Vliv biologických lepidel na cévní stěnu v modelu disekce aorty v experimentu

Souhrn

Úvod:
Běžnou součástí operačního řešení disekce hrudní aorty je použití biologických lepidel a jejich aplikace mezi dva listy disekce a do oblasti anastomóz.

Cíl:
V experimentální práci porovnat a vyhodnotit histopatologické změny cévní stěny po depozici tří různých druhů lepidel – GRF, Tissucol, Bioglue, na podkladě kvalitativních a kvantitativních parametrů. Dalším cílem bylo vyhodnotit dynamiku těchto změn v závislosti na době působení biologického lepidla a vyjádřit předpoklad chování cévní stěny v čase přesahujícím dobu experimentu.

Metodika:
Model disekce byl realizován na prasatech stejného pohlaví a věku rozdělených do čtyř skupin. Ve třech skupinách byl k uzávěru uměle vytvořené disekce infrarenální aorty použit vždy jiný druh lepidla. Ve čtvrté skupině bylo falešné lumen uzavřeno pouze přímou suturou, bez použití biologického lepidla. Vzorky disekované aorty byly poté odebrány po 1, 6, 12 měsících a následně histologicky zpracovány.

Výsledky:
Při hodnocení celého souboru kvalitativních a kvantitativních parametrů se největší změny v obrazu hladkého svalu, ostatních mezenchymálních buněk a celkové poruchy struktury stěny ukázaly po použití GRF lepidla. Změny po aplikaci lepidla Bioglue a především lepidla Tissucol se přibližují změnám u skupiny bez použití lepidla.

Závěr:
Na podkladě dosažených výsledků lze vyjádřit hypotézu, že v dlouhodobějším horizontu může častěji docházet k destrukci cévní stěny eventuálně k redisekci, právě u pacientů po aplikaci GRF lepidla.

Klíčová slova:
experiment – biologocká lepidla – disekce aorty – histologické změny

ÚVOD

Disekce hrudní aorty je závažným a život ohrožujícím stavem. Ve většině případů vzniká náhle a zůstává-li neléčena, může vést k masivnímu krvácení s fatálním koncem. Její incidence je přibližně 1/100 000.

Disekce aorty typu A má bez chirurgické léčby velmi špatnou prognózu. Do 48 hodin po příhodě umírá 50 % a do třiceti dnů až 90 % nemocných.

Urgentně se proto přistupuje k chirurgickému řešení, jehož cílem je zabránit dalšímu šíření disekujícího procesu, který v oblasti aortálního kořene způsobuje akutní insuficiencí aortální chlopně, obstrukci koronárních tepen nebo rupturu aorty do perikardu či mediastina. Mortalita i přes současné pokroky v chirurgické technice, perioperační a pooperační péči stále dosahuje 15–30 % [1]. Během operace je postižená aorta odstraněna a nahrazena protézou. Ke zpevnění křehké, prokrvácené aortální stěny a pro podporu hemostázy se kromě jiných podpůrných technik ve většině případů do oblasti anastomóz aplikují biologická lepidla [2]. Nejčastěji se v klinické praxi, včetně našeho pracoviště, používají lepidla GRF, BioGlue a Tissucol.

Gelatin-resorcinol-formaldehyd – GRF (Bard) patří k želatinovým lepidlům, která jsou složena z bovinní želatiny a směsi formaldehydu s glutaraldehydem. Stalo se nejčastěji používaným lepidlem v této indikaci zejména pro své výborné adhezivní a hemostatické vlastnosti.

BioGlue (CryoLife Europa, Ltd.) je biologické lepidlo složené z purifikovaného bovinního sérového albuminu a glutaraldehydu. Bylo vyvinuto jako alternativa GRF lepidla, kde byl formaldehyd plně nahrazen méně toxickým glutaraldehydem.

Tissucol (Baxter AG) je fibrinové lepidlo složené z lyzovaných proteinů lidské plazmy (první komponenta) a dále z lyzovaného trombínu aktivovaného roztokem chloridu vápenatého (druhá komponenta). Svým působením napodobuje základní proces fyziologické koagulace. Je biologicky kompatibilní, rychle absorbovatelný s dobrou adhezivní schopností.

