkce [18,19]. V bioptické diagnostice se využívá průkaz p63, event. cíleně průkaz p40 dvěma základními způsoby. V první řadě se jedná o znázornění myoepitelií nebo bazálních buněk s cílem zhodnotit invazivitu, nebo obecněji malignitu léze. Dalším použitím je průkaz p40 jako markeru diferenciace nádoru směrem k víceřadému epitelu nebo k jeho histogenetickému zařazení.

Průkaz myoepitelií nebo bazálních buněk

U normální tkáně mléčné žlázy je jaderná exprese p63 charakteristickým markerem myoepiteliálních buněk, zatímco luminální buňky jsou p63 negativní. Použití p63 v nádorové patologii odstartovala celá řada studií zaměřených na duktální karcinom in situ (DCIS), které navrhly použití přítomnosti myoepiteliálních buněk k odlišení invazivních a neinvazivních lézí [20,21]. Myoepiteliální buňky tvoří v nenádorové mléčné žláze souvislou vrstvu lemující epiteliální stranu bazální membrány. U karcinomů in situ jsou myoepiteliální buňky zachovány, příp. mírně redukovány v hustotě. Kompletní absence myoepitelií pak svědčí pro invazivní charakter léze [20].

Podrobnější studie zaměřené na charakteristiky myoepiteliálních buněk v in situ karcinomech duktálního, ale rovněž lobulárního (lobular carcinoma in situ – LCIS) a papilárního typu nebo intraduktálních papilomů prokazují alteraci imunofenotypu ve smyslu snížené exprese některých markerů, p63 však má relativně nejvyšší citlivost [22–24]. Vzhledem k dále diskutovaným skutečnostem o jeho expresi v invazivních nádorech je však jeho specificita částečně omezena a ve sporných případech se doporučuje vždy použití dvou markerů, zejména doplnění průkazu p63 o barvení kalponinu [24,25]. Dalšími používanými markery myoepiteliálních buněk jsou CD10, myozin těžkého řetězce hladkého svalstva (smooth muscle myosin heavy chain – SMMHC) či cytokeratiny 5/6, a to často spolu s p63 jako součástí různých protilátkových koktejlů [25–27]. U vzácných epiteliálně-myoepiteliálních karcinomů prsu (breast carcinoma – BC), jako jsou myoepiteliální karcinomy [28] či adenoidně cystické karcinomy [29], však myoepiteliální p63 pozitivní buňky tvoří součást nádoru.

Nicméně ne všechny neoplastické buňky běžných karcinomů jsou p63 negativní. Mimo jadernou lokalizaci bylo imunohistochemické barvení p63 u řady invazivních BC pozorováno také v cytoplazmě neoplastických buněk, ovšem pouze ve studiích využívajících nejčastěji používanou anti-p63 protilátku klon 4A4 [13,30–32]. Ve srovnání s 4A4 je pak p40 protilátka s výhradně jaderným barvením považována za více specifickou [33]. Jelikož ale bývá cytoplazmatická exprese p63 v literatuře často zmiňována, bude jí věnován prostor také v této publikaci.

Mezi nádory charakteristické vysokou jadernou expresí p63 patří zejména karcinomy bazálního typu 2 (basal like 2 – BL2) patřící do skupiny triple negativních BC (TNBC), které jsou negativní pro estrogenový (ER), progesteronový (PR) receptor a také receptor typu 2 pro lidský epidermální růstový faktor (human epidermal growth factor receptor 2 – HER2) [34]. U TNBC bazálního typu byla pozorována rovněž vyšší exprese p63 v cytoplazmě ve srovnání s nebazálními typy [13]. Jadernou expresi p63 lze nalézt také u malého procenta ER+ karcinomů [35,36].

Z pohledu histologické klasifikace BC byla jaderná exprese p63 navržena jako specifický marker metaplastických karcinomů [37]. Nicméně p63 pozitivní je také relativně vysoké procento medulárních a atypických medulárních karcinomů [38]. V literatuře lze nalézt rovněž případy p63 pozitivních maligních fyloidních či sarkomatoidních nádorů [39]. Jaderná i cytoplazmatická exprese byla pozorována u některých invazivních mikropapilárních [40] a také u sekrečních karcinomů, kde byl p63 pozitivní také intraluminální sekretovaný materiál [31,41]. Příkladem karcinomu s atypickou expresí p63 je s těhotenstvím spojený BC. Myoepiteliální buňky u tohoto onemocnění vykazují sníženou jadernou expresi p63, zatímco asociované epiteliální buňky jsou pozitivní pro cytoplazmatickou expresi tohoto proteinu. Aberantní cytoplazmatická exprese p63 zde zřejmě přispívá k zvýšení invazivity a agresivity epiteliálních buněk [30,32].

