Candida glabrata – základná charakteristika, virulencia, terapia a rezistencia

Souhrn

Závažný medicínsky problém v súčasnosti predstavujú mykotické infekcie. Život ohrozujúce stavy, ktoré sú asociované najmä s imunokompromitovanými pacientami, spôsobujú vo veľkej miere zástupcovia z rodu Candida. Najčastejším pôvodcom je kvasinka Candida albicans, v posledných rokoch však dochádza k výraznému posunu k druhu Candida glabrata a ďalším tzv. non-albicans Candida kvasinkám (napr. Candida tropicalis, Candida parapsilosis). S vysokou mortalitou sú asociované invazívne infekcie spôsobované multirezistentnou kvasinkou Candida auris. Medzi kvasinkou C. glabrata a ostatnými pôvodcami kandidóz existuje niekoľko rozdielov v biologických vlastnostiach, ako aj vo faktoroch prispievajúcich k virulencii. Vrodene zvýšená rezistencia voči azolom je, spolu so schopnosťou rýchlo nadobúdať rezistenciu aj voči ostatným skupinám antifungálnych látok, nebezpečnou kombináciou pri zvládaní úspešnej liečby kandidových infekcií. Poznanie faktorov podieľajúcich sa na virulencii a mechanizmov vedúcich k rezistencii patogéna voči antifungálnym látkam môže viesť k lepšiemu zvládaniu kandidových infekcií. Nemenej dôležitým je hľadanie nových cieľových miest pre antifungálnu terapiu. Predložená práca stručne sumarizuje existujúce poznatky, ktoré sa venujú uvedenej problematike.

Klíčová slova:

biofilm – Candida glabrata – antifungálna rezistencia – virulencia – ergosterol

ZÁKLADNÁ CHARAKTERISTIKA

Prvá zdokumentovaná identifikácia druhu C. glabrata pochádza z roku 1917. H.W. Anderson, ktorý identifikoval nový druh huby vo vzorkách ľudskej stolice, udelil kvasinke názov Cryptococcus glabratus [1]. Na základe morfologických a biochemických charakteristík došlo neskôr k zmene názvu na Torulopsis glabrata. Dlhé roky bola C. glabrata známa ako málo nebezpečná komenzálna súčasť ľudského gastrointestinálneho traktu a z klinických vzoriek bola izolovaná len sporadicky. Približne od 80. rokov minulého storočia začal narastať počet infekcií spôsobených druhom C. glabrata. Tvorba hýf bola v minulosti klasifikačným kritériom pre druhy patriace do rodu Candida. Avšak schopnosť kvasinky spôsobovať infekcie, ako aj neprítomnosť pohlavného rozmnožovania, nakoniec viedli k zlúčeniu rodov Candida a Torulopsis a súčasnému pomenovaniu [2]. C. glabrata patrí medzi vreckaté huby (Ascomycota). Rozvoj fylogenetických analýz založených na porovnávaní nukleotidových sekvencií odhalil bližšiu príbuznosť kvasinkyC. glabrata s pekárenskou kvasinkou Saccharomyces cerevisiae ako s kvasinkou C. albicans a jej sesterskými druhmi. V súčasnosti je C. glabrata súčasťou tzv. kladu Nakaseomyces, ktorý patrí do pododdelenia Saccharomycotina [3]. Mnohé bežné patogény z rodu Candida (C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis) patria do tzv. CTG kladu. Kodón CUG v ich prípade kóduje aminokyselinu serín. C. glabrata však využíva štandardný genetický kód a kodón CUG kóduje aminokyselinu leucín [4]. Molekulárne analýzy zaradili kvasinku C. auris do čeľade Metschnikowiaceae, ktorá je blízko príbuzná kladu Clavispora [5]. Fylogenetická skupina Nakaseomyces pozostáva z troch environmentálnych druhov – Candida castellii, Nakaseomyces (Kluyveromyces) delphensis a Nakaseomyces (Kluyveromyces) bacilisporus, ako aj dvoch novo odhalených oportúnnych patogénov Candida nivariensis a Candida bracarensis [6]. Príbuzenské vzťahy medzi jednotlivými kvasinkami ilustruje obr. 1. C. glabrata tvorí súčasť prirodzenej mikroflóry viacerých slizníc. Vyskytuje sa aj v environmentálnych zdrojoch, napr. vo fermentovaných nápojoch a jedlách [7].

C. glabrata sa vyskytuje takmer výlučne v podobe oválnych alebo sférických blastokonídií. Veľkosť jednotlivých buniek je v rozmedzí od 1 do 4 μm. Pri mikroskopickom zobrazení sú bunky v porovnaní s ostatnými častými pôvodcami kandidóz (C. albicans 4–6 μm, C. tropicalis 4–6 μm,parapsilosis 2,5–4 μm) výrazne menšie [8]. Hyfálna forma rastu sa pri kvasinke druhu C. glabrata nevyskytuje. Pseudohýfy tvorí pri nedostatku dusíka, ako aj pri vystavení buniek oxidu uhličitému [9, 10]. Pravé hýfy sú typické pre druhyC. albicans alebo Candida dubliniensis [8]. C. auris netvorí hýfy, avšak niektoré kmene príležitostne tvoria pseudohýfy [11]. Charakteristické veľké pseudohýfy tvorí aj parapsilosis a pseudohýfy možno pozorovať aj u kvasinky C. tropicalis [8].

Bežným kultivačným médiom je Sabouraudov agar alebo YPD (kvasničný autolyzát, peptón, dextróza). Kolónie kvasiniek C. glabrata sú malé, bielej až krémovej farby s lesklým povrchom. Nie sú výrazne odlíšiteľné od kolónií ostatných zástupcov rodu Candida [12]. Kultivácia kvasiniek C. glabrata na CHROMagar^TM Candida médiu je klasickým diagnostickým postupom. Vyrastené kolónie sú ružové až fialové [12].C. albicans tvorí modro- zelené a C. tropicalis tmavomodré kolónie. Kolónie druhu parapsilosis sú biele [8]. Pri kvasinke C. auris pozorujeme ružové alebo béžové kolónie [13].

C. glabrata dokáže reverzibilne vytvárať štyri typy kolónií, ktoré sú farebne odlíšitelné (biele, svetlohnedé, hnedé až tmavohnedé) na YPD médiu s obsahom 1 mM CuSO₄. Popísané fenotypy pozorovali aj vo vzorkách izolovaných od pacientiek trpiacich vaginitídou. Tvorba kolónií rôznej farby sa nazýva fenotypová variabilita (phenotypic switching) a je známa aj u iných druhov kvasiniek [14, 15].

C. glabrata je fakultatívne anaeróbna kvasinka, ktorá dokáže asimilovať len glukózu a trehalózu [16]. KvasinkaC. albicans disponuje schopnosťou metabolizovať omnoho širšie spektrum sacharidov s výnimkou sacharózy. C. tropicalis fermentuje a asimiluje sacharózu a maltózu [8]. C. auris asimiluje najmä glukózu, ale dokáže v menšej miere spracovať aj sacharózu a trehalózu [11]. Komerčne dostupné diagnostické súpravy, ako sú napr. API Candida alebo API20C Aux od výrobcu bioMérieux, využívajú existujúce rozdiely v metabolizme kvasiniek na identifikáciu druhov [6]. C. glabrata je prirodzene auxotrofná na niacín, pyridoxín a tiamín. Auxotrofia a obmedzená schopnosť asimilovať sacharidy je dôsledok straty až 29 génov metabolickej dráhy sacharidov, dusíka, síry a fosfátu [17, 18]. Neschopnosť syntézy viacerých metabolitov je však kompenzovaná možnosťou získavať ich z prostredia hostiteľa [12].

Oportúnne patogénna povaha druhu C. glabrata viedla k názoru, že sa rozmnožuje výlučne nepohlavne, tzv. pučaním [19]. V posledných rokoch však niektorí autori naznačujú, že C. glabrata je schopná pohlavného rozmnožovania. Poukazujú pritom na populačné štúdie, ktoré odhalili u kvasinky C. glabrata existenciu oboch párovacích typov. Genetické analýzy preukázali prítomnosť génov potenciálne zapojených do konjugácie ako aj prepínania párovacích typov. Zdôrazňujú tiež, že genómy niektorých kmeňov nesú náznaky rekombinácie medzi rozdielnymi kmeňmi [20, 21].

