Molekulární biologie preinvazivních a invazivních nádorů prsu

Souhrn

Cíl studie:
Podat přehled molekulárních charakteristik a odlišností preinvazivních a invazivních lézí mléčné žlázy.

Typ studie:
Přehledová práce.

Název a sídlo pracoviště:
Onkogynekologické centrum, Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a VFN, Praha.

Materiál a metodika:
Přehled literatury.

Závěr:
Molekulárně genetická charakteristika jednotlivých lézí může identifikací genetických a epigenetických změn typických pro jednotlivé skupiny přispět ke klasifikaci preinvazivních i invazivních nádorů prsu, a tím i k jejich managementu. Vzhledem k často naprosto odlišnému biologickému chování morfologicky shodných preinvazivních i invazivních nádorů je jasné, že klíč k diferenciaci jednotlivých skupin a rozpoznání jejich prognostického významu je ukryt v genomu a event. proteomu konkrétní nádorové buňky.

Klíčová slova:
karcinom prsu, DCIS, LCIS.

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PREINVAZIVNÍCH LÉZÍ PRSU

Karcinom prsu je malignitou s nejvyšší incidencí u žen v České republice. Podle nejnovějších údajů Národního onkologického registru, které jsou k dispozici za rok 2003, bylo v tom roce zaznamenáno v naší zemi 5533 případů karcinomu prsu (105,5 případu/100 000 žen). Zhoubný nádor prsu je tak po kolorektálním karcinomu druhou nejčastější příčinou úmrtí na nádorové onemocnění u žen v České republice.

V souvislosti s technickým pokrokem v diagnostických zobrazovacích i operačních metodách stoupá i podíl zachycených přednádorových nebo časných nádorových (carcinoma in situ) lézí. A právě management těchto lézí v současnoti představují dynamicky se vyvíjející oblast, která posunuje terapii od invazivních forem nádorů k preinvazivním.

Mezi prekurzory a preinvazivní léze prsu patří atypická duktální hyperplazie (ADH), duktální carcinoma in situ (DCIS) a skupina lobulárních neoplazií. Tyto léze tvoří velmi heterogenní skupinu a představují problém definice jednotlivých kategorií, klasifikace, diagnostiky i managementu pacientek ve vztahu k riziku vzniku invazivního karcinomu. Morfologická klasifikace nedokáže klasifikovat preinvazivní léze s ohledem na jejich potenciál malignizace, a nemůže tak zcela pomoci v klinickém rozhodování o způsobu vedení a event. radikalitě navrhované léčby. Proto je v popředí zájmu hledání nových markerů a způsobů klasifikace těchto lézí právě s ohledem na jejich biologické chování.

Molekulárně genetická charakteristika jednotlivých lézí může identifikací genetických a epigenetických změn typických pro jednotlivé skupiny přispět ke klasifikaci preinvazivních i invazivních nádorů prsu, a tím i k jejich managementu.

Vzhledem k často naprosto odlišnému biologickému chování morfologicky shodných preinvazivních i invazivních nádorů je jasné, že klíč k diferenciaci jednotlivých skupin a rozpoznání jejich prognostického významu je ukryt v genomu a event. proteomu konkrétní nádorové buňky. Následující přehled uvádí dostupná data, která mohou sloužit pro přehled hlavních cest kancerogeneze a naznačují slibné oblasti pro cílenou (targeted, tailored) terapii v budoucnu.

Estrogenové receptory

Estrogeny hrají ústřední roli v růstu a diferenciaci epitelů prsní žlázy, stimulují proliferaci buněk a regulují (prostřednictvím komplexu hormon-jaderný receptor) expresi dalších genů, včetně např. genu pro receptor progesteronu.

V normální premenopauzální žláze tvoří buňky exprimující estrogenové receptory (ER+) pouze 7 % všech epiteliálních buněk. ER+ jsou především luminální epiteliální buňky a jsou rovnoměrně distribuované. Zřejmě parakrinně ovlivňují proliferaci okolních ER- buněk. Zastoupení ER+ buněk stoupá s věkem a dosahuje setrvalého maxima po menopauze.

Zvýšená exprese estrogenového receptoru α způsobí trojnásobné navýšení relativního rizika vzniku invazivního karcinomu. V terénu hyperplazie bez atypií pak spojení vyšší jaderné pozitivity ER a zvýšené exprese Ki-67 ukazuje na potenciál léze dále progredovat. Je také pravděpodobné, že zvýšené zastoupení ER+ buněk v okolí neinvazivní léze předznamenává možnost progrese v malignitu lépe než ER pozitivita v lézi samé.

