Vyšetření mutací genů BRCA1 a BRCA2 v nádorových tkáních – možnosti a limitace

Souhrn

Rozvoj cílené biologické léčby nádorových onemocnění je spojen s vyhledáváním markerů umožňujících predikovat odpověď na příslušný lék. V poslední době se zájem soustředí na karcinomy ovaria a novou terapii inhibitory proteinů poly(ADP-ribose)polymerázy (PARP), jaderných enzymů podílejících se na opravě jednovláknových zlomů DNA. Největší prospěch z podávání PARP inhibitoru mají pacientky s patogenní či potenciálně patogenní zárodečnou nebo somatickou mutací BRCA1 a BRCA2, genů zodpovědných za reparaci dvouvláknových zlomů DNA. V genech BRCA 1/2 je popsáno široké spektrum mutací od jednobodových záměn až po rozsáhlé delece, zahrnující někdy i několik exonů.

Na rozdíl od testování zárodečných mutací, jež je již mnoho let prováděno na pracovištích lékařské genetiky, somatické mutace doposud testovány nebyly. Detekce mutací BRCA1 a BRCA 2 v nádoru se výrazně liší od diagnostiky germinálních mutací, ve srovnání s analýzou vzorků DNA z krve naráží na problémy vyplývající zejména z nerovnoměrného zastoupení nádorových buněk ve tkáni, heterogenity s přítomností více klonů nádorových buněk a infiltrace nenádorovými elementy, stejně tak jako na obtíže spojené s různě bohatou frakcí apoptotických a nekrotických buněk, které snižují průměrnou kvalitu izolované DNA.

Z hlediska vyšetřovacích metodik se díky své komplexitě, rychlosti implementace do rutinního provozu a citlivosti detekce pro účely diagnostiky mutací BRCA 1/2 jeví jako nejvýhodnější metoda NGS. Při zavádění do rutinní laboratorní praxe musí být primárně kladen důraz na zajištění systému kontroly kvality. Vzhledem k velké pravděpodobnosti nálezu dosud nereportovaných změn v genech BRCA 1/2 by také bylo velmi výhodné vytvořit sdílenou databázi nalezených somatických variant v rámci ČR.

Klíčová slova:
BRCA1 – BRCA2 – karcinom ovaria – FFPE – DNA – sekvenování nové generace – NGS

Rozvoj cílené biologické léčby v rámci systémové protinádorové farmakoterapie je úzce spojen s vyhledáváním obecně biologických mechanismů, které lze terapeuticky ovlivnit a s tím spojených molekulárně biologických faktorů v nádorových buňkách, které umožní predikovat odpověď na příslušný lék. Dnes je naprosto standardně v laboratořích molekulární patologie stanovován mutační stav genů RAS (KRAS, NRAS) v případě metastatického kolorektálního karcinomu, genu BRAF v případě metastatického maligního melanomu, přítomnost aktivačních mutací genu EGFR u nemalobuněčných karcinomů plic apod. Stejně tak využíváme techniky in situ hybrizace pro hodnocení amplifikace genu HER2/Neu u karcinomu prsu a karcinomu žaludku, či přestavby genů ALK či ROS1 u nemalobuněčných karcinomů plic (1,2).

V poslední době se zájem molekulárních patologů soustředí také na metastatické karcinomy ovaria, tedy nádory, jejichž prognóza je stále – přes veškeré pokroky moderní onkologie – u pokročilých stádií relativně velmi nepříznivá. Proto nová léčebná možnost, která se recentně objevila, tj. terapie tzv. PARP inhibitory, vyvolává značné naděje.