Genóm kvasinky C. glabrata je haploidný. C. albicans a viaceré patogénne non-albicans druhy majú diploidný genóm [8]. Referenčný kmeň CBS138 má 12.3 Mb genóm a pozostáva z 13 chromozómov označovaných A–M [22]. Celkovo obsahuje 5 293 otvorených čítacích rámcov (ORF) [21] s priemernou veľkosťou 493 kodónov [17]. Priemerný obsah GC párov je 38,8 % [17]. Druh C. glabrata však vykazuje značnú genomickú plasticitu. Častý je výskyt intra- alebo interchromozomálnych duplikácií. Jednotlivé izoláty sa tiež môžu výrazne líšiť v počte a veľkosti chromozómov [22]. C. glabrata spolu so S. cerevisiae a blízko príbuznými kvasinkami podstúpila pred približne 100 miliónmi rokov tzv. celogenómovú duplikáciu. V ďalšom vývoji však došlo k strate množstva génov [6, 22]. Kvasinky C. glabrata tiež obsahujú kruhový mitochondriálny genóm, ktorý patrí k najmenším (20 kb) medzi askomycétnymi kvasinkami. Obsahuje ORF pre gény kódujúce 3 podjednotky cytochróm c oxidázy (COX1, COX2, COX3), apocytochróm b (COB), tri podjednotky ATP syntázy (ATP6, ATP8, ATP9) a jeden gén kódujúci ribozomálny proteín (VAR1). Mitochondriálny genóm tiež obsahuje 23 génov pre molekuly tRNA, 2 gény pre rRNA a jeden gén, ktorý špecifikuje nekódujúcu RNA [23]. Prirodzený výskyt plazmidov u kvasinky druhu C. glabrata nie je známy [24].

Detailnejšie poznanie primárnej štruktúry DNA kvasinky C. glabrata umožnilo postupné zavedenie citlivých identifikačných a typizačných metód. Mnohé pomáhajú identifikovať druhy až na úroveň jednotlivých kmeňov. Správna a rýchla identifikácia je kľúčová pre úspešnú a vhodne zvolenú terapiu predovšetkým v prípade invazívnych kandidóz [25]. Zvlášť citlivé sú metódy založené na polymerázovej reťazovej reakcii (PCR). U kvasinky C. glabrata boli dodnes popísané metódy, ako je real-time PCR [26, 27], multiplex PCR [28, 29], ktorá umožňuje identifikáciu niekoľkých kvasiniek rodu Candida v jednej reakcii a PCR-RFLP (PCR-restriction fragment lenght polymorphism) [29, 30]. Používané primery sú najčastejšie zacielené na ITS (internal transcribed spacer) sekvencie génov ITS1, ITS2 a ITS3 alebo na gény pre ribozomálne RNA [8]. Detailnejšie poznanie genetických rozdielov medzi jednotlivými kmeňmi môžeme získať tzv. genotypizáciou [31]. Multilokusová sekvenčná typizácia (MLST) je založená na sekvenovaní krátkych úsekov (400–600 nt) zvyčajne tzv. housekeeping génov (6–8 lokusov). Podľa primárnej sekvencie lokusu dostáva každá alela určité číslo, ktorých kombináciou vzniká tzv. sekvenčný typ [21]. MLST typizácia sa u kvasinky C. glabrata používa od roku 2003. MLST je najčastejšie zameraná na variácie v sekvenciách 6 lokusov (FKS2, LEU2, NMT1, TRP1, UGP1, URA3) [32]. Získané informácie sa vkladajú do online databázy (dostupná na https://pubmlst.org/organisms/candida-glabrata), čo umožňuje porovnávať získané výsledky jednotlivých laboratórií. MLST typizácia našla uplatnenie pri epidemiologických štúdiách, ako aj štúdiách venujúcich sa antifungálnej rezistencii [21]. Typizácia využívajúca metódu MLP (microsatellite lenght polymorphism) sa u C. glabrata používa od roku 2005. Metóda MLP sleduje rozdiely v tzv. krátkych tandemových repetíciách (mikrosatelity) troch až deviatich lokusov. Mikrosatelity sú niekoľkonásobne opakované sekvencie v genóme s dĺžkou 2 až 6 nukleotidov. Amplifikácia lokusov prebieha pomocou PCR reakcie, pričom jeden z dvojice primerov vždy nesie fluorescenčnú značku. Veľkosť amplikónov určí kapilárna elektroforéza [33]. Použitie rozdielnych fluorescenčných značiek zvyšuje špecificitu reakcie [21]. Obe metódy majú vysokú reprodukovateľnosť a sú užitočným nástrojom pre presnú a spoľahlivú typizáciu izolátov C. glabrata. Metóda MLST je oproti MLP časovo náročnejšia ako aj finančne nákladnejšia [33].

MALDI TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight) je diagnostická metóda s vysokou špecificitou, ktorá dokáže poskytnúť spoľahlivý výsledok v rozsahu niekoľkých minút. Uplatňuje sa pri identifikácii baktérií ako aj húb, vrátane kvasiniek z rodu Candida. V porovnaní s klasickými diagnostickými metódami je výhodou MALDI TOF časová nenáročnosť [34, 35, 36].

MALDI TOF metóda pracuje na princípe merania hmotnosti molekúl vzhľadom k ich náboju. Diagnostika je možná vďaka existencii jedinečných proteínových profilov, ktoré umožňujú identifikáciu až na úrovni jednotlivých druhov. Analogicky k molekulárnym metódam (MLST, MLP) sa získané proteínové profily rôznych mikrobiálnych druhov navzájom odlišujú [34, 35, 37].

Vzorka určená na identifikáciu môže byť kolónia kvasinky narastená na pevnom médiu, v určitých prípadoch sa tiež analyzuje krvná vzorka, moč, mozgovomiechový mok alebo proteínový extrakt. Vzorka sa zmieša s organickou zlúčeninou, tzv. matricou. Ako matrica slúži napr. kyselina α-kyano-4-hydroxyškoricová, kyselina 2,5-dihydrobenzoová alebo kyselina sinapínová. Matrica umožňuje ionizáciu klinického materiálu. Zmes vzorky a matrice sa nanáša na oceľovú platničku, ktorá je po zaschnutí ožarovaná UV žiarením. Ožarovanie prebieha krátku dobu, aby sa predišlo fragmentácii a poškodeniu vzorky. Ožiarenie spôsobí vznik iónov, ktoré následné zaznamenáva detektor prístroja. Vzniknutý signál je analyzovaný pomocou prístrojového softvéra a získaný profil sa porovnáva s dostupnými databázami [34, 35, 37, 38, 39].

CANDIDA GLABRATA AKO OPORTÚNNY PATOGÉN

V posledných desaťročiach došlo k výraznému nárastu fungálnych infekcií. Odhaduje sa, že na komplikácie spojené s fungálnymi infekciami celosvetovo zomrie ročne viac ako jeden milión ľudí [40]. K nepriaznivej situácii výrazným podielom prispievajú invazívne kandidózy, ktoré sú globálne zodpovedné za najmenej 50 000 úmrtí ročne [41]. Rod Candida je spoločné označenie pre 150 druhov rozdielnych kvasiniek. Približne 17 druhov dokáže vyvolať ochorenie u ľudí [42]. Prevládajúcim zástupcom je kvasinka druhu C. albicans. V ostatných rokoch však nastal výrazný posun k tzv. non-albicans druhom (napr. parapsilosis, C. tropicalis, ako ajC. glabrata) [43]. Kandidové infekcie sú treťou najčastejšou príčinou nozokomiálnych infekcií pacientov vyžadujúcich intenzívnu starostlivosť a najčastejšou príčinou fungálnych infekcií spojených s biofilmom [12]. Miera mortality je pri invazívnych kandidózach 45–75% [44].