Přestože aplikace biologických lepidel jednoznačně snižuje riziko krvácení a s tím související mortalitu a morbiditu, působení jejich chemických složek vyvolává reakci cévní stěny, která může mít ve svém důsledku negativní vliv na mechanické vlastnosti aorty ve smyslu vzniku aortálního aneuryzmatu a redisekce [3, 4, 5, 6].

Cílem naší experimentální studie bylo porovnat vliv těchto nejčastěji používaných lepidel na cévní stěnu v krátkodobém modelu. 

MATERIÁL A METODA

Model disekce aorty byl realizován na prasatech (n = 24) o hmotnosti 30 kg, stejného pohlaví a věku (3 měsíce).

Příprava, operace i další ustájení experimentálních zvířat bylo pod patronací pracovníků Centra experimentální medicíny (CEM) IKEM. Všechna zvířata dostala péči odpovídající principům humánní medicíny v souladu s European Convention on Animal Care a celý projekt byl schválen Odbornou Komisí na ochranu zvířat proti týrání v IKEM, č.j.: HEM - 300-21.4.05-17164/3, dne 17. 5. 2005.

Chirurgická technika experimentu

K vytvoření aortální disekce byla použita modifikovaná metodika podle Blantona [7]. Přes střední laparotomii jsme pronikli do retroperitonea a vypreparovali přibližně sedmicentimetrový úsek infrarenální aorty. Na přední stěně byla provedena jemná příčná incize skrze tunica adventitia a tunica media k tunica intima, která zůstala neporušena. Pomocí raspatoria jsme vytvořili disekci přibližně 1 cm dlouhou na všechny strany od incize. Následně byly naloženy příčné svorky na aortu nad a pod způsobenou disekci. Protnuta intima aortální stěny a provedena sutura povrchové tunica adventicia. Po sutuře pušteny svorky a do disekce ponechána po dobu 3 minut volně proudit krev. Poté opět naloženy svorky na aortu, odstraněna sutura adventicie, disekce zalepena pomocí některého z lepidel a přešita prolenovým stehem. U kontrolní skupiny byla provedena pouze sutura stěny aorty stehem. Všechna použitá lepidla byla připravena podle manuálu výrobce a k jejich aplikaci pak použita příslušná mísící zařízení.

Experimentální zvířata byla rozdělena do 4 skupin podle druhu aplikovaného lepidla k uzávěru falešného lumen – skupina GRF, Bioglue, Tissucol, Kontrola. Dále na základě časového intervalu odběru bioptických vzorků (disekovaný úsek aorty) byly vytvořeny tři skupiny: 1 – odběr po 1 měsíci; 2 – odběr po 6 měsících; 3 – odběr po 12 měsících.

Histologické zpracování

Každý bioptický vzorek byl po odběru fixován ve formalínu, rozdělen na tři sousedící segmenty (centrální, dva přilehlé) a následně histologicky zpracován podle daných kvalitativních a kvantifikovaných morfologických parametrů.

Každý segment byl zpracován samostatně na parafinový bloček, z něhož byly krájeny řezy o síle 3–5 μm a barveny přehlednými histologickými metodami či imunohistochemicky. Celkem bylo zhotoveno přes 2 200 řezů aortální stěnou. Řezy byly fotografovány po obvodu aorty i v různých jejich vrstvách. Dohromady bylo nasnímáno a analyzováno přes 12 600 mikrofotografií.

Histopatologické parametry popisující reakci cévní stěny na disekci a aplikaci lepidla

1.   Kvalitativní morfologické parametry alterace cévní stěny

• 1.1 klasifikace aterosklerotických změn analogicky odle humánní klasifikace podle Stary [8]
• 1.2 ruptura cévní stěny či přetrvávající disekce
• 1.3 cystická nekróza medie
• 1.4 přítomnost nekrotické tkáně (debris) v okolí aplikace lepidla
• 1.5 uzávěr nepravého lumen
• 1.6 fibroproduktivní změny v adventicii chirurgicky preparovaného úseku břišní aorty.