PARP je zkratkou pro rodinu proteinů poly(ADP-ribose)polymerázy, jaderných enzymů, které se podílejí na opravě jednovláknových zlomů DNA. PARP inhibitory jsou klinicky testovány u řady nádorových onemocnění (karcinom vaječníku, karcinom plic, triple-negativní karcinom prsu, karcinom prostaty, maligní melanom atd.). První diagnózou, u které přichází jeden z PARP inhibitorů (olaparib) do běžné klinické praxe, je ovariální karcinom. Ve studii fáze II bylo 265 pacientek s metastatickým karcinomem ovaria, citlivým na platinový derivát, randomizováno do udržovací léčby olaparibem proti placebu. U pacientek, kterým byl podáván olaparib, byla klinická progrese zaznamenána signifikantně později, než ve skupině s placebem (medián přežití bez známek progrese 8,4 měsíce proti 4,8 měsíce; p < 0,001) (3). Při retrospektivní analýze genů BRCA1 a BRCA2 u pacientek v této studii bylo zjištěno, že největší prospěch z podávání PARP inhibitoru mají pacientky s patogenní či potenciálně patogenní (třída 4 a 5 dle klasifikace IARC – viz níže) zárodečnou nebo somatickou mutací těchto genů (medián přežití bez známek progrese 11,2 měsíce proti 4,3 měsíce; p < 0,0001) (4).

Vysvětlení, proč byl efekt olaparibu největší právě u nádorů s mutací genů BRCA, je poměrně jednoduché. Protože proteiny rodiny BRCA jsou odpovědné za opravy dvouvláknových zlomů, dokáží PARP inhibitory inhibicí reparace jednovláknových zlomů způsobit jejich hromadění. Nefunkční systém reparace dvouvláknových zlomů způsobený mutacemi BRCA je následně pro nádorové buňky kritický.

BRCA 1 a BRCA 2 jsou tumor-supresorové geny, které hrají roli v reparaci dvouvláknových zlomů DNA pomocí homologní rekombinace. Jedná se o relativně velké geny- BRCA 1 má 22 exonů a je 5500 párů bází dlouhý, BRCA 2 s 27 exony a délkou přes 11000 párů bazí (5-7). Tyto geny byly donedávna předmětem zájmu zejména z důvodů zvýšeného rizika vzniku zhoubných nádorů (zejména karcinomu prsu a karcinomu ovária) u nemocných se zárodečnou (germinální) mutací jednoho z těchto genů. Při podezření, že se v rodině vyskytují ve zvýšené frekvenci některé z těchto nádorů, je zpravidla konzultován lékařský genetik, který provede komplexní genetické vyšetření zahrnující testování možných zárodečných mutací těchto genů. V případě nálezu mutace je kromě doporučení genetického vyšetření u pokrevních příbuzných doporučeno následné pravidelné sledování nemocné, případně preventivní léčebný zákrok (8).

Analýza BRCA genů ve výše zmíněné studii s olaparibem ukázala, že z léčby profitují nejen nemocné se zárodečnou mutací těchto genů, ale že podobně lépe reaguje i nezanedbatelné množství pacientek, u kterých došlo k somatické patogenní mutaci v těchto genech až v průběhu kancerogeneze. Z publikovaných studií vyplývá, že u pacientek s karcinomem ovaria, u kterých byly vyloučeny germinální mutace genů BRCA1/2, byl v nádoru potvrzen nález somatické varianty genů BRCA1/2 – v závislosti na typu nádoru – ve frekvenci 2 - 7 % . U takto nalezených somatických mutací šlo navíc častěji o nové, doposud nereportované genetické změny (4,9-11). Z tohoto důvodu bylo nutné zahájit přípravu postupů, kdy u nemocných s karcinomem ovaria bude, kromě již fungujícího testování zárodečných mutací na pracovištích lékařské genetiky, zavedeno rovněž testování nádorových tkání za účelem identifikace somatických mutací vzniklých během vlastní kancerogeneze.

Je evidentní, že toto testování musí fungovat v podmínkách úzké spolupráce mezi lékařskými genetiky a molekulárními patology. Cílem našeho snažení je definovat algoritmus pro optimální identifikaci nemocných s jakýmkoli typem mutace (germinální nebo somatické) a umožnit tak jejich cílenou léčbu na základě průkazu pozitivního prediktivního markeru – mutace BRCA genů.

Existují dvě principiálně odlišné možnosti, jak postupovat při testování. Současné doporučené postupy pro nemocné s karcinomem ovaria postulují, že u každé nemocné s maligním epiteliálním novotvarem ovaria by mělo být provedeno vyšetření na přítomnost zárodečné mutace genů BRCA1 a BRCA2 (1,2).