Oportúnne patogénna kvasinkaC. glabrata je u mnohých imunokompetentných jedincov prirodzenou súčasťou mikroflóry slizníc ústnej dutiny či gastrointestinálneho a urogenitálneho traktu. Narušenie vnútorného prostredia hostiteľa môže byť stimulujúcim faktorom, ktorý vedie k premnoženiu prirodzenej kvasinkovej populácie a rozvoju endoinfekcie. Dôsledkom sú lokálne slizničné infekcie, ale aj život ohrozujúce systémové infekcie. Obzvlášť problematické sú invazívne infekcie pacientov, ktorí trpia rakovinou (predovšetkým hematoonkologickí) alebo AIDS [6, 7, 16]. Zavedenie antiretrovirálnej terapie však spôsobilo zníženie incidencie invazívnych infekcií u HIV pacientov. Vysoko aktívna retrovirálna terapia je asociovaná so zvýšením počtu Th-lymfocytov a znížením vírusovej nálože [45, 46]. Ohrozenú skupinu tvoria aj novorodenci s nízkou pôrodnou hmotnosťou, ľudia vo vysokom veku, pacienti s diabetes mellitus a užívajúci kortikosteroidy alebo transplantovaní jedinci [6, 7, 16]. Spomedzi pacientov s fungálnymi infekciami majú tí s invazívnymi kandidózami vyššiu mieru zastúpenia pridružených zdravotných problémov [46].

Lokálne infekcie sa prejavujú ako orofaryngálna kandidóza (soór) s možnou infekciou priľahlej sliznice pažeráka. Rozvoj orofaryngálnej kandidózy býva prvým prejavom nastupujúcej HIV infekcie [47, 48]. Zavedenie antiretrovirálnej terapie v podobe inhibítorov proteáz malo za následok výrazne zníženie výskytu orofaryngálnej kandidózy medzi HIV pacientami. Aj napriek pokroku v liečbe AIDS ostáva orofaryngálna kandidóza frekventovaným problémom u pacientov so zhoršeným prístupom k antiretrovirálnej terapii. Riziko predstavuje aj objav non-albicans kmeňov, ktoré sú rezistentné voči antifungálnej terapii [48, 49, 50]. Vznik infekcií horného tráviaceho traktu je najčastejší u imunokompromitovaných pacientov, diabetikov a rizikom je aj časté užívanie širokospektrálnych antibiotík. Najčastejším pôvodcom orálnej kandidózy je kvasinkaC. albicans [51]. Lokálnym prejavom infekcie C. glabrata sú tiež infekcie urinárneho traktu a vaginálne infekcie [52]. Najčastejším pôvodcom vulvovaginálnej kandidózy je kvasinka C. albicans. V posledných rokoch dochádza k nárastu vo výskyte infekcií spôsobených druhom C. glabrata. Príčinou môže byť zvýšená expozícia antimykotikám, vrátane voľnopredajných, ktorá viedla k selekcii rezistentných kmeňov. Rizikovými faktormi vulvovaginálnej kandidózy sú tehotenstvo, hormonálne zmeny, diabetes mellitus, imunosupresia, užívanie antibiotík a glukokortikoidov, a tiež genetické predispozície [53].

Podiel kvasinky C. glabrata na infekciách krvného riečiska (kandidémia) predstavuje približne 15 až 29 % [54, 55, 56] spomedzi všetkých zástupcov z rodu Candida. Prevalencia pôvodcov kandidémie vykazuje socio-ekonomickú a verejno-zdravotnú závislosť. V Severnej Amerike a Európe je C. glabrata druhým najčastejším pôvodcom [57, 58] avšak v Ázii alebo Južnej Amerike vystupuje ako tretie, resp. až štvrté najčastejšie sa vyskytujúce etiologické agens [59, 60].

Celosvetový odhad incidencie invazívnych kandidóz je 2–14 prípadov na 100 000 obyvateľov/rok [61]. Najvyšší výskyt invazívnych kandidóz je uvádzaný v Pakistane (21 prípadov na 100 000 obyvateľov/rok) a najnižší v Rakúsku (2 prípady na 100 000 obyvateľov/rok) [62].

V Európe je najčastejšie izolovaná z klinických vzoriek kvasinka C. albicans, po ktorej nasledujú druhy C. glabrata a parapsilosis [63]. V krajinách ako Belgicko alebo Dánsko presahovalo zastúpenie druhuC. glabrata 25 % z vyšetrovaných vzoriek. V Španielsku bola C. glabrata zastúpená len v 13 % prípadov. Častejšie izolované boli druhy C. albicans aparapsilosis [64]. Multicentrická epidemiologická štúdia zameraná na ruských pacientov s invazívnymi kandidózami odhalila, že kvasinka C. albicans bola najčastejšou príčinou (43,2 %). Non-albicans kvasinky boli zastúpené druhmi parapsilosis (20,2 %), C. glabrata (11,5 %) a C. tropicalis (9,6 %). Zvyšné identifikované kvasinky predstavovali minoritne zastúpené druhy [65]. Výsledky získané zo Severnej Ameriky odhalili zmeny v zastúpení pôvodcov invazívnych kandidóz. Medzi rokmi 1992–2011 a 1998–2011 zaznamenali približne 10 % pokles v zastúpení kvasinky C. albicans. Za rovnaké časové obdobie narástol podiel druhu C. glabrata na približne 30 % zo všetkých prípadov invazívnych kandidóz. Tretím najčastejšie izolovaným druhom bola kvasinka parapsilosis [66, 67]. Obdobné trendy v distribúcii jednotlivých pôvodcov kandidových infekcií na území Spojených štátov odhalili niekoľké epidemiologické štúdie [68]. Novší prehľad však odhalil celkový pokles incidencie kandidóz spôsobovaných druhmi C. albicans, C. glabrata a parapsilosis [69]. Epidemiologické prehľady z Južnej Ameriky zistili prevládajúce zastúpenie druhu C. albicans (34–44 %), nasledované druhom parapsilosis (21–27 %) [64]. Prieskum zameraný na ázijsko-pacifickú oblasť ukázal, že kvasinka C. albicans je najčastejším pôvodcom invazívnych kandidóz (41,3 %). Non-albicans kmene boli zastúpené druhmi C. tropicalis (25,4 %), C. glabrata (13,9 %) a parapsilosis (12,1 %) [70]. V Pakistane a Indii má najfrekventovanejšie zastúpenie kvasinka C. tropicalis [64, 70]. Percentuálne zastúpenie pôvodcov invazívnych kandidóz sa v jednotlivých krajinách Blízkeho východu a severnej Afriky odlišuje. Najfrekventovanejšie izolovaným druhom je kvasinka C. albicans. Významné zastúpenie majú aj druhy C. tropicalis parapsilosis, C. glabrata a C. krusei [71].

Z vykonaných epidemiologických štúdií vyplýva, že spomedzi non-albicans druhov má kvasinka C. glabratana jvyššiu prevalenciu v Spojených štátoch, Kanade a severnej Európe. Kvasinka parapsilosis dominuje Latinskej Amerike, južnej Európe a niektorým krajinám Ázie [71, 72].

C. auris bola prvýkrát objavená a popísaná v Japonsku v roku 2009. V priebehu nasledujúceho desaťročia sa rozšírila prakticky celosvetovo. Nálezy kvasinky C. auris pochádzajú z Južnej Kórey, Indie, Pakistanu, Kuvajtu, Izraela, Ománu, Južnej Afriky, Kolumbie, Venezuely, Spojených štátov, Kanady a rôznych štátov Európy [13]. V rámci Európy sa kvasinka C. auris najčastejšie vyskytovala na území Spojeného kráľovstva, ktoré bolo tiež prvou krajinou Európy so zisteným výskytom C. auris [11]. Ďalšie európske krajiny s výskytom kvasinky C. auris sú Španielsko, Nemecko, Švajčiarsko, Belgicko, Rakúsko a Francúzsko [73, 74, 75]. Z mimoeurópskych krajín bol výrazný nárast vo výskyte kandidémie spôsobovanej C. auris pozorovaný v Indii a Južnej Afrike [76, 77].