Estrogenový receptor β vykazuje v nemnoha jemu věnovaných studiích tendenci opačnou – jeho zastoupení v tkáni se v sekvenci od normálního epitelu k preinvazivní lézi snižuje. Zdá se, že poměr ERα/ERβ by mohl v terénu epiteliální hyperplazie bez atypií dobře předpovídat možnou progresi v invazivní karcinom. Samotné regulační cesty těchto receptorů jsou ovlivňovány produkty dalších genů, jako např. AIB1 nebo Hsp-27.

Progesteronový receptor

Podobně jako u estrogenového receptoru i u receptoru progesteronu (PgR) byla nalezena zvýšená exprese již na úrovni prvního mikroskopicky rozeznatelného stadia premaligních změn – v hyperplastické rozšířené lobulární jednotce (hyperplastic enlarged lobular unit – HELU). V průběhu vývoje v invazivní karcinom však naopak exprese PgR opět klesá. U DCIS je exprese PgR spojena s expresí ER a s nepřítomností komedo nekróz. Ve tkáni invazivního duktálního karcinomu koreluje exprese PgR s gradingem nádoru, v premaligních lézích nebyla tato závislost dosud pozorována.

Spíše než absolutní exprese PgR má zřejmě vyšší výpovědní hodnotu poměr izoforem receptoru – PgRA a PgRB. V normální prsní žláze a v terénu hyperplazie bez atypií je zastoupení obou forem rovnocenné. Časně v průběhu vývoje léze s potenciálem přeměny v malignitu se však poměr mění ve prospěch PgRA. Tento nález je podpořen i in vitro studiemi, které popisují vliv PgRA na morfologii buňky a její adhezi. Zajímavé také je, že v normální prsní žláze u nosiček mutací v genech BRCA1/2 exprese PgRB chybí.

C-erbB-2 (Her-2/neu)

Gen Her-2/neu je lokalizován na dlouhém raménku 17. chromozomu. Jeho produktem je protein označovaný jako c-erbB-2, který patří do rodiny receptorů růstových faktorů s tyrozin kinázovou aktivitou. Exprese c-erbB-2 je známým prognostickým faktorem u invazivního karcinomu prsu a tento protein je zároveň cílem biologické léčby monoklonální protilátkou trastuzumabem. Pomocí fluorescenční hybridizace in situ (FISH) byla prokázána amplifikace genu Her-2/neu již v ložiscích atypické duktální hyperplazie. Úroveň amplifikace zřejmě ukazuje na pravděpodobnost vývoje léze v invazivní karcinom. U LCIS je při vyšetření exprese c-erbB-2 pozitivní dokonce čtvrtina nádorů bez ohledu na přítomnost invazivní komponenty.

Někteří autoři nacházejí u DCIS dokonce vyšší pozitivitu c-erbB-2 než u invazivního duktálního karcinomu. Vysvětlují to tím, že c-erbB-2 je zřejmě důležitý pro iniciaci maligní transformace, spíše než pro progresi nádoru. C-erbB-2 podléhá tedy pravděpodobně downregulaci v průběhu progrese nádoru.

p53

Gen p53 je tumorsupresorový gen lokalizovaný na krátkém raménku 17. chromozomu. Protein p53 je důležitým hráčem v regulaci buněčného cyklu a apoptózy. Mutace genu p53 jsou nacházeny téměř ve všech solidních nádorech, předpokládá se, že tato alterace se odehrává časně v procesu kancerogeneze.

V terénu hyperplazie bez atypií nebyly dosud mutace genu p53 popsány. U atypické duktální hyperplazie se již podle recentních prací využívajících mikrodisekci tkání objevují. U LCIS jsou přítomny ve 20 % lézí. Jejich podíl se dále ještě zvyšuje u DCIS, zvláště u komedo typu. Klinický význam alterace tohoto genu však stále zůstává nejistý. Zřejmě, jako u jiných nádorů, nebude u neinvazivních ani invazivních nádorů prsu nezávislým prognostickým nebo prediktivním faktorem, ale klíčové bude spojení jeho inaktivace s inaktivací dalších proapoptotických, nebo naopak aktivací antiapoptotických proteinů ležící dále v cestách spouštěných proteinem p53.

Ki-67

Ki-67 je jaderný protein podílející se na regulaci buněčného cyklu. S výjimkou G0 a časné G1 fáze je exprimován prakticky v celém průběhu buněčného cyklu. Diagnosticky reaguje s protilátkou MIB-1 a je někdy tak i označován. Jeho stanovení se využívá k určení tzv. proliferačního indexu, tedy stanovení „intenzity“ buněčného dělení.

