Genetická rozmanitost humánních kmenů Listeria monocytogenes v České republice v letech 2016–2020

Souhrn

Cíl práce: Cílem studie bylo určit genetickou rozmanitost humánních izolátů získaných v letech 2016–2020 z klinických laboratoří z různých lokalit České republiky (ČR) s ohledem na možné epidemické souvislosti a virulenci Listeria monocytogenes za využití dat celogenomového sekvenování.

Metody: Ve studii byl použit soubor 102 humánních izolátů L. monocytogenes, u kterých byl určen sérotyp sklíčkovou aglutinací v kombinaci s multiplex PCR sérotypizací. Retrospektivně bylo provedeno celogenomové sekvenování a na základě získaných dat byla posouzena klonální příbuznost testovaných kmenů a přítomnost genů virulence pomocí softwaru Ridom SeqSphere+.

Výsledky: V období let 2016–2020 bylo celkem charakterizováno 102 humánních izolátů L. monocytogenes, což činí 65 % ze všech hlášených případů listerióz registrovaných ve sledovaném období v ČR v systémech ISIN/EPIDAT. Dominantní zastoupení měl sérotyp 1/2a (57 %), následoval sérotyp 4b (30 %) a jen ojediněle byly detekovány kmeny sérotypu 1/2b (12 %) a 1/2c (1 %). Na základě analýzy celogenomových dat byly kmeny zařazeny k 26 klonálním komplexům a 27 sekvenačním typům. Porovnáním cgMLST (core genome Multi-Locus Sequence Typing) byly detekovány čtyři klastry o více jak třech kmenech vykazující vysokou příbuznost (rozdíly do 10 alel) s možnou epidemickou souvislostí. U všech kmenů byla potvrzena přítomnost klíčových genů virulence. Pouze u tří kmenů (sérotypu 1/2a, 1/2b a 1/2c) byla detekována bodová mutace v genu inlA spojovaná s expresí zkráceného proteinu internalinu A, který je zapojený do mechanismu přestupu L. monocytogenes intestinální bariérou.

Závěr: Molekulární epidemiologie založená na celogenomovém sekvenování představuje účinný nástroj ke studiu populační struktury kmenů L. monocytogenes. V této studii byla zjištěna vysoká heterogenita humánních kmenů L. monocytogenes, zejména u v České republice dominantního sérotypu 1/2a. Bylo identifikováno několik klastrů s možnou epidemickou souvislostí, jejichž výskyt bude dále sledován.

Klíčová slova:

Listeria monocytogenes – listerióza – sérotypizace – celogenomové sekvenování – virulence

ÚVOD

Listerióza je závažné infekční onemocnění s převážně alimentární cestou přenosu. Toto onemocnění vyvolané původcem Listeria monocytogenes obvykle postihuje rizikové skupiny obyvatel, zejména seniory, chronicky nemocné nebo osoby s imunodeficitem, gravidní ženy a novorozence. Invazivní formy onemocnění jsou manifestovány širokým spektrem klinických příznaků např. horečkou, septikémií, meningitidou, meningoencefalitidou nebo encefalitidou. Vzácněji může L. monocytogenes vyvolávat fokální infekce, jako je artritida, endokarditida, endoftalmitida a tvorba abscesů. U gravidních žen se onemocnění projevuje aborty, předčasným porodem nebo smrtí plodu po 20 týdnech těhotenství. U novorozenců do prvního měsíce života vyvolává meningitidu nebo meningoencefalitidu, septikemii, dyspnoe, granulomatosis infantiseptica, otitidu, léze na kůži, sliznicích nebo spojivkách [1].