Incidencia kandidémie je v slovenskej populácii 2,16 prípadov na 100 000 obyvateľov/rok. C. albicans je zodpovedná za 38 % prípadov a zvyšných 62 % predstavujú non-albicans druhy [78]. Údaje z Českej republiky zodpovedajú európskym dátam. Ako najčastejší pôvodcovia invazívnej kandidózy boli identifikované druhy C. albicans, C. glabrata a parapsilosis [79, 80].

Kvasinky sa do krvného riečiska dostávajú najčastejšie po narušení prirodzených obranných bariér kože a slizníc, napr. po chirurgickom výkone, zavedení venózneho katétra alebo poranení. Následkom imunosupresie či dlhodobého a opakovaného užívania širokospektrálnych antibiotík môže dôjsť k premnoženiu prirodzenej kvasinkovej populácie, a invázii kvasiniek do tkaniva a krvného riečiska. Dochádza k diseminovaným infekciám, pri ktorých môže byť napadnutý ktorýkoľvek orgán. V abdominálnej oblasti vzniká absces alebo peritonitída. Invazívne infekcie sa prejavujú aj ako endokarditída, osteomyelitída, infekcia pečene, sleziny, obličiek, pľúc, dokonca aj očí a v ojedinelých, veľmi závažných prípadoch, býva napadnutý aj mozog [81, 82].

FAKTORY VIRULENCIE A INTERAKCIA S HOSTITEĽOM

Patogénne mikroorganizmy disponujú virulenčnými faktormi, ktoré im umožňujú kolonizovať hostiteľa a prenikať do tkanív, ako aj unikať hostiteľskej imunitnej odpovedi. K najdôležitejším virulenčným faktorom rodu Candida patrí schopnosť buniek adherovať a tvoriť biofilm, ako aj produkcia hydrolytických enzýmov, ktoré poškodzujú tkanivo hostiteľa (sekretované aspartylproteázy, fosfolipázy, hemolyzíny). Významným faktorom virulencie je tiež tvorba hýf, ktoré prispievajú k invázii do tkanív [83]. Na rozdiel od druhu C. albicans kvasinka C. glabrata nevylučuje aspartylproteázy a netvorí hýfy [40].

S ohľadom na neprítomnosť uvedených virulenčných faktorov nie je známy presný spôsob prenikania kvasiniek C. glabrata do tkanív a krvného riečiska hostiteľa. Vonkajšie narušenie prirodzených obranných bariér hostiteľa hrá významnú rolu, avšak nevysvetľuje všetky prípady invazívnych infekcií [84]. Uvažuje sa tiež o koinfekcii s kvasinkou C. albicans alebo baktériou Clostridium difficile, ktoré dokážu sprostredkovať inváziu buniek C. glabrata do tkaniva hostiteľa [85, 86]. Najpravdepodobnejší je prienik buniek kvasiniek do tkanív hostieľa sprostredkovaný endocytózou [87].

Hoci C. glabrata neprodukuje sekretované aspartylproteázy, nachádza sa v jej genóme 11 YPS génov, ktoré kódujú aspartylproteázy s glykozylfosfatidylinozitolovou (GPI) kotvou. Nazývané sú yapsíny a riadia mnohé životne dôležité bunkové procesy. Regulujú vnútrobunkové pH a udržujú homeostázu vo vakuolách [88, 89]. Sú spoluzodpovedné za vytváranie a udržiavanie architektúry bunkovej steny, ako aj za tvorbu biofilmu. Zohrávajú úlohu v interakcii s hostiteľskou bunkou potláčaním produkcie prozápalového cytokínu IL-1β [90, 91] a napomáhajú prežívaniu fagocytovaných buniek patogéna [92]. Výskum úlohy yapsínov vo virulencii kvasiniek C. glabrata prebiehal na myšacích modeloch a na vínnych muškách druhu Drosophila melanogaster [90, 91, 93].

Okrem sekretovaných aspartylproteáz produkujú kvasinky rodu Candida aj fosfolipázy, ktoré hydrolyzujú esterové väzby vo fosfolipidoch cytoplazmatickej membrány. Produkcia fosfolipáz nie je u kmeňov C. glabrata jednotná. Výskumy, ktoré sledovali aktivitu hydrolytických enzýmov u patogénnych kandíd, dokázali tvorbu fosfolipáz len u určitých kmeňov C. glabrata [94–98]. V porovnaní s kmeňmi druhu C. albicans je produkcia enzýmu výrazne nižšia. Príspevok fosfolipáz k virulencii kvasiniek C. glabrata preto ostáva diskutabilný [40]. Za účelom získania železa produkujú kvasinky C. glabrata hemolyzíny, ktoré spôsobujú rozpad červených krviniek (hemolýzu) [97].

Adherencia a tvorba biofilmu sú najvýznamejšie virulenčné faktory kvasinky C. glabrata. Povrchové adhezíny zabezpečujú adherenciu na tkanivá a zapájajú sa aj do formovania biofilmu. Biofilm zodpovedá za zvýšenú rezistenciu patogéna voči antifungálnym látkam a výrazným spôsobom sa podpisuje pod komplikovanie liečby katetrizovaných pacientov [7, 99].

Bunky kvasiniek C. glabrata interagujú s epitelovými a endotelovými bunkami, ako aj s bunkami imunitného systému. Detailnejšie informácie ohľadom spôsobu jednotlivých interakcií však stále chýbajú [16].

Väčšina štúdií venovaných hostiteľskej imunitnej odpovedi na kandidovú infekciu sa zameriavala na kvasinku C. albicans. Prvým krokom v sérii imunitných reakcií je rozpoznanie kvasinky na základe prítomnosti PAMP (pathogen-associated molecular patterns). PAMP sú intracelulárne alebo extracelulárne konzervované štruktúry prítomné u patogéna. Za rozpoznávanie PAMP sú zodpovedné PRR (pathogen recognition receptor) receptory imunitných buniek, ktoré spúšťajú kaskádu signalizačných reakcií. Medzi PRR receptory patria Toll-like receptory (TLR), NOD-like receptory (NLR) alebo C-lektínové receptory (CLR) [81, 100, 101]. Komponenty bunkovej steny, chitín, β-glukány, manány a manoproteíny, predstavujú PAMP kvasiniek rozpoznávané imunitnými bunkami hostiteľa [101]. CLR receptory sa podieľajú na rozpoznávaní β-glukánov, ako aj manánov a manoproteínov a predstavujú najdôležitejšiu skupinu receptorov zapojených v imunitnej reakcii voči kandidám [102, 103]. Najviac študovaný β-glukánovy receptor je dektín-1 exprimovaný najmä na monocytoch a makrofágoch [100]. Manány a manoproteíny sú rozpoznávané manózovým receptorom, ktorý je prítomný na povrchu makrofágov [102], a receptorom dektín-2, ktorý je exprimovaný na dendritických bunkách, makrofágoch a neutrofiloch [104]. CLR receptory spúštajú signál pre tvorbu prozápalových cytokínov (napr. IL-17) a reaktívnych foriem kyslíka (ROS) alebo vykonanie fagocytózy [100, 102].