První variantou, která se nabízí, je provedení testování na pracovišti lékařské genetiky (testování DNA získané z lymfocytů periferní krve). U těch pacientek, u kterých nebude prokázána zárodečná mutace BRCA 1/2, stále existuje možnost, že nádor se vyvinul v souvislosti se vznikem somatické mutace, která je prokazatelná pouze v nádoru. Vzorek nádorové tkáně od těchto nemocných (bez zárodečné mutace v krvi) by byl následně vyšetřen na pracovišti patologie. Výhodou tohoto postupu je skutečnost, že při nálezu patogenní mutace (resp. nesynonymní záměny) ve tkáni nemusí patolog řešit otázku možného přenosu mutace do další generace. Zároveň je testování prováděno u menšího počtu vzorků, neboť z testování jsou vyloučeny jak pacientky se zárodečnou mutací, tak nemocné pro terapii PARP inhibitory z nějakého důvodu nevhodné (nemocná neodpovídá na léčbu platinou, klinická kontraindikace, apod.) a vyšetření proto není indikováno (12). Nevýhodou tohoto postupu je zejména skutečnost, že každá nemocná s nádorem ovaria musí projít nejprve poradnou klinického genetika. To bude klást značné časové a personální nároky na tato pracoviště, jejichž kapacita je již v současné době limitovaná a lze předpokládat, že nároky na genetické poradenství budou stale stoupat.

Druhou variantou je obrácené pořadí testování – tj. u každé pacientky s diagnostikovaným karcinomem ovaria je ihned provedeno vyšetření mutací BRCA v nádorové tkáni. V případě průkazu absence mutace ve tkáni je pravděpodobnost germinální mutace u dané nemocné velmi nízká (byť nikoli nutně zcela nulová). Naopak, nemocné s identifikovanou mutací by byly dále předány klinickému genetikovi, který by určil, zda se jedná o mutaci somatickou či zárodečnou a kvalifikovaně posoudil rizika z takové mutace vyplývající pro přenos do další generace. Výhodou tohoto postupu je zejména skutečnost, že tímto způsobem mohou být v podstatě bezprostředně po stanovení diagnózy otestovány všechny nemocné s karcinomem ovaria, nevýhody spočívají naopak zejména v riziku, že v případě kdy by bylo vyšetření mutací BRCA ve tkáni falešně negativní, unikla by taková nemocná a její příbuzní pozornosti klinického genetika a také v tom, že v laboratořích patologie by musely být testovány i vzorky od nemocných, u kterých by léčba PARP inhibitory z nejrůznějších důvodů tak jako tak nebyla zvažována.

Po zvážení všech „pro“ a „proti“ obou možných variant se zdá, že celkově výhodnější a pro klinickou praxi v České republice využitelnější bude první varianta – tedy primární testování klinickým genetikem s následným vyšetřováním nádorové tkáně u případů, kde bude toto vyžadováno onkologem pro volbu systémové cílené terapie.

VYŠETŘOVÁNÍ SOMATICKÝCH VARIANT GENŮ BRCA V NÁDOROVÉ TKÁNI

Pro vyšetřování somatických mutací v nádorové tkáni byly převzaty metodiky z diagnostiky germinálních mutací těchto genů. V současné době není známo, nakolik se v nádorové tkáni mohou vyskytovat i jiné typy mutací, než jaké jsou nalézány jako mutace germinální při testování z krve. V genech BRCA 1 a 2 je popsáno široké spektrum mutací od jednobodových záměn až po rozsáhlé delece, zahrnující někdy i několik exonů. Nejsou popisovány typické časté lokalizace mutací (hotspots), jak je tomu např. při vyšetřování mutací v genech RAS, BRAF nebo EGFR, proto je nutné analyzovat všechny kódující exony včetně přilehlých exon-intronových spojení genů BRCA.