Ve spojení s parametry apoptózy a regulace buněčného cyklu (Bcl-2, p53) může být významným predikátorem rizika maligní transformace. Nízká exprese Ki-67, pozitivita Bcl-2 a negativita p53 (tedy „příznivé“ znaky) jsou typické pro ADH a dobře diferencovaný invazivní karcinom. Vysoká exprese Ki-67 a negativita Bcl-2 v lobulech ukazují na potenciál rozvoje premaligní léze v málo diferencovaný invazivní karcinom. Zvýšená exprese Ki-67 a zároveň i ERα upozorňuje u hyperplazie bez atypií na potenciál vývoje invazivního karcinomu.

Bcl-2

Gen Bcl-2 je lokalizován na dlouhém raménku 18. chromozomu. Jeho proteinový produkt je negativním regulátorem apoptózy a patří do rodiny faktorů regulujících (pozitivně i negativně) apoptózu. Právě deregulace apoptózy je významným bodem při vývoji maligní léze z premaligní. Zvýšená exprese Bcl-2 spolu s inaktivací p53 je ukazatelem poruchy spouštění apoptózy a je nalézána v různé míře u všech preinvazivních i invazivních lézí prsu.

Vascular endothelial growth factor (VEGF)

VEGF je potentní angiogenní růstový faktor. Hraje důležitou úlohu v tumorem indukované angiogenezi. Některé polymorfismy genu pro VEGF jsou dokonce v určitých populacích spojeny se zvýšením rizika pro vznik karcinomu prsu. Receptor tohoto růstového faktoru je cílem biologické léčby pomocí monoklonální protilátky bevacizumabu.

Zvýšená vaskularizace je pozorována u všech premaligních lézí prsu, její intenzita jak u duktálních, tak u lobulárních lézí roste s jejich závažností. Hladina VEGF koreluje s mírou vaskularizace. Podle některých autorů by tak VEGF mohl být predikátorem biologického chování DCIS, mohl by umožnit identifikovat agresivnější podtypy nádoru. Zajímavé také je, že v případě DCIS není exprese VEGF regulována cestou Her-2/neu, jako u lézí invazivních.

E-kadherin

Tumorsupresorový gen e-kadherin je lokalizován na dlouhém raménku 17. chromozomu. Je spojován především s patogenezí lobulárního karcinomu, analýza jeho inaktivace tak může pomáhat při rozhodování o histotypu nádoru ve sporných případech. Tento gen není inaktivován v terénu atypické lobulární hyperplazie (ALH), jeho funkce je však narušena již u lobulárního carcinoma in situ (LCIS). To ukazuje na inaktivaci genu pro e-kadherin časně v procesu karcinogeneze, a zřejmě specificky v cestě vedoucí k rozvoji LCIS, avšak bez přítomnosti ALH.

Sporadické zprávy jsou i o alteraci genu pro e-kadherin u duktálních preinvazivních lézí. U DCIS byla pozorována hypermetylace promotorové sekvence (která vede ke snížení exprese). Mutační analýza tohoto genu ukazuje také na skutečnost, že porucha kódující sekvence může predikovat rozvoj invazivního duktálního karcinomu v terénu DCIS, pouze však u subtypu, kde je zároveň přítomna i složka LCIS (lze tedy předpokládat homogenní společný molekulárně genetický proces u léze jevící se morfologicky heterogenní).

BRCA1 a BRCA2

Oba tyto geny jsou tumorsupresory, jejichž proteinové produkty se účastní kontroly buněčného cyklu a procesů reparace poškozené DNA. Dědičné (hereditární) mutace těchto genů jsou odpovědné za syndrom hereditárního karcinomu prsu (HBC – hereditary breast cancer syndrome) a syndrom hereditárního karcinomu prsu a vaječníků (HBOC - hereditary breast/ovarian cancer syndrome). U nosiček mutace genu BRCA1 dosahuje celoživotně riziko onemocnění invazivním karcinomem prsu až 87 %, riziko onemocnění karcinomem vaječníků se pohybuje mezi 40-60 %. Pro dědičné mutace genu BRCA2 je riziko karcinomu prsu stejné, riziko karcinomu vaječníků je nižší, celoživotně na úrovni asi 23 %.