Kľúčovú funkciu v obrane hostiteľa voči patogénnym kandidám majú fagocytujúce bunky ako neutrofily a makrofágy [81, 100]. Makrofágy fagocytujú bunky patogéna, ktoré prenikli do tkaniva. Produkujú tiež prozápalové cytokíny, ktoré atrahujú neutrofily na miesto infekcie. Makrofágy majú esenciálnu úlohu v kontrole diseminovaných fungálnych infekcií [100, 105]. Neutrofily sa dostávajú na miesto infekcie pôsobením chemokínov, ktoré produkujú aktivované epitelové bunky a tkanivové makrofágy. Neutropénia predstavuje rizikový faktor pre rozvoj invazívnej infekcie [100, 106]. Neutrofily vykonávajú svoju antifungálnu aktivitu produkciou ROS alebo pomocou lyzozýmu, laktoferínu, elastázay alebo β-defenzínov [107]. Produkcia ROS je sprostredkovaná pôsobením enzýmov NADPH-oxidáza a myeloperoxidáza. K odpovedi vrodeného imunitného systému na kvasinkovú infekciu prispievajú aj NK (natural killer) bunky [81, 100, 101]. Humorálna imunita v podobe komplementu má pravdepodobne v porovaní s bunkovou imunitou menšiu dôležitosť v obrane hostiteľa voči kandidovým infekciám [108]. Úloha B-lymfocytov a produkcia protilátok v obrane voči kvasinkám rodu Candida nie je stále jasná [100]. Porovnanie pacientov s deficienciami v T-lymfocytoch alebo B-lymfocytoch ukázalo vyššiu mieru prevalencie kandidových infekcií v prvej skupine pacientov. Bunková imunita preto pravdepodobne zohráva významnejšiu úlohu v obrane voči kvasinkovým infekciám z rodu Candida [81]. Th-lymfocyty sú nevyhnutné pre produkciu cytokínov (napr. IL-17, IL-22, IFNγ), ktoré regulujú antifungálnu odpoveď sprostredkovanú makrofágmi a neutrofilmi. Aktivácia Th-lymfocytov je spustená po vystavení fungálneho antigénu na povrchu dendritovej bunky [100, 109, 110]. Pokles Th17 lymfocytov spôsobený infekciou HIV spôsobí nedostatočnú imunitnú odpoveď na sliznici epitelu ústnej dutiny a vyvolá premnoženie a patogénny nástup kvasinky C. albicans [49]. Vrodená imunita je dôležitá pre obranu hostiteľa voči slizničným ako aj systémovým infekciám a adaptívna imunita je zapojená najmä v slizničnej imunite [100].

Makrofágy rozpoznávajú pomocou povrchových CLR receptorov (dektín-1 a dektín-2) polysacharidy prítomné v bunkovej stene kvasiniek C. glabrata, ktoré následne pohltia [104, 111]. Kvasinky druhu C. glabratadokážu prežiť pohltenie makrofágmi a následne sa vnútri fagozómu replikovať [112]. ROS a hydrolytické enzýmy zodpovedajú za deštrukciu fagocytovaného patogéna. Pohltená kvasinka odpovedá na nedostatok glukózy vo vnútri fagozómu zníženou expresiou génov zahrnutých v glykolýze. Zvýšená expresia génov pre β-oxidáciu mastných kyselín, glukoneogenézu a glyoxalátový cyklus presmeruje metabolizmus na využívanie alternatívnych zdrojov uhlíka [90]. C. glabrata však zápasí s nedostatkom glukózy aj v prostredí kolonizovaného hrubého čreva alebo vagíny. Prítomné baktérie rozkladnými procesmi produkujú laktát a acetát, ktoré slúžia pre bunky ako alternatívne zdroje uhlíka. Spektrum neskvasiteľných substrátov využívaných bunkami kvasiniek C. glabrata zahŕňa aj glycerol, etanol a oleát [113]. Fagocytované bunky patogéna aktivujú pochody spojené s autofágiou a pexofágiou, ktoré umožnia využívať zrecyklované komponenty vlastnej bunky. Príslušné zmeny v génovej expresii zabezpečuje remodelácia chromatínu [114, 115]. Centrálnu úlohu v regulácii génov inhibovaných prítomnosťou glukózy zohráva u kvasinky C. glabrata proteín kináza Snf1p [116]. Obranu voči pôsobeniu ROS zaisťujú antioxidačné enzýmy ako kataláza, superoxid dismutáza a peroxidázy závislé na tioredoxíne a glutatióne. Výskumy preukázali, že C. glabrata má vrodene vysokú rezistenciu voči oxidačnému stresu. Reguláciu génov, zapojených do antioxidačných procesov bunky, kontrolujú transkripčné faktory CgYap1p, CgSkn7p, CgMsn2p a CgMsn4p [117–119].

ADHEZÍNY A TVORBA BIOFILMU

Kolonizáciu a tvorbu biofilmu umožňuje adherencia buniek kvasiniek na tkanivo hostiteľa alebo povrch medicínskych nástrojov. Adherenciu kvasiniek zabezpečuje skupina proteínov s GPI-kotvou, ktoré sú prítomné v najvrchnejšej časti bunkovej steny, tzv. adhezíny [99].

Adhezíny kvasinky C. albicans ako aj niekoľkých ďalších druhov non-albicans kvasiniek (C. tropicalis, C. dubliniensis, parapsilosis) patria do rodiny Als proteínov (agglutinin-like sequence) [120]. Najdôležitejšiu rolu vo formovaní biofilmu má adhezín Als3p [121]. Adhezíny z rodiny Hwp proteínov sú taktiež zapojené do tvorby biofilmu u kvasinky C. albicans [122].

U kvasinky C. glabrata je v súčastnosti identifikovaných 67 adhezínov, ktoré klasifikujeme do 7 skupín na základe prítomnosti špecifickej substrát viažúcej domény na N konci proteínu. C koniec adhezínov nesie väzbové miesto pre GPI-kotvu. Oblasť medzi N a C koncom proteínu tvorí doména bohatá na serín a treonín [121, 123].

Najvýznamnejšia a dodnes najviac študovaná skupina adhezínov kvasiniek C. glabrata sú tzv. Epa (epithelial adhesin) proteíny kódované EPA génmi. V závislosti od konkrétneho kmeňa obsahuje genóm kvasiniek C. glabrata od 17 do 23 EPA génov. Lokalizované sú v subtelomerických oblastiach chromozómov [122, 124]. Gén EPA1 bol prvým identifikovaným génom s dokázanou významnou úlohou v adherencii. Deleční mutanti Cgepa1Δ mali v in vitro podmienkach o 95 % zníženú schopnosť adherovať v porovnaní s divým typom kvasiniek C. glabrata [99, 125]. Adhezín Epa1p je na vápniku závislý lektín, ktorý rozpoznáva a viaže sa na glykokonjugáty obsahujúce N-acetyllaktózamín. Epa1p zabezpečuje adhéziu na epitelové bunky a makrofágy [126, 127]. Zvýšenú expresiu génu EPA6 pozorovali počas infekcie urinárneho traktu na myšacom modeli. Zvýšená expresia je pravdepodobne vyvolaná nedostatkom niacínu v prostredí urinárneho traktu. Niacín funguje v bunkách ako prekurzor nikotínamidadeníndinukleotidu (NAD+), ktorý je kofaktorom množstva enzýmov. Znížená tvorba NAD+ v prostredí urinárneho traktu spôsobí inhibíciu histón deacetylázy Sir2p. Výsledkom inhibície Sir2p sú zmeny v expresii určitých génov, medzi ktoré patrí aj gén EPA6. Adhezíny Epa6p a Epa7p zodpovedajú za adherenciu na epitelové aj endotelové bunky. Oba adhezíny rozpoznávajú oligosacharidy, ktoré obsahujú galaktózové zvyšky [128, 129]. Gény EPA1, EPA6 a EPA7 sú najdôležitejšie pre adherenciu kvasiniek C. glabrata [122, 124].

Biofilm je trojrozmerná komplexná štruktúra, ktorú tvoria jednotlivé bunky mikroorganizmov a tzv. extracelulárny matrix (ECM). Mikroorganizmy vytvárajú biofilm na biotických ako aj na abiotických povrchoch. ECM je produkt metabolizmu prítomných kvasiniek a baktérií. Skladá sa z extracelulárnych polymérnych substancí (EPS), ku ktorým patria najmä extracelulárne polysacharidy a proteíny. Súčasťou EPS môžu byť v menšej miere aj nukleové kyseliny a lipidy [121]. Závažným problémom je vznik biofilmu na povrchoch medicínskych nástrojov, ako sú napr. venózne katétre, zubné protézy alebo kĺbové náhrady. Odstránenie biofilmu je neraz veľmi náročné a často zodpovedá za perzistentnú kolonizáciu a vznik invazívnych infekcií. Kvasinkové biofilmy zvyšujú rezistenciu patogénov voči antifungálnym látkam, a predstavujú tak riziko pre pacientov hospitalizovaných v nemocniciach [130]. Štúdiu biofilmu je preto venovaná osobitná pozornosť a v posledných rokoch prebieha intenzívny výskum aj v prípade kvasiniek druhu C. glabrata [99, 121, 124].