I když je listerióza poměrně vzácné alimentární onemocnění, je spojována s vyšší smrtností a četností hospitalizací než u jiných gastrointestinálních infekcí bakteriálního původu [2]. Zatímco v posledních pěti letech počet případů listerióz v Evropské unii (EU) mírně vzrostl, v České republice (ČR) lze pozorovat spíše klesající trend. V roce 2019 bylo v zemích EU nahlášeno 2 621 případů listeriózy reprezentující incidenci 0,46 případů na 100 000 obyvatel, 300 osob v důsledku tohoto onemocnění zemřelo. V ČR činila incidence ve stejném období 0,25 případu na 100 000 obyvatel s celkem 27 hlášenými případy. Nejvyšší počet případů byl v EU v roce 2019 hlášen v Estonsku, Islandu, Švédsku a Dánsku (incidence 1,59; 1,12; 1,10; 1,05). Hlášená smrtnost v zemích EU v roce 2019 činila 17,5 %, v ČR činila 18,5 %. Nejvyšší smrtnost v EU uvádí Polsko (56,8 %) [3]. Listeriózy jsou obvykle hlášeny jako sporadické případy, nicméně vzhledem k dlouhé inkubační době, nízké incidenci onemocnění a výskytu geograficky vzdálených případů mohou být menší epidemie listerióz nerozpoznány [2, 4]. V posledních letech bylo zaznamenáno několik rozsáhlých epidemií listerióz. Doposud největší epidemii listeriózy na světě zaznamenala v roce 2017 Jihoafrická republika, odkud se onemocnění šířilo i do okolních států Jižní Afriky. Vehikulem nákazy byl masný výrobek, nakazilo se přes 1 000 osob, z nichž přes 200 zemřelo [5]. Jedna z největších epidemií v EU byla hlášena v roce 2018 v Německu a vehikulem listeriózy byl masný výrobek, který vyvolal onemocnění u 112 osob [2]. Jedna z posledních epidemií v České republice proběhla v období let 2012–2016 v Moravskoslezském kraji, vehikulem nákazy byly krůtí masné výrobky k přímé spotřebě produkované lokálním výrobcem a onemocnělo 26 osob. Genetická analýza kmenů L. monocytogenes získaných od pacientů, ve výrobcích a v prostředí potravinářského podniku potvrdila vysokou podobnost kmenů a také fakt, že kmen L. monocytogenes perzistoval v prostředí potravinářského podniku dlouhodobě, nejméně od roku 2012 [6]. Přenos listeriózy ve zdravotnických zařízeních je vzácný, v ČR byl nozokomiální přenos popsán na gynekologicko- porodnické klinice v Praze v roce 2013 [7].

Při sledování zdrojů a cest šíření listeriových infekcí je nutné kromě epidemiologických metod aplikovat i metody genotypizační. Kmeny L. monocytogenes lze rozdělit do čtyř evolučních linií a 13 sérotypů. Humánní listeriózy v České republice způsobují převážně kmeny sérotypů 1/2a (linie II), 4b a 1/2b (linie I) [8]. Kromě sérotypizace je k typizaci L. monocytogenes možné použít makrorestrikční analýzu s využitím pulzní gelové elektroforézy, která byla do nedávna považována za „zlatý standard“ v typizačních metodách. V posledních letech však dochází k jejímu nahrazování celogenomovým sekvenováním, které umožňuje mnohem precizněji rozlišovat příbuznost původců onemocnění, s velkou přesností identifikovat epidemické klastry a potvrzovat vehikula nákazy [9].

Cílem této studie bylo určit genetickou rozmanitost humánních izolátů získaných v letech 2016–2020 z klinických laboratoří z různých lokalit ČR, zhodnotit možné epidemické souvislosti a virulenci L. monocytogenes za využití dat celogenomového sekvenování.