Při použití 4A4 protilátky je zapotřebí počítat se skutečností, že rozpoznává všechny izoformy p63 a navíc vykazuje křížovou reaktivitu s p73 [8]. Specificita cytoplazmatického barvení touto protilátkou je také předmětem diskuzí. Vzhledem k odlišným funkcím jednotlivých izoforem p63 a p73 v nádorové progresi se jeví použití izoformově specifických monoklonálních protilátek jako lepší diagnostický nástroj. Studie hodnotící specificitu a citlivost p40 jako markeru myoepiteliálních buněk ve srovnání s 4A4 ukazují, že použití obou protilátek je srovnatelné [42–44]. Nicméně např. u TNBC použití protilátek specifických proti jednotlivým variantám p63 ukázalo, že zatímco exprese p40 asociuje s metaplastickými a medulárními karcinomy a s bazálním buněčným fenotypem, exprese TAp63 koreluje s expresí androgenového receptoru (AR), nemutovaným BRCA1/2 statusem a pozitivitou PTEN. TAp63 pozitivní nádory navíc vykazují lepší celkové přežití [45].

Jaderná exprese p63 je v klinické praxi používána také jako marker bazálních buněk prostaty. Bazální buňky prostaty podobně jako myoepiteliální buňky prsu tvoří souvislou vrstvu podél bazální membrány pod vrstvou luminálních buněk. V prostatě se navíc vyskytuje ještě jeden buněčný typ, buňky neuroendokrinní, které jsou spolu s luminálními buňkami p63 negativní [46,47]. p63 pozitivní bazální buňky lze nalézt u benigní prostatické hyperplazie (BPH), u prekancerózní prostatické intraepiteliální neoplazie (PIN) a v adenóze prostaty. Většina karcinomů prostaty (prostate carcinoma – PC) je ovšem p63 negativní [48]. Proto je také negativita p63 používána k odlišení dobře diferencovaných invazivních karcinomů v punkčních biopsiích, nejčastěji v rámci protilátkového koktejlu spolu s alfa-metylacyl racemázou (AMACR) a cytokeratiny o vysoké molekulové hmotnosti (high molecular weight cytokeratins – CK HMW, 34be12) [49]. V literatuře lze však najít i kazuistiky p63 pozitivních invazivních PC. Existují vzácné případy PC z bazálních buněk [14,15] a také případy p63 pozitivních adenokarcinomů, které jsou molekulárně odlišné od PC obvyklého typu a také od karcinomů z bazálních buněk a vykazují expresi bazálních i luminálních markerů. Tyto nádory jsou pozitivní při použití 4A4 a většina z nich také při použití p40 protilátky [50,51]. Stejně jako u BC byly u PC rovněž zaznamenány případy cytoplazmatické exprese p63 u neoplastických buněk, exprese tohoto markeru navíc korelovala se zvýšenou mortalitou [52].

Histogenetická klasifikace nádorů

V řadě nádorových lokalit může být průkaz diferenciace karcinomu směrem k víceřadému epitelu klinicky důležitý. Výrazným příkladem je klasifikace nemalobuněčných plicních karcinomů v malých, morfologicky často málo reprezentativních punkčních biopsiích. Pozitivita p40 je zde spolu s negativitou tyroidního transkripčního faktoru 1  (TTF1) a Napsinu A typickým znakem dlaždicobuněčných karcinomů a vylučuje adenokarcinom [53]. Použití p40 specifických protilátek zde značně zlepšuje specificitu diagnózy [54]. V situaci, kdy je k dispozici omezené množství materiálu, je tak možno optimalizovat sekvenci navazujících prediktivních vyšetření, jako jsou mutace receptoru pro epidermální růstový faktor (epidermal growth factor receptor – EGFR) a translokace genu anaplastické lymfomové kinázy (ALK) u adenokarcinomu či exprese ligandu receptoru programované buněčné smrti 1 (programmed death-ligand 1 – PD-L1) u spinocelulárního karcinomu. Obecné rozlišení mezi adenokarcinomem a spinocelulárním nebo uroteliálním karcinomem pomocí barvení p40 je také užitečné zejména při vyšetření morfologicky nezařaditelných nádorů urogenitálního traktu [55]. V patologii slinných žláz se barvení p63 používá k rozlišení acinárního (negativní) a mukoepidermoidního (pozitivní) karcinomu slinných žláz [56]. Rozdíly v expresi p63 mezi intermediárním trofoblastem choriových klků a implantačním trofoblastem mohou být dále využity v diferenciální diagnostice vzácnějších trofoblastických nádorů a případně dalších trofoblastických lézí [57].

Závěr

Imunohistochemické barvení p63, zejména izoformy DNp63 (p40), je v současné době dobře zavedenou metodou bioptické diagnostiky sloužící zejména k průkazu invazivity negativních nádorových lézí v orgánech s víceřadým epitelem (prs, prostata) a k upřesnění histogenetické klasifikace karcinomů (plíce, urogenitální trakt). Potenciál průkazu p63, příp. jeho specifických izoforem v souvislosti s možnou úlohou v biologii nádorových kmenových buněk nebo jako prediktivního markeru na své možné naplnění teprve čeká.

Práce byla podpořena projektem MŠMT – NPU I – LO1413.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Michaela Galoczová

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7 656 53 Brno

e-mail: michaela.galoczova@mou.cz

Přijato: 17. 8. 2018