Cytogenetika akútnych leukémií u detí

Souhrn

Detské akútne leukémie sú charakterizované rekurentnými numerickými a štruktúrovými chromozómovými aberáciami, ktoré sú špecificky asociované s diagnózou a prognózou detskej akútnej lymfoblastickej leukémie (ALL) ako aj akútnej myeloidnej leukémie (AML). Identifikácia chromozomálnych aberácií je klinicky mimoriadne dôležitá, nakoľko v onkologickej praxi slúži k zaradeniu pacientov do rizikových skupín. Existuje však nemalá skupina pacientov, u ktorých nie je možné identifikovať žiaden cytogenetický marker, a to práve kvôli nízkemu rozlíšeniu metód používaných v bežnej rutinnej laboratórnej praxi.

Tento článok poskytuje aktuálny prehľad klinicky významných chromozómových aberácií u detských ALL a AML, ako súčasných technológií používaných pre ich vyšetrenie.

Kľúčové slová:
cytogenetická analýza, akútna lymfoblastická leukémia, akútna myeloidná leukémia

Úvod 

Detské leukémie predstavujú geneticky a biologicky heterogénne ochorenia, asociované so širokým spektrom genetických faktorov, ktoré zohrávajú úlohu v epidemiológii, v zaradení pacientov do rizikových skupín a v rozhodovaní o liečbe. Cytogenetická analýza umožňuje identifikovať špecifické translokácie asociované s určitým podtypom leukémie, čím významne slúži precíznej diagnostike ochorenia. Súčasne prispieva k identifikácii génov zapojených do chromozómovej prestavby a vedie k lepšiemu pochopeniu mechanizmu leukemogenézy. Tým, že cytogenetická analýza umôžňuje detekovať mnohé chromozómové a genetické abnormality, poskytuje pohľad na heterogenitu celej bunkovej populácie. V tejto práci sa budem bližšie venovať jednotlivým chromozómovým aberáciám v pohľade na prognostický význam pre ALL ako aj AML u detských pacientov.

Metódy využívané v klasickej a molekulárnej cytogenetike 

Cytogenetika, ktorá prispela k dnešnému chápaniu rakoviny, sa vyvíjala viac než štyri dekády a môže byť rozdelená do štyroch ér. Prvá éra sa začala úspešnou in vitro chromozómovou kultiváciou a identifikáciou správneho počtu chromozómov. Neskôr prišla prúžkovacia éra, ktorá umožnila klasifikáciu chromozómov použitím techník na farbenie vysoko rozlišovacích prúžkov. Prevrat v našom chápaní nádorovej genetiky spôsobila metóda FISH (fluorescenčná in vitro hybridizácia) a jej rôzne modifikácie. Teraz sa nachádzame vo štvrtej alebo tzv. genomickej ére vysoko-rozlišovacích genomických microarrayov a arrayovej komparatívnej genomickej hybridizácie (aCGH) (tab. 1) [1]. Všetky tieto metodiky prispievajú k stále presnejšiemu stanoveniu malígneho klonu a k definovaniu diagnózy, indikácii prognózy, asistujú pri výbere liečby, monitoringu odpovede na liečbu a podporujú ďalší výskum.

Numerické a štruktúrové chromozómové aberácie  

Numerické abnormality môžu zahŕňať celú sadu chromozómov, čo má za následok ploidné zmeny, tj. zisk alebo stratu jednotlivých chromozómov (aneuploídia) (obr. 1) [1]. Vyšetrovanie ploídie je z prognostického hľadiska nevyhnutné hlavne u ALL pacientov [2].

Medzi štruktúrové aberácie patria chromozómové translokácie, delécie, inzercie a inverzie. Môžu byť vyvážené alebo nevyvážené. Nevyvážené prestavby vedú k zmenám v počte kópií a teda k patológii [1]. 

1. A. Numerické aberácie u detskej ALL

Hyperdiploídia a hypodiploídia

Vysoká hyperdiploídia (51 až 67 chromozómov alebo index DNA >1,16), sa nachádza u 25 až 30 % pacientov s detskou B-bunkovou ALL (B-ALL), zatiaľ čo u T-bunkovej ALL (T-ALL) je len veľmi zriedkavá [1, 3, 4]. Za normálnych okolností majú deti s hyperdiploídiou veľmi dobré prežívanie [1, 5]. Významný indikátor pre dobrú prognózu je nález trizómie 4, 10 a 17. Frekvencia nálezu týchto chromozómov v klone s vysokou hyperdiploídiou je v skupine detí vo veku od 1–14 rokov vyššia (16,6 %) ako u v skupine adolescentov a mladých dospelých (8,5 %) (tab. 2) [8].