MATERIÁL A METODY

Ve studii byl použit soubor 102 humánních izolátů L. monocytogenes získaných z klinických laboratoří z různých lokalit České republiky v letech 2016–2020. U všech získaných izolátů byl v reálném čase určen sérotyp sklíčkovou aglutinací s využitím komerčně dostupných antisér (Denka Seiken, Japonsko) v kombinaci s multiplex PCR sérotypizací [10]. Celogenomové sekvenování bylo prováděno retrospektivně. Genomová DNA byla extrahována pomocí kitu Blood and Tissue dle instrukcí výrobce (Qiagen, Německo). Příprava knihoven a samotná sekvenace na platformě Illumina (MiSeq n = 63; NextSeq n = 39) byla provedena externě. Získaná sekvenační data byla asemblována pomocí softwaru Velvet (verze 1.1.04), který je součástí softwaru Ridom SeqSphere+ (verze 6.0.2; Ridom GmbH, Münster, Německo). Klonální příbuznost testovaných kmenů byla porovnána pomocí softwaru Ridom SeqSphere+ na základě cgMLST (core genome Multi-Locus Sequence Typing) s využitím 1 701 cílových alel podle studie Ruppitsch et al. (2015), a pro hodnocení potenciální epidemické souvislosti byl zvolen maximální limit 10 rozdílných alel [11]. Sekvence genů, které jsou klíčové pro virulenci L. monocytogenes (inlA, inlB, prfA, hlyA, actA, plcA, plcB, mpl) byly staženy z webových stránek Institutu Pasteur, Francie [12]. K detekci genů virulence a posouzení přítomnosti bodových mutací vedoucích ke vzniku předčasných stop kodonů (PMSCs – premature stop codons) v těchto genech byl využit software Ridom SeqSphere+ [11].

VÝSLEDKY A DISKUSE

Typizované humánní izoláty L. monocytogenes představovaly 65 % ze všech hlášených případů listerióz registrovaných v systému EPIDAT (do roku 2017) a v systému ISIN (Informační systém infekčních nemocí), který slouží jako náhrada za předchozí systém EPIDAT od začátku roku 2018 [13]. Z celkového počtu 102 testovaných kmenů v 63 případech postihla listerióza muže (62 %) a v 39 případech ženy (38 %). Onemocnění nejvíce zasáhlo pacienty náležící do věkové kategorie 65+ (59 %). Tyto výsledky jsou srovnatelné se studií Gelbíčové et al. [14], která se věnovala charakteristice a diverzitě L. monocytogenes v humánní populaci České republiky v období let 2013–2016. Izoláty zaslané k typizaci nejčastěji pocházely z hemokultur (62 %), likvoru (19 %) a biologického materiálu od gravidních žen a novorozenců (10 %). Ojediněle byly izoláty získány také ze žlučníku, kloubního implantátu či kožního abscesu.

Typizované L. monocytogenes pocházely z 12 krajů (obr. 1). Z krajů Karlovarského a Pardubického nebyly ve sledovaném období zaslány k typizaci žádné kmeny L. monocytogenes, do systému ISIN však byly případy listerióz hlášeny [13]. Nejpočetnější zastoupení (n = 30; 29 %) měly kmeny z Moravskoslezského kraje, kde v roce 2016 ještě dobíhala epidemie vyvolaná po konzumaci krůtích masných výrobků od lokálního výrobce [6], následovaly kraje Olomoucký (n = 13; 13 %) a Plzeňský (n = 13; 13 %). Z kraje Ústeckého a Vysočina bylo zasláno a analyzováno po jednom kmeni.

Sérotypizace je základní metodou při typizaci listerií. V České republice má dominantní zastoupení sérotyp 1/2a nejen u humánních, ale také u potravinových a environmentálních izolátů L. monocytogenes [8]. Zatímco ve většině zahraničních studií je nejčastěji spojován se vznikem onemocnění listeriózou sérotyp 4b [2, 5, 15, 16], největší podíl na vzniku humánních listerióz v České republice měly kmeny sérotypu 1/2a (n = 58; 57 %), následoval sérotyp 4b (n = 31; 30 %) a jen ojediněle i kmeny sérotypu 1/2b (n = 12; 12 %) a 1/2c (n = 1; 1 %). Podobné výsledky byly zjištěny ve studii Gelbíčové et al. (2017) zahrnující kmeny z období let 2013–2016 [14]. Kmeny L. monocytogenes pocházející z roku 2016 byly zahrnuty i v naší studii a na rozdíl od předchozí studie u nich byla pro posouzení diverzity provedena i celogenomová sekvenace. Z výsledků předchozí i této studie vyplývá, že v ČR za posledních 8 let nedošlo v tomto ohledu k významné změně v distribuci sérotypů.

