Vliv endokrinních disruptorů na fertilitu savců

Souhrn

Endokrinní disruptory (ED) jsou látky přítomné jako kontaminanty v životním prostředí a představují toxikologické reprodukční riziko. Dělíme je na xenoestrogeny, chemické látky, které vznikly lidskou činností, a fytoestrogeny, v přírodě se vyskytující látky v rostlinách. Mohou napodobovat nebo interferovat s činností endogenních hormonů. Vliv vybraných polutantů na savčí organizmus (reprodukční orgány, gamety a reprodukci) je možné testovat in vivo (myší model). Xenoestrogeny měly ve vybraných dávkách negativní vliv na in vivo fertilitu a reprodukční orgány. Naproti tomu fytoestrogeny ve vybraných dávkách nevykazovaly negativní vliv na reprodukci savců a jiné sledované parametry.

Klíčová slova:
endokrinní disruptory, váha těla, váha orgánů, stav akrozomu, fertilita

ÚVOD

Aby došlo k úspěšnému oplození, tj. splynutí haploidních gamet opačného pohlaví, kterým vzniká diploidní zygota, jako základ budoucího embrya, je třeba, aby nejen gamety, ale celá řada molekul, které se tohoto děje účastní, a které jsou spojeny s gametami a reprodukčním traktem, byla funkční a bez defektů. V případě, kdy vznikají defekty jak gamet, tak reprodukčních orgánů, dochází k poruchám v oplození a reprodukci.

V mnoha zemích v posledních několika desetiletích v lidské populaci stoupl nárůst testikulárních nádorů [1,2], defektů ve vývoji reprodukčních orgánů [3,4]) a snížila se výrazně kvalita mužského spermiogramu [5,6].

V české republice můžeme v poslední době sice pozorovat zvýšenou porodnost, ale ta odpovídá „silným ročníkům“, které se dostaly do reprodukčního věku, současně narůstá počet párů, které mají problémy s reprodukcí. V evropských zemích 15 % párů v reprodukčním věku má problémy v oblasti reprodukce [6]. Mužský faktor je příčinou neplodnosti ve více jak 40 %. V souvislosti s touto realitou vzniká otázka o příčinách tohoto stavu. Příčiny mohou být různé, např. stres, používání drog, kouření. Kromě toho se snižuje kvalita životního prostředí a ta má rovněž výrazný negativní vliv na reprodukci savců včetně člověka. Fyzikální, chemické a biologické polutanty mohou mít vliv na biologickou funkci organizmu a mohou být příčinou neplodnosti. Mezi potravinové kontaminanty patří tzv. endokrinní disruptory, látky, které mohou napodobovat nebo interferovat s funkcí endogenních hormonů [7,8]. Xenoestrogeny jsou chemické látky vznikající lidskou činností. Patří mezi ně např. diethylstibestrol (DES), který byl jako lék podáván těhotným ženám v létech 1945–71 a měl negativní vliv na fertilitu dospělých synů [4,9-11]. Tato látka byla zakázána a setkáme se s ní pouze v experimentech na zvířecím mo­delu, kde slouží jako pozitivní kontrola k tes­tování vlivu různých látek na reprodukci. Nicméně, celá řada dalších látek je stále v prostředí a její vliv na reprodukci je buď znám, nebo se testuje. Mezi takové látky patří např. bisfenol A (BPA). Jedná se o monomer používaný ve všudypřítomných plastech, polykarbonátech [12] a epoxido­vých pryskyřicích [13]. Monomery a oligo­mery bisfenolu A se mohou uvolňovat během polymerace, tepelnou degradací, autoklávováním apod [12]. Uvolňuje se též z vnitřní vrstvy zeleninových konzerv [14] i z kompozitních zubních výplní [13,15].

Nonylfenol (NP) se používá jako aditi­vum lubrikačních olejů, plastů a byl také nalezen v PVC (polyvinyl chlorid), který se používá např. k balení potravin. Jedná se o poměrně stálou látku, která se hromadí v tucích živých organizmů [16].

