Vznik a význam sekvenčních variant mikroRNA v kancerogenezi

Souhrn

Východiska: MikroRNA (miRNA) jsou jednou ze skupin krátkých nekódujících RNA, které na posttranskripční úrovni regulují genovou expresi. Jsou zapojeny do klíčových buněčných procesů a podílejí se na vzniku a progresi mnohých onemocnění. Hladiny miRNA mohou odrážet fyziologický stav organizmů, a proto jsou v rámci bio­markerových studií analyzovány jejich expresní profily. Díky svým vlastnostem se jeví jako slibné dia­gnostické, prognostické a prediktivní bio­markery nádorových onemocnění. Nedávné studie poukazují na existenci sekvenčních variant miRNA, tzv. izomiRs, které se od anotovaných miRNA liší pozměněnou sekvencí v důsledku posttranskripčních modifikací. Tyto izomiRs mohou vykazovat vyšší zastoupení než ně­kte­ré kanonické miRNA. Bližší studium izomiRs odhaluje jejich nenáhodnou distribuci i odlišné bio­logické vlastnosti a poukazuje tak na možný bio­logický význam modifikací sekvence. Přítomnost izomiRs může také zásadně ovlivňovat výsledky bio­markerových studií. V současné době je pozornost zaměřena na jejich možný klinický význam.

Cíl: Cílem této práce je poskytnout přehled současných poznatků o sekvenčních variantách miRNA. V práci jsou popsány mechanizmy vzniku izomiRs a vliv heterogenity v sekvenci na stabilitu, funkci a analýzu miRNA. Prostor je věnován také roli izomiRs v bio­markerových studiích.

Klíčová slova:

izomiRs – mikroRNA – sekvenční varianty – dia­gnostika – bio­markery

Úvod

MikroRNA (miRNA) jsou skupinou krátkých nekódujících RNA, které se podílejí na posttranskripční regulaci genové exprese. Tuto funkci zprostředkovávají díky komplementaritě k nepřekládaným oblastem na 3’ konci mRNA, ke kterým navádějí efektorový komplex zvaný miRISC. Samotný komplex miRISC tvoří kromě miRNA také různé proteiny, z nichž nejvýznamnější jsou argonautové (Ago) proteiny. Regulace se v závislosti na stupni komplementarity může uskutečňovat dvěma mechanizmy, kterými jsou degradace mRNA nebo represe translace. MikroRNA se uplatňují v signálních drahách asociovaných s významnými buněčnými procesy, jakými jsou proliferace, diferenciace či apoptóza [1]. Doposud bylo popsáno 2 654 lidských maturovaných miRNA a sekvence jejich kanonických forem jsou anotovány v databázi miRBase [2]. Deregulace hladin specifických miRNA jsou asociovány s konkrétními onemocněními, a proto jsou expresní profily miRNA v rámci bio­markerových studií analyzovány za účelem bližší charakterizace a molekulární klasifikace nádorů [3], určení prognózy onemocnění [4] nebo predikce odpovědi na konkrétní léčbu [5]. Pokrok v oblasti analýzy miRNA, zejména implementace metod sekvenování nové generace, vedly ke zjištění, že příslušné miRNA nejsou zastoupeny pouze kanonickou formou, ale také dalšími sekvenčními variantami. Tyto sekvenční varianty zvané izomiRs se od kanonických miRNA liší v primární struktuře a vznikají posttranskripčními úpravami nebo nepřesným štěpením v průběhu maturace [6]. Jejich variabilita spočívá obvykle v adici či deleci 1–2 nukleotidů [7]. O významu izomiRs vypovídá jejich relativně vysoké zastoupení, které se liší v závislosti na typu tkáně a vývojovém [8] či fyziologickém stavu dané tkáně [9].

Sekvenční varianty miRNA (izomiRs)