Všechny kmeny L. monocytogenes byly charakterizovány metodou celogenomové sekvenace, byl stanoven klonální komplex (CC), sekvenační typ (ST) a bylo provedeno porovnání podobnosti kmenů na základě cgMLST. Kmeny byly zařazeny k 26 klonálním komplexům (CC) a 27 sekvenačním typům (ST) – tabulka 1. Geografickou distribuci kmenů L. monocytogenes podle sekvenačních typů ve sledovaném období zachycuje obrázek 1. Kmeny sérotypu 1/2a byly zařazeny k 17 klonálním komplexům a 18 sekvenačním typům, z nichž nejvyšší zastoupení (35 %) měly kmeny klonálního komplexu CC8. Devět z těchto kmenů CC8 (ST8) bylo v roce 2016 součástí lokální epidemie v Moravskoslezském kraji [6].

V letech 2014–2019 způsobily kmeny CC8 (ST1247) nadnárodní epidemii listeriózy, která postihla pět států EU: Dánsko (n = 9), Estonsko (n = 6), Finsko (n = 2), Francii (n = 1) a Švédsko (n = 4). Pět případů skončilo fatálně. Vehikulem nákazy byly uzené rybí výrobky [17]. Nejvyšší heterogenita sekvenačních typů byla zaznamenána u sporadicky se vyskytujícího sérotypu 1/2b, kmeny byly zařazeny do čtyř klonálních komplexů a sekvenačních typů. Naopak nejnižší míra heterogenity byla detekována u kmenů sérotypu 4b, které byly zařazeny do čtyř klonálních komplexů a sekvenačních typů s nejvyšším zastoupením kmenů CC2, ST2 (42 %; n = 13) (viz tab. 1). Tento sekvenační typ vyvolal v roce 2015 v Německu epidemii neinvazivní gastroenteritidy způsobené L. monocytogenes u 163 osob (152 dětí a 11 dospělých) po konzumaci rýžového nákypu. Listerióza je definována jako invazivní onemocnění postihující zejména osoby z rizikových skupin, neinvazivní gastroenteritida způsobená L. monocytogenes může postihovat i zdravé jedince a je způsobena konzumací potravin kontaminovaných vysokým počtem L. monocytogenes [16]. Námi testované kmeny CC2 (ST2) byly spojeny výhradně s invazivní formou onemocnění.

Analýza dat celogenomového sekvenování umožňující detailní porovnání klíčových genů L. monocytogenes (cgMLST) prokázala u některých kmenů klonální shodu (obr. 2). Při použití typizačního schématu cg- MLST je hranice pro odlišení epidemicky souvisejících izolátů ≤ 10 alel [11]. Vysoký výskyt kmenů sérotypu 1/2a, CC8 (ST8) ve sledovaném období byl způsoben již zmíněnou epidemií listeriózy v Moravskoslezském kraji [6]. Kromě výše uvedené lokální epidemie s potvrzeným vehikulem infekce byla zjištěna klonální příbuznost (6–10 rozdílných alel) u dalších čtyř kmenů ST8 náležících do jednoho klastru, který se od epidemického klastru kmenů z Moravskoslezského kraje lišil pouze ve 12 alelách (viz obr. 2).