Kvasinky C. glabrata často tvoria biofilmy na povrchoch cievnych a urinárnych katétrov, protetických srdcových chlopní a pacemakerov [131]. Kľúčovú úlohu v tvorbe biofilmov majú adhezíny kódované EPA génmi, predovšetkým gén EPA6 [132]. Regulácia EPA génov je komplexná záležitosť, ktorá prebieha za pôsobenia CgYak1p kinázy a remodelácie chromatínu. Represiu EPA génov vyvoláva tzv. silencing subtelomerových oblastí, ktorý vypína expresiu veľkého množstva génov na chromozóme. V súčasnosti poznáme široké spektrum génov, z ktorých sa mnohé pravdepodobne podieľajú na regulácii expresie EPA génov a tým prispievajú k formovaniu biofilmu [99, 133]. Počiatočná fáza tvorby biofilmu vyžaduje taktiež prítomnosť adhezínov z rodiny Awp proteínov [123].

TERAPIA A MECHANIZMY ANTIFUNGÁLNEJ REZISTENCIE

V liečbe infekcií spôsobených kvasinkou C. glabrata sa využívajú antifungálne liečivá bežne aplikované v terapii iných kandidových či fungálnych infekcií. Mechanizmus pôsobenia je fungistatický alebo fungicídny [12]. Spektrum indikovaných antimykotík pozostáva z azolov, echinokandínov, polyénov a 5-fluorocytozínu (flucytozín), ktoré zasahujú rôzne životne dôležité metabolické dráhy kvasinky. Najčastejším cieľovým miestom dostupných antimykotík je biosyntetická dráha ergosterolu, ktorý je kľúčovou molekulou cytoplazmatickej membrány kvasiniek. Skupina antifungálnych látok pôsobiaca na úrovni biosyntézy ergosterolu zahŕňa azoly a polyény, ale aj allylamíny a morfolíny [134, 135].

Zlatý štandard v terapii kandidových infekcií predstavujú azolové antimykotiká, pričom najpoužívanejší v klinickej praxi je flukonazol. Výhodou je nízka cena, bezpečnosť a možnosť perorálneho, ako aj intravenózneho podania [136, 137]. Azoly sú heterocyklické zlúčeniny, ktoré podľa počtu dusíkových atómov v azolovom kruhu tvoria dve skupiny (imidazoly – 2 dusíky, triazoly – 3 dusíky). Medzi imidazoly aplikované v klinickej praxi patria klotrimazol, mikonazol, ketokonazol, ekonazol a tiokonazol. Triazoly zahŕňajú flukonazol, itrakonazol, posakonazol, vorikonazol a isavukonazol [135]. Mechanizmus účinku azolov je fungistatický a spočíva v inhibícii enzýmu lanosterol 14α-demetylázy, produktu génu ERG11, ktorá sa prejaví zastavením tvorby ergosterolu [61]. V prítomonsti azolov dochádza alternatívnou dráhou k tvorbe toxického 14α-metylergosta- 8,24(28)-dienolu, ktorý negatívne vplýva na rast a množenie kvasiniek [138]. K antifungálnej aktivite azolov prispieva aj tvorba ROS v bunkách [139]. Nahromadenie aberantných sterolov a ROS je príčinou fungistatickej povahy azolov. Prítomnosť antifungálnych látok však predstavuje selekčný tlak, ktorý vyvoláva vznik rezistentných kmeňov [140].

Rezistencia voči azolom je dôsledkom viacerých mechanizmov. Bodové mutácie v géne ERG11 vedú k zníženiu afinity azolového antimykotika k enzýmu lanosterol 14α-demetyláza. Za rezistenciu je zodpovedná aj zvýšená expresia génu ERG11 alebo génov kódujúcich tzv. efluxné pumpy. V prvom prípade dochádza k tvorbe väčšieho množstva cieľového enzýmu a zvýšený počet efluxných púmp výrazne znižuje koncentráciu antimykotika v bunke. Zmeny v metabolickej dráhe tvorby ergosterolu taktiež prispievajú k rezistencii voči azolom [134].

Klinicky najvýznamnejším mechanizmom rezistencie voči azolom je u kvasiniek C. glabrata zvýšená expresia efluxných púmp [137]. Efluxné pumpy sú transmembránové proteíny, ktoré podľa zdroja energie potrebnej pre aktivitu rozdeľujeme na ABC (ATP-binding cassette) transportéry (obr. 2) a MFS (major facilitator superfamily) permeázy (obr. 3) [25].

ABC transportéry patria k jednej z najviac zastúpených skupín proteínov v živej prírode. Napriek veľkému množstvu známych ABC transportérov zdieľajú všetky spoločnú základnú štruktúru. Skladajú sa z dvoch šesťčlenných transmembránových domén podieľajúcich sa na prenose substrátu a z dvoch nukleotid viažúcich domén. Nukleotid viažúce domény zodpovedajú za väzbu a hydrolýzu ATP, ktorá generuje energiu zabezpečujúcu transport [141]. Najdôležitejšie ABC transportéry kvasinky druhu C. glabrata kódujú gény CDR1, CDR2 a SNQ2. Podliehajú regulácii transkripčným faktorom Pdr1p, ktorý rozpoznáva gény obsahujúce v promótoroch tzv. PDRE (pleiotropic drug response elements) sekvencie [137].

MFS permeázy využívajú pre transportnú aktivitu energiu protónového gradientu. Pozostávajú z dvoch transmembránových domén zložených z 12 alebo 14 transmembránových segmentov [142]. Vo vybraných klinických izolátoch kvasiniek C. glabrata, ktoré boli rezistentné voči azolom, dochádzalo k zvýšeniu expresie MFS permeázy kódovanej génom QDR2. Expresia génu QDR2 je rovnako kontrolovaná transkripčným faktorom Pdr1p [143]. MFS permeázy Aqr1p, Tpo1_1p a Tpo3p taktiež pravdepodobne prispievajú k rezistencii kvasiniek C. glabrata voči azolom. Expresia príslušných génov bola u rezistentných izolátov vyššia v porovnaní s citlivými izolátmi [144, 145].

Molekulárny mechanizmus rezistencie voči azolom spočíva v tzv. GOF (gain-of-function) mutáciach génu CgPDR1. GOF mutácie sú substitúcie, ktoré pozitívne ovplyvňujú aktivitu transkripčného faktora Pdr1p a vedú ku konštitutívne zvýšenej expresii efluxných púmp [146]. Transkripčný faktor Pdr1p patrí do rodiny proteínov s motívom zinkového prstu Zn2Cys6 [147]. Kvasinky, ktoré nesú mutácie spôsobujúce mitochondriálne dysfunkcie (tzv. petite mutanty), sú in vitro rezistentné voči azolom. V dôsledku poruchy mitochondrií dochádza rovnako k zvýšeniu expresie ABC transportérov [148, 149].

Niekoľko experimentálnych prác poukázalo, že citlivosť, resp. rezistenciu, kvasiniek C. glabrata ovplyvňujú aj ďalšie gény. Delécia génu CgPDR16, ktorý kóduje proteín podieľajúci sa na vnútrobunkovom transporte lipidov, ako aj génu pre hlavný transkripčný regulátor biosyntézy ergosterolu CgUPC2A, viedla k zníženiu citlivosti daných delečných mutantov na sledované azoly [150–152].