Okrem toho, približne 50 % detí s vysokou hyperdiploídiou má štrukturové chromozómové aberácie, predovšetkým chromozómové zisky [3]. Deti s hyperdiploídiou majú tendenciu mať viacero faktorov spojených s priaznivou prognózou, vrátane veku (od 2 do 10 rokov), počet leukocytov <10 000 x 10⁶/L, L1 morfologický typ a pre-B fenotyp [7]. Na vyšetrenie hyperdiploídie sa najčastejšie používa metóda konvenčnej cytogenetiky (obr. 1), arrayovej komparatívnej genomickej hybridizácie (aCGH) (obr. 2) a fluorescenčnej in situ hybridizácie (FISH) a prietokovej cytometrie. Všetky poskytujú spoľahlivú detekciu hyper- ako aj hypodiploídie [10].

Nízka hyperdiploídia je odlišná od vysokej v pohľade na obraz chromozómových zmien v karyotype a v klinických prejavoch. U takmer 75 % detských ALL prípadov sa vyskytujú štruktúrové abnormality [10]. Nízka hyperdiploídia u ALL (47–50 chromozómov) sa vyskytuje u detí vo veku 1–14 rokov s rovnakou frekvenciou ako u adolescentov a mladých dospelých vo veku 15–30 rokov (10–15 %) [8]. Ich prognóza je závislá od prítomnosti štruktúrových aberácií. Pacienti bez rekurentných aberácií majú intermediárnu prognózu [8, 9].

Hypodiploídia

Karyotypy s <46 chromozómami sú klasifikované ako hypodiploidné a sú prítomné u približne 7 % detských ALL prípadov [7, 10]. Tieto deti majú horšie prežívanie. Prevažná väčšina pacientov so 45 chromozómami má priaznivé prežívanie v porovnaní s pacientmi s menej ako 45 chromozómami [2, 5, 6, 8, 9, 10]. Klony so 44 a menej chromozómami sa vyskytujú zriedkavejšie u detskej ALL, tvoria u 1–14-ročných detí <1,7 % prípadov a u adolescentov a mladých dospelých vo veku 15–30 rokov 2,3 % [8]. Takmer 90 % pacientov s klonovým vývojom so 40–43 chromozómami má štruktúrové aberácie a majú zlé prežívanie [6, 8, 9].

Karyotyp s 23–29 chromozómami predstavuje vzor chromozómov blízky haploídii. Pacienti s takýmto karyotypom sú vzácni, s prevalenciou 0,7 až 2,4 % prípadov [5] a majú obyčajne nepriaznivú prognózu s mediánom prežívania 11 mesiacov [4, 8, 9]. 

1. B. Štruktúrové aberácie u ALL

TEL/AML1

TEL/AML1 známa aj ako ETV6/RUNX1, predstavuje jednu z najčastejších translokácií u detských B-ALL, s prevalenciou 20 až 25 % prípadov [19]. Prognóza pacientov s TEL//AML1 je v 90 % priaznivá s dlhodobou remisiou, hoci sa v niektorých prípadoch popisujú aj neskoré relapsy [5]. Je kryptická a tedy cytogeneticky nevyšetriteľná, preto musí byť detekovaná metódou FISH alebo RT-PCR. Býva prítomná ako iniciálna v leukemickom klone, avšak sama o sebe nestačí na rozvoj leukemického klonu, musia byť prítomné ďalšie mutácie [1, 8]. 

Amplifikácia RUNX1

Amplifikácia oblasti chromozómu 21, obsahujúca RUNX1 gén, býva prítomná u detských pacientov vo vyššom veku, s nízkym počtom leukocytov a so zlou prognózou [8, 9]. Pričom u dospelých pacientov s B-ALL sa nevyskytuje [8]. 