Jeden z těchto kmenů také pocházel z Moravskoslezského kraje, zbylé tři kmeny pocházely z kraje Olomouckého a Královéhradeckého. Dále byly detekovány dva klastry kmenů o více jak třech kmenech s možnou epidemickou souvislostí, u kterých však vehikulum nákazy zatím nebylo odhaleno. Jednalo se o kmeny sérotypu 1/2a CC7 (ST7), u kterých na základě cgMLST byla prokázána shoda. Šest kmenů tohoto sekvenačního typu izolovaných v letech 2016–2018 od pacientů z Prahy (n = 5) a Plzeňského kraje (n = 1) vykazovalo vysokou podobnost (0–1 rozdílná alela). Další dva kmeny ST7 získané v roce 2020 ze Středočeského a Olomouckého kraje se lišily v 39 a 41 alelách. Epidemie listeriózy vyvolané L. monocytogenes CC7 (ST7) je v současnosti šetřena i ve Spojených státech amerických ve spojitosti s konzumací hub enoki (penízovka sametonohá). Sporadické případy listerióz vyvolané kmenem CC7 (ST7) v České republice však s konzumací hub enoki nesouvisí. Analýzou sekvenačních dat nebyla potvrzena jejich klonální příbuznost (rozdíl v 74 alelách) [18].

V rámci výskytu humánních kmenů sérotypu 4b v ČR byla zjištěna klonální příbuznost u šesti kmenů CC2 (ST2) získaných v letech 2017–2018 z různých lokalit ČR (Plzeňský kraj, Královéhradecký kraj, Středočeský kraj, Moravskoslezský kraj).

V pěti případech byla detekována klonální příbuznost pouze mezi dvěma kmeny, a to u sekvenačních typů ST1, ST2, ST3, ST6 a ST101. Výsledná zjištění jsou ovlivněna i počtem zaslaných kmenů k typizaci, neboť bez testování mohou menší epidemie uniknout pozornosti.

V této studii byla také sledována přítomnost klíčových genů virulence L. monocytogenes. U všech testovaných kmenů byla přítomnost klíčových genů (inlA, inlB, prfA, hlyA, actA, plcA, plcB, mpl) potvrzena. U tří kmenů náležících do klonálních komplexů CC121, CC3, CC9 byla zjištěna přítomnost mutace typu PMSC v genu inlA, která vede k expresi zkráceného proteinu internalinu A. Kmeny patřící do komplexů CC121 a CC9, u kterých se PMSC v genu inlA typicky vyskytuje, jsou často popisovány v souvislosti s jejich perzistencí v potravinářských podnicích [19, 20]. V České republice byl popsán také výskyt suspektně perzistentních kmenů L. monocytogenes CC3 izolovaných z pařených sýrů v letech 2014–2019 [21]. Při srovnání genomu perzistentních kmenů a humánního kmene L. monocytogenes CC3 však byla detekována jiná forma mutace v genu inlA vedoucí k PMSC a na základě cgMLST kmeny netvořily epidemický klastr. I tyto potenciálně hypovirulentní kmeny však byly schopny vyvolat klinickou formu humánní listeriózy. Protein internalin A je sice jedním z klíčových faktorů virulence, ale míra virulence kmenů L. monocytogenes je dána přítomností i dalších faktorů a nehraje tedy výlučnou roli [22].

ZÁVĚR

Tato studie poskytuje aktuální přehled genetické rozmanitosti kmenů L. monocytogenes humánního původu v pětiletém sledovaném období v České republice. Na základě sekvenačních dat byly definovány nové epidemické klastry, které by mohly vést ke stejnému vehikulu nákazy a v budoucnosti vyústit v epidemii listeriózy. Nové metody představují účinný nástroj ke shromažďování, analýze, sdílení informací o původcích infekčních chorob za účelem včasné detekce hrozeb, monitorování a hodnocení rizik. Důležitou roli při dohledu nad výskytem listerióz hraje správná interpretace molekulárně-biologických dat ve vztahu k epidemiologickým šetřením.

Do redakce došlo 5. 8. 2021.

Adresa pro korespondenci:

doc. MVDr. Renáta Karpíšková, Ph.D.

Ústav ochrany a podpory zdraví LF MU

Kamenice 753/5

625 00 Brno

e-mail: renata.karpiskova@med.muni.cz