2.   Kvantifikovatelné morfologické parametry alterace cévní stěny

• 2.1 Průchodnost cévy (poměrné zúžení cévního lumina v místě aplikace lepidla oproti kontrolnímu úseku): poměrný číselný údaj (AFFVL) [%], rovnice 1:

kde estA(arteriosclerosis) byla plocha arteriosklerotické léze na řezu a estA(lumen) byla celková plocha lumina navnitř od lamina elastica interna.

• 2.2 Zánětlivá infiltrace v okolí lepidla byla kvantifikována jako plošný podíl cytoplazmy imunohistochemicky detekovaných neutrofilů, T-lymfocytů a makrofágů v ploše řezu, tj. AA(neutrophils,wall=estA(neutrophils)/estA(wall), AA(T-lymphocytes,wall=estA(T-lymphocytes) /estA(wall), AA(macrophages,wall)=estA(macrophages) /estA(wall).      
• 2.3 Imunohistochemická charakteristika fenotypu hladkých svalových buněk cévní stěny byla hodnocena pomocí exprese aktinu, vimentinu a desminu a vyjádřena jako plošný podíl pozitivity daného filamenta v ploše řezu intimou a medií: A_A(actin)=estA(actin)/estA(intima,media), A_A(desmin)=estA(desmin)/estA(intima,media), A_A (vimentin)=estA(desmin)/estA(intima,media).
• 2.4 Přítomnost vasa vasorum byla kvantifikována jako počet profilů těchto cév Q na jednotku plochy řezu estA(wall) cévní stěnou QA = Q/estA(wall) a dále pomocí funkce popisující relativní pozici těchto profilů v radiálním směru napříč stěnou f=d1/(d1+d2), kde d1 byla vzdálenost profilu cévy od vnějšího okraje adventicie a d2 byla vzdálenost profilu cévy od lumina.
• 2.5 Elastinolýza elastických lamel a vláken v tunica media byla posuzována jakožto plošná hustota (intenzita) profilů [9] elastinu na řezu medií L_A(elasin,media)=estL/estA(media).

Všechna kvantitativní měření a odhady byly prováděny pomocí stereologických metod a programu Ellipse (ViDiTo, Košice, SR). Ke statistickému zpracování dat byl použit software Statistica 8 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA) a v případě statistických testů byly nulové hypotézy zamítány při p < 0,05. 

VÝSLEDKY

Všechny níže prezentované výsledky jsou statisticky významné.

Operace. Přežívání experimentálních skupin

Během operace jsme nezaznamenali žádné komplikace, které by mohly mít vliv na výsledek odebíraných vzorků. Žádné zvíře během operačního výkonu nezemřelo. Všechna zvířata byla usmrcena a bioptické vzorky odebrány v rámci předem stanoveného časového harmonogramu.

Kvalitativní parametry (1.1-1.6)

Celkové hodnocení parametrů podle jednotlivých bodů.

Klasifikace aterosklerotických změn (1.1)

Aterosklerotické léze se vyskytovaly u všech vzorků s aplikací lepidla, v největším rozsahu u centrálních segmentů aorty, a to vyjma několika případů ve všech fázích pokusu. Nejmenší výskyt byl pozorován u skupiny Kontrola a Tissucol. Aterosklerotické léze u skupiny Bioglue a GRF byly častější a stadium onemocnění bylo vyšší (častěji st.II.)

Ruptura cévní stěny, přetrvávající disekce (1.2)

U skupiny Kontrola a u lepidla Tissucol nebyla pozorována vůbec.

U skupiny GRF po 1 měsíci v centrálním segmentu přetrvávala v obou vzorcích, po 6 měsících u žádného vzorku a po 12 měsících opět u jednoho vzorku. Svým kraniokaudálním rozsahem nezasahovala do přilehlých segmentů téže aorty.

U skupiny Bioglue po 1 měsíci byla částečná disekce pozorována v centrálním segmentu a v jednom sousedním segmentu. Po 6 ani po 12 měsících nebyla přetrvávající disekce pozorována.