Prevalence hereditárních mutací genů BRCA1 a BRCA2 se v populaci pacientek s DCIS a LCIS pohybuje mezi 4–6 %, tj. na dolní hranici rozmezí odhadovaného pro ženy s invazivním karcinomem (5–8 %). U žen s mutací se DCIS vyskytuje stejně jako invazivní karcinom v signifikantně nižším věku, než v normální populaci (o 10–15 let dříve). Výskyt preinvazivních lézí byl však téměř výlučně pozorován v rodinách s výskytem hereditárního karcinomu prsu. V rodinách, kde se vyskytovaly obě dominantní malignity syndromu hereditárního karcinomu prsu a vaječníků, nebylo zaznamenáno statisticky signifikantní zvýšení výskytu DCIS nebo LCIS.

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE DCIS A INVAZIVNÍHO KARCINOMU PRSU

Klíč k definici a rozeznání jednotlivých skupin DCIS a invazivního karcinomu, které budou mít odlišný vliv na prognózu pacientek a které by také měly být řešeny odlišným způsoben, není skryt v morfologii, ale v genomu, regulaci genové exprese a signálně transdukčních procesech v konkrétní nádorové buňce.

Diverzita nádorových populací

I když předpokládáme, že DCIS je přímým předstupněm (alespoň ve většině případů) invazivního karcinomu, nemáme pro to dosud žádná přesvědčivá empirická ani experimentální data dokumentující celou cestu lineární progrese od normálního epitelu (event. kmenové buňky) k invazivnímu karcinomu. To je příčinou vzniku modelů, které považují DCIS za možný, ale nikoliv obligátní prekurzor invazivního karcinomu, a předpokládají, že „čistý“ DCIS a DCIS s potenciálem rozvoje invazivního nádoru jsou geneticky odlišné jednotky (tedy liší se genetickými změnami na úrovni somatické buňky). Přechod DCIS v invazivní karcinom je pak možný ne jednou cestou preferenční, ale několika cestami (což prakticky znemožňuje popis „lineárního“ modelu). Další autoři zároveň předpokládají, že ve většině případů je low-grade DCIS spojen s low-grade invazivním karcinomem a high-grade DCIS s high-grade karcinomem – tj. tzv. horizontální progrese. Nádory označované jako intermediate-grade tvoří heterogenní skupinu, v níž je pozorován vývoj v oba typy invazivního karcinomu.

Perou a Sorlieová popsaly na základě studia exprese sad několika set genů ve vzorcích histologicky odlišných invazivních karcinomů, DCIS a normální prsní tkáně pět základních typů invazivního karcinomu.

• basal-like (vycházející z tzv. bazálních buněk epitelu),
• luminal A (vycházející z lumbálních buněk, s vysokou pozitivitou ER),
• luminal B (vycházející z lumbálních buněk, s nižší pozitivitou ER),
• Her2^poz./ER^neg.,
• normal breast-like.

Takto lze tedy popsat přeneseně i rozdílné cesty transformace preinvazivní léze v invazivní. Tyto typy se navzájem liší svými expresními vzorci (tzn. že jsou v nich produkovány různé bílkoviny v různých množstvích) a klinicko-biologickým chováním, nejsou definovatelné morfologicky a jejich charakteristický expresní vzorec je patrný již na úrovni DCIS.

V lidské prsní žláze lze rozlišit dva základní typy zralých epiteliálních buněk – buňky bazální (též myoepiteliální) a buňky luminální. Je zřejmé, že kromě této diferencované populace se v minoritní porci v epitelu žlázy nacházejí i bipotentní kmenové a progenitorové buňky. Nejdůležitějším místem prsní žlázy je terminální duktolobulární jednotka, kde je rozložení buněčných subpopulací charakteristické a kde také dochází k transformaci buněk nejčastěji. Bazální buňky je možné v preparátu obravit protilátkami proti cytokeratinům 5/6, luminální buňky protilátkami proti cytokeratinům 8/18.

Odlišné výchozí buňky (nádorové „kmenové“ buňky) a odlišné, pro jednotlivé subtypy nádorů specifické, genetické a epigenetické změny jsou příčinou a vysvětlením diverzity biologického chování preinvazivních a invazivních nádorů prsu. Tyto subtypy tedy mají na základě získaných genetických a epigenetických změn (které však vznikají v prostředí určitým způsobem v buňce nastaveném – a odlišném pro různé výchozí, tedy nádorové „kmenové“ buňky) odlišnou prognózu a různě reagují na jednotlivé léčebné modality.

Nádory vykazující příbuzný expresní profil s bazálními buňkami epitelu jsou označovány jako basal-like (podobné bazálnímu epitelu). Je pro ně typická exprese keratinů 5 a 17, integrinu a lamininu. Jsou typicky receptorově (ER i PgR) a Her2 negativní. Tyto nádory mají nejhorší prognózu.