Fytoestrogeny jsou přirozené látky a jsou obsaženy v rostlinách, které jsou součástí lidského jídelníčku. Mezi tyto látky patří genistein (GEN), který je hlavní složkou sojových produktů. Epidemiolo­gic­ké studie prokázaly pozitivní vliv příjmu sojových produktů s nízkým výskytem nádorových onemocnění různých orgánů [17,18].

Resveratrol (RES) je součást lidské stravy, byl nalezen ve více jak 300 druzích jedlých rostlin. Ve značném množství je v červeném víně [19,20].

V našich recentních pracích jsme testovali vliv vybraných endokrinních disruptorů na fertilitu myší a na vybrané další parametry (hmotnost zvířat a orgánů, histologický obraz reprodukčních orgánů). Protože poškození reprodukčních orgánů je spojeno s poškozením gamet a o patofyziologii spermií je známo málo, testovali jsme v naší práci proteiny spermie, o kterých víme, že se účastní vazby spermie na zona pellucida vajíčka. Povrchové proteiny jsou důležité pro primární vazbu spermie na vajíčko [21-23] a intraakrozomální proteiny hrají úlohu v sekundární vazbě po akrozomální reakci [24-26].

V našich předchozích pokusech byly monoklonální protilátky proti intra-akrozomálním proteinům použity k detekci kvality lidských spermií a průkazu spermatogenese u mužů s azoospermií [27,28], proto jsme použili monoklonální protilátky k testování kvality spermií u experimentálně navozené patologie.

MATERIÁL A METODY

Experimentální model

V pokusech byly použity outbrední linie myší CD1, které se vyznačují vysokou he­terozygotností (napodobuje tak situaci v lidské populaci) a vysokým počtem mláďat ve vrhu (12–13 na myš). Kontrolní skupina myší nebyla vystavena podání vybraných látek. Studie byla multigene­rační.

Vybrané látky (ED)

Látky byly podávány ve vodě pro přesné určení dávky použité látky. Byly vybrané následující látky v daných koncentracích.

• Xenoestrogeny:

Diethylstilbestrol ((E)-3,4,bis(4hydroxy­fenyl)-3-hexen) - DES, dávka 0,5 µg/váha myši/den, bisfenol A (4,4´-izopropyliden difenol), BPA: (2 ng/váha myši/den a 20 ng/váha myši/den), nonylfenol (para-nonylphenol (4-nonylphenol), (NP): (50 µg/l a 500 µg/l) (obr. 1).

• Fytoestrogeny:

Genistein (4´,5,7-trihydroxy izoflavon, GEN): 2,5 a 25 µg/váha myši/den, resveratrol (3,5,4´- trihydroxystilben, RES) 3 mg/l (obr. 1).

Příprava buněk a tkání

Spermie byly získané z cauda epididymis a tkáně z reprodukčních orgánů po usmr­cení myší. řezy tkání byly připraveny podle odkazů [29,30].

Stav akrozomu

K testování stavu akrozomu byl použit panel monoklonálních protilátek připrave­ných v laboratoři [26,31-33].

Imunohistochemie

Vzorky spermií byly naneseny na podložní sklo, po fixaci a promytí fyziologickým roztokem (PBS) byla přidána monoklonální protilátka (naředěná v PBS, imunoglobulinová koncentrace 20 µg/ml) a vzorky byly 30 min inkubovány. Pro promytí (PBS) byla přidána sekundární protilátka proti myšímu imunoglobulinu značená fluorescein izothicyonatem (FITC) a po další inkubaci (45 min) a promytí byly spermie (200 buněk) hodnoceny ve fluores­cen­čním mikroskopu (Nikon Labophot-2 a fotografovány kamerou (COHU CCD) s pomocí softwaru Lucie [27].

Histologické hodnocení

Rutinně připravené vzorky byly značeny hematoxylin-eozinem a hodnoceny pomocí mikroskopu (viz výše).

Statistická analýza

Statistické rozdíly mezi skupinami byly porovnávány pomocí ANOVA a Newman-Keuls testy.