Morfolíny a allylamíny slúžia na liečbu povrchových mykóz spôsobovaných dermatofytmi a kvôli nežiadúcim vedľajším účinkom sa na terapiu systémových kandidóz nepoužívajú [153]. Polyény (amfotericín B a odvodené lipidové formulácie, nystatín, natamycín) sú cyklické molekuly tvorené tzv. makrolaktónovým kruhom. Cyklická molekula pozostáva z 25–37 uhlíkov a konjugovaného aminoglykozidu d-mykozamínu. Amfifilný charakter polyénov je dôsledkom -OH skupín viazaných na hydrofilnej strane makrolaktónového kruhu a početných konjugovaných dvojitých väzieb medzi uhlíkmi na strane opačnej (hydrofóbna časť) [154]. Amfotericín B sa aplikuje intravenózne a je určený na liečbu systémovych infekcií, zatiaľ čo natamycín (známy tiež ako pimaricín) a nystatín sú aplikované len lokálne [154]. Polyény majú fungicídnu aktivitu. Mechanizmus účinku spočíva vo fyzickej väzbe polyénov s molekulou ergosterolu. Väzba vyvolá tvorbu pórov v cytoplazmatickej membráne kvasiniek, čo spôsobí vyliatie cytoplazmy a únik katiónov (K+ alebo Na+) von z bunky [155]. Medzi ergosterolom a cholesterolom existuje vysoká podobnosť v štruktúre molekuly. Dôsledkom uvedenej podobnosti je určitá miera väzby amfotericínu B aj s molekulou cholesterolu a nežiadúci nefro- alebo hepatotoxický účinok [154, 156]. Toxický efekt viedol k návrhu nových formulácií amfotericínu B v podobe lipozomálneho amfotericínu B alebo tzv. amfotericín B lipidového komplexu [156]. Výskyt kmeňov rezistených voči polyénom nie je, v porovaní s kmeňmi rezistentnými voči azolom, príliš častý. Znížená citlivosť na polyény je u klinických izolátov druhu C. glabrata dôsledkom bodových mutácií v génoch ERG6 [157–159] alebo ERG2 [159, 160]. Následkom zmien v uvedených génoch bola strata funkcie príslušných enzýmov a zástava tvorby ergosterolu, cieľovej molekuly polyénov. Prejavom na fenotypovej úrovni je zmena v sterolovom zložení cytoplazmatickej membrány dokázaná na základe plynovej chromatografie [159].

Echinokandíny (kaspofungín, anidulafungín a mikafungín) sú liekom prvej voľby pri liečbe systémových kandidóz spôsobených kmeňmi rezistentnými voči azolom. Ide o nové a veľmi účinné antimykotiká zavedené do klinickej praxe v roku 2001 [44, 161]. Po chemickej stránke sú echinokandíny syntetické deriváty lipopeptidov, ktoré prirodzene produkujú určité druhy húb, napr. Aspergillus rugulovalvus alebo Zalerion arboricola [162]. Vysoká molekulová hmotnosť echinokandínov zodpovedá za slabú vstrebateľnosť v GIT, a preto je nutné aplikovať echinokandíny intravenózne [153]. Zasahujú na úrovni enzýmu β-1,3-D-glukán syntáza, čím dochádza k inhibícii syntézy β-1,3-D-glukánu, ktorý je dôležitým štruktúrnym komponentom bunkovej steny kvasiniek. Inhibícia tvorby β-1,3-D-glukánu spôsobí destabilizáciu bunkovej steny a usmrtenie buniek kvasiniek [44]. β-1,3-D-glukán syntáza je membránovo viazaenzým, ktorý patrí do skupiny glukozyltransferáz. Ako substrát využíva UDP-glukózu, ktorú pripája na neredukujúci koniec vznikajúceho glukánového reťazca. Komplex β-1,3-D-glukán syntázy pozostáva z katalytickej a regulačnej podjednotky. Katalytická podjednotka, ktorá predlžuje glukánový reťazec, je kódovaná génmi FKS1 a FKS2. Regulačná podjednotka kódovaná génom RHO má GTP-ázovu aktivitu a reguluje aktivitu FKS 1/2 komplexu. Známy je aj gén FKS3, ktorého funkcia nie je známa [163]. Genóm kvasinky C. glabrata obsahuje homologické sekvencie všetkých troch FKS génov [164]. Rezistenciu voči echinokandínom vyvolávajú bodové mutácie v génoch FKS1 a FKS2, ktoré tvoria katalytickú podjednotku. Dosiaľ popísané bodové mutácie sú lokalizované do tzv. „hot spot“ oblastí v sekvenciách oboch génov. Výsledkom mutácie je znížená afinita antimykotika k enzýmovému komplexu [165, 166].

Antimetabolit 5-fluórocytozín je antimykotikum s dlhou históriou používania. Často je indikovaný pri liečbe závažných kandidových a kryptokokových infekcií [25]. Pri systémových infekciách by sa mal flucytozín podávať v kombinácii s amfotericínom B alebo azolmi. Nutnosť kombinovanej terapie vychádza zo schopnosti kvasiniek rýchlo nadobudnúť rezistenciu voči flucytozínu [153]. Pri lokálnych kandidových infekciách sa môže aplikovať aj samostatne [167]. Do bunky vstupuje flucytozín pomocou membránového transportéra cytozín permeáza. Vo vnútri bunky prebieha konverzia na 5-fluorouracil, ktorý podľa spôsobu metabolického spracovania inhibuje dva rozdielne bunkové procesy. Začlenenie do novovznikajúcej molekuly RNA v podobe 5-fluorouridín monofosfátu vedie k zástave syntézy proteínov. Dôsledkom konverzie 5-fluorouracilu na 5-fluorodeoxyuridín monofosfát je inhibícia enzýmu tymidylát syntáza, ktorá spôsobí zastavenie syntézy DNA. Oba spôsoby spracovania flucytozínu spôsobujú usmrtenie buniek patogéna. Schéma pôsobenia flucytozínu je ilustrovaná na obr. 4 [25, 135]. Bunky nadobúdajú rezistenciu voči flucytozínu mutáciami v génoch, ktoré kódujú enzýmy zodpovedné za transport antimykotika do bunky alebo spracovania antimykotika vnútri bunky [168].

V celosvetovom meradle je odhadom asi 8–20 % kmeňov C. glabrata rezistentných voči azolom [169, 170]. V posledných rokoch narastá rezistencia aj voči echinokandínom, rôzne zdroje uvádzajú rozsah rezistentných kmeňov od 3 % do 15 % [171–173]. Kvasinky druhu C. glabrata pomerne často nadobúdajú tzv. mnohonásobnú rezistenciu (MDR), ktorej prejavom je strata citlivosti k antifungálnym látkam z viacerých skupín. MDR je najčastejšia ako súčasná rezistencia voči azolom a echinokandínom, menej v kombinácii voči azolom a polyénom [44]. Takmer jedna tretina kmeňov rezistentných voči echinokandínom vykazovala rezistenciu aj voči azolom [165].

ANTIFUNGÁLNA REZISTENCIA U VYBRANÝCH ZÁSTUPCOV RODU CANDIDA

Kvasinka C. albicans nadobúda rezistenciu voči azolom niekoľkými spôsobmi. Veľmi častým mechanizmom rezistencie je zvýšená expresia efluxných púmp Cdr1p a Cdr2p (ABC transportéry) ako aj Mdr1p (MFS permeáza) [174]. Príčinou zvýšenej expresie sú GOF mutácie v príslušných transkripčných faktoroch. ABC transportéry reguluje transkripčný faktor Tac1p a MFS permeázy sú pod kontrolou transkripčného faktora Mrr1p. Oba regulátory transkripcie patria k rodine proteínov s motívom zinkového prstu [175]. Zapojenie efluxných púmp v rezistencii voči azolom sa predpokladá aj u non-albicans kmeňov kvasiniek parapsilosis a C. tropicalis [134, 176, 177]. Zmeny v biosyntéze ergosterolu taktiež prispievajú k rezistencii voči azolom. Zvýšenie expresie génu ERG11, vyvolané chromozomálnymi prestavbami [178] alebo mutáciami v transkripčnom faktore Upc2p, je známe u množstva klinických izolátov kvasinky C. albicans [134]. Bodové mutácie génu ERG11 vedúce k zámenám aminokyselín v enzýme lanosterol 14α-demetyláza sú taktiež bežným mechanizmom rezistencie klinických izolátov kvasiniek C. albicans, C. tropicalis a parapsilosis [135, 176]. Kvasinka C. krusei vykazuje vrodene zníženú citlivosť na azoly. Rezistenciu dosahuje zníženou citlivosťou enzýmu lanosterol 14α-demetyláza na azoly, ako aj zvýšením expresie génu ERG11 a génov pre efluxné pumpy Abc1p a Abc2p [135, 179]. Málo frekventovaným mechanizmom rezistencie voči azolom sú mutácie v géne ERG3, ktoré vedú k zmenám v biosyntetickej dráhe ergosterolu. Rezistencia zapríčinená zmenami v géne ERG3 je známa u druhovC. albicans aj parapsilosis [180, 181].