Cystická nekróza medie (1.3)

U skupiny Kontrola, Bioglue, Tissucol, ani GRF nebyla pozorována.

Přítomnost nekrotické tkáně (debris) v okolí aplikace lepidla (1.4)

U skupiny Kontrola a Tissucol nebyla pozorována.

U skupiny GRF byla pozorována v centrálním segmentu u dvou vzorků po 12 měsících i ve dvou přilehlých segmentech po 12 měsících.

U skupiny BioGlue byla po 1 a 6 měsících vždy u jednoho vzorku v přilehlém segmentu.

Uzávěr nepravého lumen (1.5)

U kontrolní skupiny a u lepidla Tissucol byl uzávěr nepravého lumen kompletní.

U skupiny Bioglue i GRF byl uzávěr po 1 měsíci u jednoho vzorku pravděpodobně nekompletní. Pro četné artefakty nelze tento parametr brát jako zcela spolehlivý. Mikroskopická stavba stěny aorty byla u GRF nejvíce odchýlená od skupiny Kontrola, stěna měla u skupiny GRF na rozdíl od Kontroly i ostatních druhů lepidel nejvíce alterovanou stavbu ve smyslu porušení pravidelné vrstevnaté struktury typické pro elastické tepny.

Fibroproduktivní změny v adventicii preparovaného úseku aorty (1.6)

U skupiny Kontrola a Tissucol byly známky fibroprodukce jen v centrálních segmentech po 1 a 6 měsících.

U skupiny GRF a Bioglue byly změny po 1 měsíci v centrálním i přilehlém segmentu.

Námi zjištěné výsledky jsou pro přehlednost uvedeny v tabulkách (Tab. 1, 2, 3) pro jednotlivé skupiny (1, 2, 3).

Kvantitativní parametry (2.1-2.5)

Popis morfologie cévní stěny pomocí spojitě proměnných kvantitativních parametrů umožnil použít standardních statistických testů. Vzhledem k velkému množství testovatelných hypotéz uvádíme pouze statisticky signifikantní nálezy.

Poměrné zúžení cévního lumen (2.1)

K nejvýraznějšímu relativnímu poklesu plochy volného lumina (částečná obliterace lumina, pokles parametru AFFVL) a k nejvýraznějšímu zesílení neointimy došlo u vzorků po aplikaci GRF.

Zánětlivá infiltrace cévní stěny (2.2)

Leukocytární infiltrace byla u všech typů leukocytů nejvyšší 1 měsíc po aplikaci. Plošný poměr T-lymfocytů (CD3-pozitivní buňky), neutrofilních granulocytů a makrofágů ve stěně aorty byl nejvyšší u vzorků po aplikaci GRF, stejně jako plošné poměry ostatních prokazovaných leukocytů. Tato leukocytární infiltrace nebyla omezena pouze na centrální segment, kde došlo k aplikaci lepidla, ale byla přítomna ve význačné míře minimálně ještě v rozsahu 1 cm kraniálním a 1 cm kaudálním směrem.

Imunohistochemická charakteristika fenotypu hladkých svalových buněk (2.3)

K největšímu poklesu exprese alfa-hladkosvalového aktinu (Graf 1), desminu (Graf 2) i vimentinu (Graf 3) došlo u vzorků po aplikaci GRF. Oproti vzorkům s Bio­glue, Tissucol a vzorkům bez lepidla byla distribuce aktinových mikrofilament komprimována do menších objemů, což odpovídá posunu fenotypu cévní hladké svaloviny od kontraktilního fenotypu k fenotypu syntetickému. Imunohistochemicky hodnotitelný fenotyp svalových buněk a dalších mezenchymálních buněk nejvíce podobný skupině Kontrola byl nalezen u skupiny Tissucol. Oproti tomu největší odchylka v expresi uvedených filament vůči skupině Kontrola byla u skupiny GRF.