VÝSLEDKY

Diethylstilbestrol (DES) měl v pokusech na myších dramatický vliv na reprodukci in vivo i na ostatní parametry (váha myší, orgánů). Byla snížena významně kvalita spermií (stav akrozomu) a nalezen snížený počet spermií - ve 2. generaci již byla nale­zena úplná neplodnost.

Bisfenol A (BPA) byl pro ilustraci vybrán jako „ukázkový xenoestrogen“. V poku­sech na myších, kdy byl bisfenol-A (BPA) podáván ve 2 dávkách, byl zjištěn negativní vliv na reprodukci myší. Nižší koncentrace BPA měla vyšší účinek než vyšší dávka (graf 1A). Stav akrozomu myších spermií odpovídal počtu narozených mláďat (graf 2).

Histologický obraz ovarií vykazoval nižší počet folikulů (obr. 2) a poruchy v spermatogenezi (obr. 3). Hodnocení akrozomu pomocí monoklonální protilátky proti akrozomálním proteinům v imuno­fluo­rescenci prokázala snížený počet označených spermií - tedy s porušeným akrozomem (obr. 4).

Další xenoestrogen - nonylfenol-A (NP), měl rovněž negativní vliv na in vivo reprodukci a sledované parametry, jeho negativní účinek byl závislý na použité dávce (graf 1B). Histologický obraz reprodukčních orgánů a stav akrozomu byl srovnatelný s působením BPA.

Naproti tomu studované fytoestrogeny, kam patří genistein a resveratrol, neměli vliv na reprodukci myší ani výrazný vliv na další testované parametry.

Detaily výsledků jsou shrnuty v pracích [34-36].

ZÁVĚR

• Počet narozených mláďat ve vrhu je hlavním indikátorem reprodukčního zdraví.
• Pozitivní kontrola testů – podávání di­ethyl­stilbestrolu (DES) – mělo zásadní vliv na poškození reprodukčních orgánů a spermií, které vedlo k neplodnosti myších samců.
• Počet mláďat po působení bisfenolu A (BPA) byl statisticky snížen s tím, že nižší dávka měla vyšší efekt – výsledky vyka­zu­jí pozorování často pozorovaná v endo­kri­no­logii, nižší dávka hormonů může stimu­lovat, zatímco vyšší má opačný efekt.
• Nízké dávky p-nonylfenolu (NP) negativně ovlivňovaly reprodukční potenciál myší. Odpověď organizmu byla v přímé závislosti k dávce látky a prohlubovala se v dalších generacích.
• Oba xenoestrogeny (BPA, NP) měly vliv na váhu reprodukčních orgánů, jejich morfologii a kvalitu spermií, což se odrazilo ve snížené plodnosti samců.
• Působení fytoestrogenů – genistenu (GEN) a resveratrolu (RES) nevedlo k poškození reprodukčních orgánů a sper­mií myší a to ani v následujících generacích.
• Monoklonální protilátky proti intraakrozomálním proteinům spermie mohou být užitečným nástrojem k testování kvality spermií u experimentálně navozené patologie.
• Vybrané endokrinní disruptory (xenoestrogeny) negativně ovlivňují reprodukci savců a mohou mít dopad i na zhoršení reprodukčních parametrů u lidí.

Autorka děkuje spoluautorům publikací zabývajících se studiem endokrinních disruptorů, jejichž výsledky jsou zde částečně uvedeny a to RNDr. V. Kyselové-Novákové, RNDr. M. Boubelíkovi, (ÚMG AV čR) a MUDr. D. Buckiové (ÚEM AV čR), a dále všem spolupracovníkům Labo­ratoře dia­gnostiky pro reprodukční medicínu Ústavu molekulární genetiky AV čR za aktivní přístup k řešení dané problematiky.

Výsledky byly získané za podpory MŠMT, grant 1M06011 a Výzkumného záměru AVOZ50520514.

doc. RNDr. Jana Pěknicová, CSc.

Laboratoř diagnostiky pro reprodukční medicínu Ústavu molekulární genetiky AV ČR

Vídeňská 1083, 142 20 Praha 4

e-mail: jpeknic@biomed.cas.cz