Prestavby génu MLL

Gén sa nazýva MLL, lebo je alterovaný ako u myeloidnej, tak aj u lymfoidnej rady leukemických buniek, čo predpokladá pôvod leukemického klonu z kmeňových buniek alebo včasných progenitorových buniek [10]. MLL má viac ako 70 rôznych fúznych parnerov. Zo všetkých prestavieb 80 % je zapríčinené AF4 (80 %), AF9 (16 %), ENL (11 %), AF10 (7 %) a ELL (4 %) [22]. Ostatné translokácie (okolo 60) vznikajú ojedinele, táto skupina zahŕňa 20 % MLL translokácií. Niektoré translokácie možu byť prítomné rovnako u ALL ako aj u MLL, iné sú špecifické pre ALL a iné zas pre AML. Translokácia t(4;11)(q21;q23) je špecifická pre ALL deti do 1 roka, pričom t(11;19)(q23;p13.3) a t(9;11)(p22;q23) sa nachádzajú u oboch, ALL a AML. MLL translokácie sú indikátormi nízkeho prežívania detí s ALL, pričom rozdiel v prežívaní závisí od veku. Práve u t(11;19) a t(9;11) je prognóza u dojčiat veľmi zlá, u detí starších ako 1 rok o niečo lepšia, ale stále zlá. Výskyt je u dojčiat s ALL najvyšší (až 80 % tvorí práve MLL/AF4), u detí vo veku 1–14 rokov je frekvencia 1,7 % a pre 15–30-ročných pacientov 3,4 % (tab. 3) [8, 22]. MLL alterácia sa môže tiež vyskytnúť už v prenatálnom období, avšak podobne ako TEL/AML1 sama o sebe nestačí na rozvoj leukemického klonu, musia byť prítomné ďalšie mutácie. V diagnostike sa na identifikáciu rôznych preskupení MLL génu rutinne používa cytogenetická analýza, fluorescenčná in situ hybridizácia (FISH) a reverzne-transkriptázovej polymerázovej reťazovej reakcie (RT-PCR). Na detekciu zriedkavých zlomov LDI-PCR („long-distance inverse PCR“). 

BCR/ABL1, Ph chromozóm

Významnou abnormalitou u detských ALL je recipročná translokácia medzi chromozómami 9 a 22, t(9; 22)(q34;q11), ktorá má za následok vytvorenie Philadelphského chromozómu (Ph). Približne 95 % Ph+ALL prípadov je zistiteľných prostredníctom karyotypovania, avšak vzhľadom na prítomnosť možných kryptických preskupení, ktoré sa môžu prehliadnuť, sa v praxi využíva metóda FISH, RT-PCR, alebo RQ-PCR [5, 17, 18]. Frekvencia Ph+ALL predstavuje u detí vo veku 1–14 rokov 2,9 % a u adoslescentov a mladých dospelých vo veku 15–30 rokov 7,0 % a je silným indikátorom zlého prežívania u detí [8]. 

TCF3/PBX1 alebo E2A/PBX1

Táto translokácia charakterizuje detskú prekurzorovú B–bunkovú ALL a môže byť buď vyvážená t(1;19), alebo nevyvážená der(19)t(1;19)(q23;p13) s 2 normálnymi chromozómami [11, 17]. Translokácia je často detekovaná u detí okolo 10. roku života alebo u starších. Prognóza je pri súčasných liečebných protokoloch priaznivá [10, 23].

Pacienti s T-ALL nie sú v databázach natoľko početní ako s B-ALL a preto je štatistické vyhodnotenie chromozómových aberácií uvádzané len zriedkavo. Navyše aj veľké databázy uvádzajú väčšinou prítomnosť normálneho karyotypu (u 80 % detských pacientov s T-ALL) so zriedkavými numerickými ako aj štruktúrovými aberáciami. Prehľad najčastejších je zosumarizovaný v tabuľke 4.

2. A. Numerické aberácie u AML

Pokiaľ ide o AML, väčšina hyperdiploidných prípadov má len 1 alebo 2 prídatné chromozómy, pričom najčastejšími sú trizómia 8 (u 5 až 10 % detských AML). Častejšia je aj u pacientov s Downovým syndrómom a AML [7, 8] a u AML-M7 skupiny podľa francúzsko-americko-britskej (FAB) klasifikácie. Najbežnejšie nadpočetné chromozómy sú 6, 8, 10, 19 a 21 [9]. 