Vasa vasorum (2.4), (viz tabulka 4)

• Po 1 měsíci od aplikace lepidla byl parametr QA u centrálních segmentů skupin Tissucol a Bioglue nejvyšší ve střední třetině síly cévní stěny. Ve stejném období byl u skupiny GRF parametr QA nejvyšší ve vnitřní třetině síly stěny.
• Po 6 měsících od aplikace jakéhokoli lepidla byl parametr QA nejvyšší ve střední třetině cévní stěny.
• Na konci 12měsíčního období se četnost a distribuce profilů vasa vasorum v řezu aortální stěnou vracely u lepidel Tissucol a Bioglue ke stavu blízkému kontrolním vzorkům, tj. k maximální četnosti ve vnější (adventi­ciální) třetině síly cévní stěny. U vzorků s GRF bylo i po 12 měsících nejvíce vasa vasorum ve střední třetině síly stěny a jejich počet vztažený na plochu řezu cévou byl ze všech vzorků nejvyšší.
• Celkově byl počet profilů vasa vasorum na jednotku plochy nejvyšší 1 měsíc po operaci. Po 6 měsících došlo k poklesu a po 12 měsících k dalšímu poklesu, a to u všech skupin, ovšem nejpomaleji u skupiny GRF.
• U skupiny Kontrola byl počet profilů vasa vasorum na jednotku plochy řezu QA nejvyšší ve vnější třetině síly cévní stěny, a to ve všech časových fázích experimentu.
• Ve všech časových fázích experimentu byla jak celková celková hodnota QA, tak hodnota QA v jednotlivých třetinách síly stěny nejvyšší u skupiny GRF.

Elastinolýza v tunica media (2.5)

Délka elastinových profilů v ploše řezu jakožto míra elastinolýzy se v závislosti na použití daného lepidla významně nelišila(u skupiny GRF však byla menší nežli u skupin Bioglue a Tissucol). Zajímavé však je, že shodně pro všechna lepidla byla relativně nejbohatší elastinová síť nalezena v období 1 měsíc po operaci, s postupným poklesem v čase a je možno říci, že na konci sledovaného období byla přítomnost elastinu v extracelulární matrix nejnižší (Graf 4). Tento trend byl jednoznačně patrný i u kontrolní skupiny bez lepidla (Graf 5).

Větší význam než střední hodnota tohoto parametru však z mechanického hlediska může mít výskyt takových míst v cévní stěně, kde došlo k lokálnímu vymizení elastinu. Takovýchto míst bylo relativně nejvíce u vzorků po aplikaci GRF, přestože střední hodnota délkové hustoty elastinu zde byla srovnatelná s kontrolou. 

DISKUSE

Při celkovém hodnocení je nutné vyvozovat závěry nikoli pouze z jednotlivých výsledků, ale z celého souboru kvalitativních a kvantitativních parametrů. Žádný z nich sám o sobě totiž nemůže popsat složitou odpověď morfologicky i funkčně komplikované struktury, jakou aortální stěna má. Samotná volba modelu aortální stěny prasete se podle našeho názoru ukázala jako vhodná, protože morfologie stěny aorty člověka a prasete je velmi podobná (podobná síla cévní stěny, počet lamel v tunica media), čímž je umožněno studium obdobných fenoménů u cév obou druhů.

Za nejvýznamnější nález pokládáme fakt, že vzorky ze skupiny GRF vykazovaly:

• nejvýraznější infiltraci leukocyty (zejména makrofágy),
• nejvýraznější změny ve fenotypu svalových a dalších mezenchymálních buněk zodpovědných částečně za tonus cévní stěny,
• nejvýraznější zmnožení vasa vasorum po zákroku, a to zejména ve vnitřních (adluminálních) vrstvách aorty, kde jejich přítomnost činí cévu nejvíce vulnerabilní,
• nejpomalejší normalizaci distribuce vasa vasorum v cévní stěně v čase,
• nejnápadnější poruchu v jinak pravidelně vrstevnatém uspořádání aortální stěny.

Z histopatologického hlediska byly tedy u skupiny GRF pozorovány v řadě parametrů významné odchylky ve srovnání se skupinou Kontrola. Ze vzorků po aplikaci lepidla byly morfologicky skupině Kontrola nejblíže vzorky ze skupiny Tissucol.