Klasifikace izomiRs zatím není oficiálně sjednocena, avšak autoři prací zabývajících se touto problematikou se shodují v jejich rozdělení na templátové a netemplátové izomiRs. Zatímco u templátových izomiRs dochází ke změně pouze v délce sekvence, v případě netemplátových izomiRs nemusí sekvence dané varianty plně odpovídat sekvenci kódované v genomu. Pro charakterizaci izomiRs je dále zásadní stanovení, zda se variabilní nukleotidy nacházejí na 3’ konci, 5’ konci nebo uvnitř sekvence. Častější je výskyt 3’ variant [10], což je pravděpodobně důsledkem odlišných tlaků na konzervovanost 3’ a 5’ konce. Zachování sekvence 5’ konce souvisí se specifitou dané miRNA, protože se v této oblasti nachází tzv. seed sekvence, která je klíčová pro komplementaritu ke specifické mRNA [11]. Dalším aspektem podílejícím se na vyšší konzervovanosti 5’ konce může být uspořádání a vazba domén Ago proteinů. Zatímco 5’ konec je účinněji chráněn před působením exonukleáz díky pevné vazbě MID domény Ago proteinu, 3’ konec s navázanou PAZ doménou podléhá štěpení exonukleázami snáze [10,12]. Samotné Ago proteiny na 5’ konci navíc preferují konkrétní báze nukleotidů a změna v sekvenci 5’ konce se tak projeví na efektivitě vazby k Ago proteinům a začlenění do miRISC komplexu [12].

Mechanizmy vzniku izomiRs

Pro vznik izomiRs bylo popsáno několik mechanizmů, které probíhají na posttranskripční úrovni. Templátové izomiRs vznikají především nepřesným štěpením prekurzorů miRNA endonukleázami Drosha a Dicer [13,14], které se při kanonické bio­genezi přirozeně podílejí na maturaci miRNA [15,16]. Heterogenita konců miRNA má častěji původ v nepřesném štěpení Dicerem [17]. Štěpení Dicerem je přesné, pouze pokud se ve vzdálenosti dvou nukleotidů od místa štěpení nachází jednořetězcová sekvence tvořící strukturu vlásenky či výdutě. V opačném případě dochází následkem nepřesného štěpení ke vzniku 5’ variant [18]. Heterogenita sekvencí je vysvětlována také přítomností asymetrických strukturních motivů, které obvykle zvětšují rozsah štěpení miRNA [14]. Významnou roli hraje dále dsRNA vazebný protein TRBP, který může měnit místo štěpení Dicerem [19]. IzomiRs vznikají i v průběhu alternativní bio­geneze, která se vyznačuje maturací miRNA nezávisle na štěpení Droshou nebo Dicerem. V tomto případě dochází k nepřesnému zkrácení prostřednictvím neznámé 5’-3’ exonukleázy a RNA exozomu [20] nebo Ago2 proteinu s ribonukleázovou aktivitou [21]. Na vzniku templátových izomiRs se dále podílejí exonukleázy, které štěpí fosfodiesterové vazby nukleových kyselin a zkracují především 3’ konec miRNA [22]. Za vznikem netemplátových izomiRs stojí především nukleotidyltransferázy, které ke 3’ konci připojují nukleotidy s adenylovými či uracilovými bázemi. Doposud byla schopnost modifikovat miRNA popsána u sedmi lidských nukleotidyltransferáz [23]. Další skupinou enzymů podílejících se na vzniku netemplátových izomiRs jsou RNA editační enzymy ADAR a CDAR. Zajišťují především záměnu adeninu za guanin a cytosinu za uracil u prekurzorových i maturovaných miRNA a dávají tak vzniknout tzv. substitučním izomiRs [6,10]. Jednotlivé mechanizmy vzniku izomiRs v průběhu maturace shrnuje obr. 1.