Monozómia 7 a delécia 7 q

Anomálie chromozómu 7 sa vyskytujú u AML pacientov s vyváženou zmenou 7q22 a 7q32-q35. Opakujúce sa straty materiálu na chromozóme 7 sa dávajú do súvislosti s existenciou supresorových génov v zlomových oblas-tiach. Tieto regulujú rast a diferenciáciu myeloidnej rady. Strata ich funkcie predpokládá účasť na leukemickej transformácii bunky [12]. Incidencia monozómie 7 alebo delécie 7 q [(del (7 q)] je približne u 5 až 7 %, pričom je častejšia u AML M4 a M6 [7]. Môže sa vyskytnúť aj u  sekundárnej AML na podklade myelodysplastického syndrómu (MDS) a u detí s konštitučným karyotypom s predispozíciou k myeloidnej leukémii, vrátane Fanconiho anémie a vrodenej neutropénie a neurofibromatózy typ 1 [13]. 

2. B. Štruktúrové aberácie u AML

AML1/ETO

Recipročná translokácia t(8;21)(q22;q22) medzi chromozómami 8 a 21 rezultuje do fúzneho génu AML1/ETO (RUNX1/CBFA2T1) a je považovaná za najčastejšie sa vyskytujúcu translokáciu u AML (8–12 % detských AML), hlavne u podtypu AML M2, ale aj u M1 alebo M4 [14] asociovanú s priaznivou prognózou a dlhodobými remisiami (tab. 5). 

Inv(16) (CBFB/MYH11)

Inverzia inv(16)(p13;q22) predstavuje spolu s t(8;21), približne 25 % AML prípadov [15]. Väčšina štúdií spája inv(16)(p13q22) s priaznivou prognózou [16]. 

PML/RARA

Translokácia t(15;17)(q22;q21) sa vyskytuje u akútnej promyelocytovej leukémie (APL), pričom chýba u pacientov s inými typmi leukémie [7]. Drvivá väčšina pacientov má variant t(15;17), ktorý zahŕňa gén PML a α-receptor kyseliny retinovej (RARA gény). 

OTT/MAL

Translokácia t(1;22)(p13;q13) rezultuje do fúzneho génu OTT/MAL. Nachádza sa často u malých detí, hlavne u tých s akútnou megakaryoblastickou leukémiou (AML M7), 96 % prípadov je mladších jako 24 měsíců [11]. 

Sekundárne cytogenetické aberácie 

Skupina pacientov s AML a cytogeneticky detekovaným aberantným klonom má viac ako jeden chromozóm prestavaný [20]. Takéto prestavby chromozómov sa nazývajú sekundárne aberácie a predstavujú najčastejšie del(7q) (-7), trizómia 8, (+8), der(16)t(1;16)(q12-23;q12-24) a trizómia 21 (+21). Sú prítomné ako u ALL aj AML [20]. Trizómia 8 je známa tým, že neovplyvňuje prognózu leukémie, pokiaľ nejde o sekundárnu zmenu v karyotype. Vtedy pôsobí akceleračne v klonovom vývoji.

Záver 

V súčasnosti používané metódy molekulárnej cytogenetiky (FISH, mFISH, aCGH) prispeli k identifikácii a charakterizácii nových a kryptických chromozómových aberácií. Vďaka vyššej rozlíšiteľnosti zatieňujú význam konvenčnej cytogenetiky. Avšak práve pre limitácie metód FISH aCGH vo vyšetrovaní vyvážených translokácií nemôžu metódu konvenčnej cytogenetiky úplne nahradiť.

V práci zosumarizované genetické aberácie majú svoje pevné miesto v diagnostike, prognóze a sledovaní minimálneho reziduálneho ochorenia u detí s ALL a AML. Sú nevyhnutné k zaradeniu pacientov do rizikových skupín a pri rozhodovaní o terapeutickej stratégii. To je významným dôvodom pre neustále zvyšovanie úsilia o zlepšovanie a štandardizáciu cytogenetických a molekulárnych metódy a interpretáciu ich výsledkov.

Doc. MUDr. Denisa Ilenčíková, PhD.

2. detská klinika LFUK a DFNsP

Limbová 1

833 40 Bratislava

Slovenská republika

e-mail: denisa.ilencikova9@gmail.com