Závěry publikovaných experimentálních prací, klinických studií a kasuistik v souvislosti s aplikací GRF, jsou rozporuplné. Některé uzavírají použití GRF jako užitečné, bezpečné, s klinickým důrazem na signifikantní snížení výskytu chirurgických komplikací, zvýšením přežívání pacientů a to bez histologicky verifikované alterace cévní stěny [3]. Práce jiných pracovišť poukazují na výraznou alteraci cévní stěny [5, 6, 10, 11] a klinicky zejména na redisekce aortálního kořene s rekurentní aortální regurgitací po aplikaci GRF (incidence 10–40 %), s nutností reoperace [5, 10, 12]. Ta se zdá být největší komplikací aplikace GRF lepidla. Pozdní klinické komplikace byly zaznamenány v průběhu měsíců až let (5–30 měsíců) s různou četností podle pracoviště (7 %). Tato negativa GRF jsou oprávněně připisována jeho formaldehydové složce. [12, 13].

Rozporuplný názor převládá i v případě užití Bioglue, kde formaldehydová složka je nahrazena méně toxickým glutaraldehydem. Studie prokazují redukci chirurgického krvácení, zlepšení přežívání a to bez alterace cévní stěny, resp. pouze s malou infiltraci zánětlivými buňkami [14, 15, 16, 17]. Jiné práce naopak poukazují na jeho toxicitu, alteraci tkání a existenci pozdních pooperačních komplikací, zejména redisekcí [5, 10, 18].

Studie hodnotící Tissucol neprokázaly jeho toxicitu, mutagenicitu ani imunitní stimulaci. V experimentálních studiích v modelu disekce aorty byla prokázána kompletní resorpce a formace granulační tkáně pokryté endotelem, přičemž byla zachována struktura cévní stěny [19]. Klinické studie neprokázaly jeho toxicitu a ani pozdní komplikace [20]. Chirurgickou nevýhodou je jeho delší příprava před aplikací.

V této experimentální studii byl jasně prokázán negativní vliv GRF na cévní stěnu aorty vycházející z jeho toxicity. Otázkou však nadále zůstává, proč a z jakého důvodu se těší neustálé oblibě v rukách chirurgů. Hlavním důvodem se zdají být jeho výborné adhezivní vlastnosti a zachovalá pružnost (mechanické vlastnosti) po smíchání obou jeho složek. U akutní aortální disekce, která je bezesporu život ohrožující událostí, je právě pevnost tkání a hemostáza tím nejdůležitějším faktorem, který v mnoha případech nakonec rozhoduje o přežití pacienta. U lepidla Bioglue se zdá být hlavním problémem jeho rigidita a tvrdost po provedené aplikaci [18]. Při následné manipulaci s tkáněmi či protézou pak může docházet ke ztrátě adheze a tím i hemostatického působení. O lepidlu Tissucol se dá říci, že by bylo ideálním kandidátem biologického lepidla. U disekcí, kde se setkáváme s arteriálním typem krvácení, ale může docházet k jeho odplavování a s tím související neuspokojivé řešení krvácivých komplikací. Důvodem může být jeho nedostatečná pevnost, pomalejší tuhnutí po smíchání obou složek nebo i působení tkáňových aktivátorů fibrinolýzy a komplementu. 

ZÁVĚR

Uvedené výsledky ukazují, že působení GRF lepidla na cévní stěnu způsobují její největší alteraci. Důsledkem toho může v dlouhodobějším horizontu docházet k destrukci cévní stěny se vznikem aortálního aneuryzmatu, event. redisekcí. Nejmenší odchylky vzorků od skupiny bez použití lepidla (sk. kontrolní) byly pozorovány u lepidla Tissucol. Změny po aplikaci lepidla Bioglue se ve většině parametrech přibližují lepidlu Tissucol.  

MUDr. Tomáš Martinča

IKEM

Vídeňská 1958

140 21  Praha 4

e-mail: tommart@email.cz