Vliv modifikací na bio­logické vlastnosti miRNA

Konkrétní modifikace v sekvenci miRNA se projevují na jejich bio­logických vlastnostech a ovlivňují i samotný průběh maturace. Záměna nukleotidů způsobená působením editačních enzymů vede ke změně v párovacích vlastnostech a změně struktury prekurzorových miRNA, což může snížit efektivitu zpracování endonukleázami Drosha a Dicer [24,25]. Nukleotidyltransferázy prostřednictvím uridylace mění velikost přesahu 3’ konce, který je klíčový pro rozeznání prekurzoru Dicerem. V závislosti na velikosti uridylovaného přesahu dochází důsledkem této modifikace ke zvýšení či snížení efektivity zpracování prekurzoru [26,27]. Heterogenita 5’ konce může vést ke změně termodynamické stability miRNA duplexu a tím ovlivnit výběr řetězce, který bude začleněn do RISC komplexu [13]. Modifikace se projevují také na distribuci miRNA. Bylo pozorováno, že adenylované miRNA zůstávají uvnitř buňky, a naopak uridylované miRNA jsou ve vyšší míře sekretovány, obvykle formou exozomů [28]. Bylo také pozorováno, že se jednotlivé izoformy dané miRNA liší ve stabilitě. Vysvětlením je skutečnost, že konkrétní sekvenční motivy jednotlivých miRNA jsou jedním z faktorů určujících stabilitu miRNA a jakákoliv sekvenční změna v těchto motivech může ovlivnit jejich stabilitu [29,30]. Významný je pozitivní vliv adenylace, která chrání 3’ konec variant před působením exonukleáz [31]. Uridylace 3’ konců naopak působí jako degradační signál [32]. Heterogenita v sekvenci se projevuje také na funkci miRNA, a to zejména nachází-li se variabilní nukleotid v oblasti 5’ konce a seed sekvence. Závažnost změny v repertoáru cílových mRNA se u 5’ variant liší v závislosti na tom, do jaké míry se u konkrétní interakce s mRNA uplatňuje centrální párování [33], které probíhá mezi 4. a 15. nukleotidem a nahrazuje funkci seed sekvence [34]. Byly pozorovány případy, kdy na změnu v repertoáru měly vliv i modifikace 3’ konce [35]. Přestože izomiRs cílí na odlišné mRNA, často regulují stejné signální dráhy jako jejich kanonické formy [36]. Změny v sekvencích dále ovlivňují volbu vazby k jednomu ze čtyř typů Ago proteinů [37,38], přičemž jednotlivé typy se mohou lišit s ohledem na schopnost ribonukleázové aktivity [39], zastoupení v jednotlivých tkáních [40] a jak studie naznačují, tak i specifitou regulace signálních drah [41].

Analýza izomiRs

Pro studium izomiRs se obvykle využívají stejné přístupy, jaké se uplatňují při analýze kanonických miRNA. Mezi běžně používané metody patří kvantitativní PCR (qPCR) a dále vysokokapacitní přístupy, jako microarrays a PCR arrays. Všechny zmíněné metody jsou založeny na hybridizaci, vyžadují tedy předchozí znalost cílové sekvence. Použití těchto metod, zejména qPCR, se při analýze izomiRs vyznačuje určitými limitacemi, které jsou dány vysokou vzájemnou podobností sekvencí [42,43]. Pro předejití nepřesným výsledkům zapříčiněným přítomností variant jsou v posledních letech běžně používané metody modifikovány za účelem zvýšení specificity. Např. použití nově vyvíjené modifikace PCR, tzv. dumbbelPCR (dbPCR), slibuje detekci specifických izomiRs. Metoda dbPCR vyžaduje 3’ i 5’ komplementaritu primerů a tím dosahuje vyšší přesnosti a lepšího rozlišení jednotlivých izomiRs než běžné qPCR platformy [44]. Odlišným přístupem je sekvenování nové generace, které umožňuje analyzovat nukleové kyseliny bez předchozí znalosti sekvence. Tento přístup umožňuje detekci všech izoforem a podává tak nejpřesnější informace o zastoupení jednotlivých izomiRs [45].

Pokud je existence izomiRs opomíjena, může vést k chybné interpretaci výsledků studií zaměřených na charakterizaci expresních profilů miRNA [46]. Při bio­informatickém zpracování sekvenačních dat bývají často jednotlivé izoformy přiřazeny pod název jejich kanonické formy, čímž dochází ke ztrátě informací o zastoupení izomiRs [47]. Důsledkem mohou být neúspěšné validace získaných dat [48] a rozdílné výsledky nezávislých studií [42]. Pro validaci sekvenačních dat se obvykle využívá analýza pomocí qPCR. Podobně jako ostatní hybridizační metody, qPCR však bývá navržena pro detekci pouze kanonických miRNA. V těchto případech sice dochází i k detekci sekvenčních variant, avšak s odlišnou efektivitou, a pokud sekvenční změny neumožňují účinnou hybridizaci navržených oligonukleotidů, jsou jejich hladiny podhodnoceny [42,46,49]. Je-li kanonická varianta zastoupena jen minoritně, může dojít až k selhání detekce dané miRNA a v důsledku toho i k neúspěšné validaci [50]. Získání přesnějších informací o zastoupení miRNA již při bio­informatickém zpracování sekvenačních dat nabízí ně­kte­ré z bio­informatických nástrojů, které klasifikaci izomiRs umožňují [51–55], problémem je však chybějící konsenzus týkající se parametrů těchto nástrojů [56].