Vznik rezistencie voči polyénom nie je u kandíd veľmi častý. Zapríčiňujú ju mutácie génov ERG6, ERG3 alebo ERG2, ktoré vedú k absencii ergosterolu a zmenám v sterolovom zložení cytoplazmatickej membrány kvasiniek [134, 135].

Spôsob nadobúdania rezistencie voči echinokandínom je medzi kvasinkami z rodu Candida pomerne uniformný. Rezistencia je vyvolaná bodovými mutáciami v „hot spot“ oblastiach génov FKS [176]. V porovaní s kvasinkou C. glabrata je zastúpenie kmeňov rezistentných voči echinokandínom u C. albicans a ostatných non-albicans druhov relatívne nízke [72, 182].

Pod komplikovanie liečby invazívnych kandidových infekcií sa negatívne podpisuje rozšírenie multirezistentnej kvasinky C. auris. Približne 90 % izolátov C. auris je rezistentných voči azolom a 30 % voči amfotericínu B [176]. Vzhľadom na zvýšenú rezistenciu voči daným antimykotikám sa odporúča pri infekcii kvasinkou C. auris podávanie echinokandínov, z ktorých najvyššiu efektivitu vykazuje mikafungín [183]. Nádej v boji s multirezistentnými kmeňmi C. auris predstavuje kombinovaná terapia viacerými antimykotikami [13].

Za rezistenciu voči azolom môžu byť zodpovedné efluxné pumpy [184], mutácie génu ERG11 [185] a duplikácia génu ERG11, ktorá vedie k zvýšenej produkcii enzýmu lanosterol 14α-demetyláza [186]. V rezistencii voči echinokandínom sa predpokladá zapojenie bodových mutácií génu FKS1 [186].

Zvyšujúca sa rezistencia voči antimykotikám, ako aj množstvo pacientov ohrozených závažnými invazívnymi kandidózami spolu s obmedzeným spektrom dostupných antifungálnych látok, sú príčinou neustáleho hľadania nových cieľov pre antifungálnu terapiu [187].

DRÁHA BIOSYNTÉZY ERGOSTEROLU A NOVÉ CIELE ANTIFUNGÁLNEJ TERAPIE

Steroly sú významné a univerzálne prítomné molekuly v cytoplazmatickej membráne eukaryotických buniek. Ovplyvňujú fluiditu a permeabilitu membrány a vplyv majú aj na aktivitu membránovo viazaných proteínov. Hlavným sterolom húb je ergosterol [188]. Steroly tvoria tiež kľúčovú súčasť rigidných a štruktúrovaných oblastí cytoplazmatickej membrány, ktoré sú známe ako lipidové rafty [189]. Metabolická dráha syntézy sterolov je mimoriadne konzervovaná. Celá dráha je rozdelená do troch väčších celkov, ktoré sa nazývajú moduly. Prvý modul zahŕňa kroky vedúce k syntéze mevalonátu, po ktorom nasleduje súbor reakcií, ktoré vytvárajú farnezylpyrofosfát. Jednotlivé kroky oboch dráh pre cholesterol aj ergosterol sú až po krok syntézy lanosterolu spoločné. V poslednom module reakcií vzniká samotný ergosterol [190, 191]. Syntézu ergosterolu, ktorá prebieha len v aeróbnych podmienkach, katalyzuje 25 enzýmov. Enzýmy skvalén monooxygenáza, lanosterol 14α-demetyláza, sterol C-4 metyl oxidáza a sterol C-22 desaturáza vyžadujú pre svoju aktivitu prítomnosť kyslíka [192]. Reguláciu biosyntézy ergosterolu u kvasinky S. cerevisiae zabezpečujú transkripčné faktory, ktoré kódujú gény ECM22 a UPC2. Transkripčné faktory Ecm22p a Upc2p rozpoznávajú v promótorových oblastiach ergosterolových génov tzv. SRE (sterol regulatory element) sekvencie [188, 190]. U kvasinky C. glabrata boli objavené homológy génov pre oba transkripčné regulátory, ktoré nesú pomenovanie CgUPC2A a CgUPC2B. Hlavnú úlohu v regulácii syntézy ergosterolu u druhu C. glabrata má prvý z uvedených génov [150]. V hypoxických podmienkach spúšťa Upc2p expresiu ABC transportérov Aus1p a Pdr11p, ktoré zabezpečia import sterolov z vonkajšieho prostredia do bunky [193]. Prebytočný ergosterol, ktorý pôsobí toxicky, kvasinka ukladá vo forme sterylesterov do lipidových kvapôčok alebo po acetylácii sekretuje von z bunky [190]. Delécia väčšiny génov biosyntetickej dráhy ergosterolu je pre kvasinky letálna. Výnimkou sú len tzv. neesenciálne gény (ERG28, ERG6, ERG2, ERG3, ERG5, ERG4), ktoré kódujú enzýmy zapojené v posledných krokoch metabolickej dráhy. Predpokladá sa, že metabolické intermediáty biosyntézy ergosterolu, ktoré vznikajú v záverečných krokoch, sú schopné zastúpiť funkciu ergosterolu v membráne [188]. Enzýmy posledných krokov biosyntetickej dráhy ergosterolu sú unikátne len pre huby, čím sa stávajú potenciálnymi novými cieľmi pre antifungálnu terapiu (Obr.5) [138]. Výsledky experimentálnych prác, ktoré sa venovali nepatogénnym kvasinkám S. cerevisiae a Kluyveromyces lactis naznačili, že sľubným novým cieľom antifungálnej terapie by mohol byť aj produkt génu ERG6. Delécia génu ERG6 viedla u delečných mutantov erg6Δ ku zvýšenej citlivosti na vybrané azoly, ako aj niektoré ďalšie inhibítory rastu [194, 195]. Gén ERG6 kóduje enzým S-adenozylmetionín dependentnú sterol C-24 metyltransferázu. Enzým katalyzuje prenos metylovej skupiny z S-adenozylmetionínu na uhlík C24 čím dochádza k premene zymosterolu na fekosterol (obr. 5) [188, 195].

ZÁVER

C. glabrata je oportúnne patogénna kvasinka, ktorá spôsobuje povrchové, ako aj systémové infekcie. Dôvodom postupne narastajúcej prevalencie druhu C. glabrata je zvýšený počet imunokompromitovaných pacientov a jeho vrodená znížená citlivosť na azoly, ako aj schopnosť rýchlo nadobudnúť rezistenciu voči bežne aplikovaným antimykotikám. Nárast počtu MDR kmeňov kvasinky C. glabrata je alarmujúci a už v súčasnosti je príčinou vysokej mortality pacientov, ktorí vyžadujú intenzívnu starostlivosť. Rezistencia voči antifungálnym zlúčeninám je vážny a mimoriadne aktuálny problém. Spektrum účinných antifungálnych terapeutík pre liečbu kandidových infekcií je v súčasnosti obmedzené na azoly, echinokandíny, polyény a flucytozín. Narastajúca rezistencia nie je problémom len kvasinky C. glabrata. Nedávne objavenie vysokorezistentnej kvasinky C. auris len podčiarkuje vážnosť situácie. Jedným z riešení nepriaznivého stavu je hľadanie nových miest zásahu pre antifungálnu terapiu.

Do redakce došlo dne 5. 2. 2021.

Adresa pro korespondenci:

Mgr. Daniel Eliaš

Ul. Slatinská 78/59

018 61 Beluša

Slovenská republika

e-mail: elias25@uniba.sk