Svébytnou skupinu tvoří nádory s výraznou pozitivitou Her2. Kromě negativity estrogenových receptorů a nízké exprese genů kaskády ER je u nich některými autory popisována také přítomnost amplifikace významných a „silných“ buněčných onkogenů fos a jun, což by mohlo vysvětlovat jejich nepříznivé biologické chování. Ačkoliv sdílí s bazálním typem karcinomu stejnou charakteristiku – negativitu ER – jejich výchozí, „kmenové“ buňky jsou zřejmě odlišné.

Výše uvedené dva podtypy představují klinicky definovatelnou skupinu estrogen negativních nádorů. Analýza expresního profilu však ukazuje, že tato skupina v sobě skrývá dvě zcela odlišné entity, které by měly být také léčeny odlišným způsobem.

Nádory označované jako luminal (luminální) mají expresní profil blízký luminálním epiteliálním buňkám. Je pro ně typická exprese cytokeratinu 8, a především genů kaskády estrogenového receptoru. Podle recentních prací se tato skupina rozpadá do podskupin A a B (podle některých autorů i C), kde podskupina B má nižší expresi ER a ve srovnání s podskupinou A horší prognózu. Prognóza nádorů luminální skupiny A je ze všech známých typů karcinomu prsu nejlepší.

Poslední skupina je tvořena nádory, které vykazují expresní profil podobný normálním, netransformovaným, buňkách prsní žlázy a benigním lézím prsu. Jejich klonální původ je nejasný.

Mikroprostředí nádoru

Tkáň prsní žlázy není tvořena pouze epitelem. Jsou zde přítomny i buňky dalších tkání (endotel, stroma, B-lymfocyty, T-lymfocyty, makrofágy), které svým parakrinním, epikrinním a kontaktním působením ovlivňují chování a diferenciaci epitelu.

Interakce mezi epitelem a mezenchymem je důležitá pro normální vývoj mléčné žlázy i pro ovlivnění vývoje preinvazivní nebo invazivní léze. In vivo i in vitro studie ukazují, že buňky tvořící spolu s epitelem mikroprostředí mléčné žlázy (myoepitelie, endoteliální buňky, fibroblasty, myofibroblasty, leukocyty) a extracelulární hmota ovlivňují růst, polaritu, dobu života a invazivní růst nádorových buněk. Např. faktory produkované makrofágy hrají významnou úlohu v nádorové angiogenezi a iniciaci metastatického šíření.

Zpětně je také nádorem ovlivňováno jeho okolí. V buňkách obklopujících nádor byly zaznamenány výrazné změny expresních vzorců, genetické klonální změny však byly pozorovány pouze v nádoru samotném. U DCIS je změna exprese v myoepiteliálních buňkách časným ukazatelem potenciální invazivity léze.

VÝZNAM MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PRO MANAGEMENT PREINVAZIVNÍCH LÉZÍ

Cílem molekulárně biologického výzkumu charakteristik preinvazivních lézí prsu je pomocí dostupných laboratorních metod identifikovat konkrétní pacientky, jejichž riziko vývoje invazivního nádoru na základě již zjištěné preinvazivní léze je vysoké, a ovlivnit tak klinické rozhodování. U žen s vysokým rizikem karcinomu pak připadá v úvahu kromě pečlivé dispenzarizace provedení profylaktických operací nebo chemoprofylaxe.

Výtěžnou informaci o potenciálu malignizace preinvazivní léze nelze zřejmě v budoucnu očekávat od jednoho nebo několika málo molekulárních markerů. Bude třeba vždy kombinovat detekci imunohistochemickou a FISH (tedy morfologickou) s analýzou molekulární (LOH, CGH, proteomika) a funkční (expresní profil, microarrays).

V oblasti terapie ukazuje molekulárně biologická analýza nádorů, že spíše než ovlivnění jednotlivých proteinů nebo struktur v buňce, bude efektivnější ovlivňovat jednotlivé kaskády.

Použité zkratky

LOH – loss of heterozygosity

CGH – comparative genomic hybridization

FISH – fluorescent in situ hybridization

DCIS – duktální carcinoma in situ

LCIS – lobulární carcinoma in situ

ADH – atypická duktální hyperplazie

ALH – atypická lobulární hyperplazie

ER – estrogenový receptor

PgR – progesteronový receptor

Práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR NR/8807-3.

MUDr. Michal Zikán, Ph.D.

Gynekologicko-porodnická klinika

1. LF UK a VFN

Apolinářská 18

128 00 Praha 2

e-mail: michal.zikan@lf1.cuni.cz