Klinický význam izomiRs

Díky vysoké četnosti výskytu ně­kte­rých izomiRs se začíná obracet pozornost na jejich zastoupení při identifikaci a validaci potenciálních bio­markerů. Recentní studie ukazují, že analýza specifických izomiRs může o fyziologickém stavu poskytovat přesnější informace než jejich kanonické varianty. Hinton et al při využití NGS přístupu detekovali vedle kanonických variant také izomiRs, které umožňovaly přesnější charakterizaci diferenciace buněk [57]. V případě nádorových onemocnění bylo pozorováno, že v nádorové tkáni může převažovat jiná izomiR, než je tomu u tkáně nenádorové. Toto pozorování vedlo k závěru, že specifické izomiRs mohou představovat vhodnější bio­markery než jejich kanonické formy, a to zejména v případech, kdy jsou kanonické miRNA zastoupeny minoritně [48]. Jednou z příčin rozdílného zastoupení jednotlivých izoforem miRNA mezi tkáněmi může být přítomnost miRNA modifikujících enzymů v těchto tkáních. Popsána byla např. změna hladin nukleotidyltransferáz ve tkáni nádorů prostaty [23] a RNA editačních enzymů u melanomů [58]. Studie Watahikiho et al z roku 2011 byla jednou z prvních prací naznačujících dia­gnostický potenciál izomiRs, jejichž exprese se lišila mezi tkání metastáz a primárních nádorů prostaty na xenograftním myším modelu [59]. Koppers Lalic et al docílili pomocí izomiRs vyšší specifity při neinvazivní detekci karcinomu prostaty z moči. Zatímco validace kanonických variant miR‑21, miR‑375 a miR‑204 pomocí qPCR nepotvrdila dia­gnostický potenciál těchto miRNA, při detekci konkrétních 3’ izomiRs bylo možné rozlišit pacienty od kontrolní skupiny se senzitivitou 72,9 %, specificitou 88 % a AUC 0,866 [48]. Zhang et al identifikovali na základě sekvenačních dat dostupných z databáze TCGA izomiRs, jejichž hladiny byly významně deregulované u invazivního karcinomu prsu. Škála těchto sekvenčních variant příslušné miRNA umožňovala rozlišit nádorovou tkáň od nenádorové za vyšší hodnoty AUC než při využití samostatných kanonických miRNA [60].

Prognostický význam izomiRs je demonstrován na sekvenčních variantách miR-200b. Editovaná varianta miR-200b se liší od kanonické formy schopností podporovat buněčnou invazi a migraci díky snížené schopnosti tlumit expresi genů ZEB1 a ZEB2. Na rozdíl od kanonické miR-200b tato varianta také negativně reguluje nádorový supresor LIFR [61]. Zatímco kanonická forma miR-200b je asociována s delším celkovým přežitím pacientů [62], vyšší hladiny editované miR-200b indikují kratší celkové přežití [61].

Na využití izomiRs při klasifikaci nádorů se zaměřuje práce Telonise et al z roku 2017. Ze studie vyplývá, že na základě přítomnosti či nepřítomnosti 7 466 izomiRs a miRNA (tzv. binárních profilů) v dané tkáni lze efektivně klasifikovat nádory do 32 tříd dle TCGA (The Cancer Genome Atlas) s průměrnou senzitivitou 90 % a mírou falešných objevů (false discovery rate – FDR) 3 %. Autoři dále pozorovali, že vybrané miRNA generovaly sekvenční varianty jen u určitých typů nádorových onemocnění, např. miR-9 byla výrazně zastoupena sekvenčními variantami pouze u low-grade gliomů [63].

Závěr

Prací zaměřujících se na sekvenční varianty miRNA v současné době významně přibývá a ukazuje se, že analýza izomiRs představuje více informativní přístup jak v bio­markerových studiích, tak v pracích zaměřených na studium role miRNA v kancerogenezi. Komplikací stále zůstává volba platformy, která by umožňovala detekci jednotlivých variant se stejnou efektivitou. V této oblasti byl však zaznamenán pokrok a dochází k vývoji nových či modifikovaných metod detekce miRNA a bio­informatických nástrojů. Pro srovnatelnost výsledků studií však bude nutné parametry pro detekci a klasifikaci izomiRs sjednotit.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

The authors declare they have no potential confl icts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do bi omedicínských časopisů.

The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE recommendation for biomedical papers.

prof. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D.

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 Brno

e-mail: on.slaby@gmail.com

Obdrženo/Submitted: 13. 9. 2020

Přijato/Accepted: 18. 9. 2020