Zdrojový materiál

Detekce mutací genů BRCA1 a BRCA 2 v nádoru se výrazně liší od diagnostiky germinálních mutací. Detekce variant u solidních nádorů naráží ve srovnání s analýzou vzorků DNA z krve na základní problémy vyplývající zejména z nerovnoměrného zastoupení nádorových buněk ve tkáni zastižené ve vzorku, časté heterogenity s přítomností více klonů nádorových buněk s různými genovými profily a infiltrace vzorku nenádorovými elementy, stejně tak jako obtíže spojené s různě bohatou frakcí apoptotických a nekrotických buněk, které snižují průměrnou kvalitu nukleové kyseliny (13)

Většina molekulárně-patologických vyšetření vychází z formalinem fixovaného materiálu zalitého v parafinových bločcích. Jeho výhodou je snadný výběr reprezentativní tkáně s ohledem na co největší množství nádorových buněk. Na druhou stranu DNA získaná z parafinových bločků je v porovnání s DNA izolovanou z nativní tkáně či periferní krve zpravidla výrazně méně kvalitní, vysoce fragmentovaná a s malým výtěžkem izolace (14,15). Použití pufrovaného formalinu s neutrálním pH a dodržení optimální doby fixace odpovídající velikosti tkáňového vzorku významně zlepší kvalitu DNA; přesto však zůstává kvalita i kvantita DNA získané z parafínových bločků značně limitovaná.

Pro molekulárně biologické analýzy by z hlediska maximalizace kvality DNA bylo ideální vyšetření nádoru z nativní tkáně, toto však není standardně praktikováno. Překážkou pro rutinní uplatnění takového postupu v každodenní praxi je zejména časová a logistická náročnost pro dodržení všech podmínek preanalytické fáze a také zpravidla nutnost okamžitého hlubokého zmražení nádorové tkáně a jejího uskladnění do doby extrakce nukleových kyselin. Vybavení pro kryoprezervaci tkáně (zpravidla v tekutém dusíku) je dostupné pouze na některých pracovištích. Z tohoto pohledu je reálnější variantou spíše optimalizace protokolu pro vyšetření fragmentované DNA z parafínových bločků, než změna zaběhaných postupů preanalytické fáze v široké síti klinických pracovišť, která dodávají nádory do laboratoří patologie. Je třeba si uvědomit, že v krátké době nepůjde pouze o vyšetřování karcinomů ovárií operovaných na relativně omezeném počtu onkogynekologických center, ale BRCA testování bude nutné i např. u některých karcinomů prsu, kde počet chirurgických pracovišť provádějících takové operace je řádově vyšší a šance na zajištění nefixované tkáně pro genetické vyšetření od všech operatérů je víceméně iluzorní.

Výběr vhodné a citlivé metody

Při odhalování somatických mutací genů BRCA v komplexních vzorcích, jakými jsou nádory, jež zahrnují nejen vlastní neoplastickou populaci, ale také nenádorové elementy stromatu (vazivo, cévy, zánětlivé elementy), je nutné volit detekční metodu kompatibilní s limitacemi danými fixovaným materiálem a malým množstvím DNA z něj získané, zároveň ale metodu schopnou analyzovat rozsáhlé úseky genů. Metoda musí být velmi citlivá – zatímco nádor u nosičky zárodečné mutace BRCA genu bude mít vždy více než 50% mutovaných alel genu BRCA, procentuální zastoupení mutovaných alel u germinálně wild-type pacientky bude závislý na procentuálním zastoupení nádorových buněk ve vybraném preparátu a pohybuje se teoreticky v rozmezích 0,1-100%.

Jako nejvýhodnější volba se proto z tohoto pohledu jeví využití sekvenování nové generace (NGS). Tato metoda umožňuje cíleně sekvenovat mnoho vybraných oblasti genomu během jedné analýzy, navíc umožňuje detekci somatických mutací zastoupených ve vyšetřovaném vzorku i pouze v malém procentu (16,17). Možnost spolehlivého využití NGS pro detekci mutací BRCA 1/2 v nádorové tkáni karcinomu ovaria potvrdila multicentrická studie, která proběhla v roce 2015 na několika pracovištích patologie v Německu, Rakousku a Švýcarsku (18).

Detailní popis laboratorního postupu při využití NGS daleko přesahuje rámec tohoto textu a byl již podrobně publikován (19), proto zde budou popsány jednotlivé kroky pouze orientačně.

Prvním krokem při NGS je vytvoření tzv. knihovny. Knihovna je koncentrovaná směs vybraných DNA fragmentů s navázanými oligonukleotidy odpovídajícími jednotlivým vzorkům (indexy) a oligonukleotidy pro provedení sekvenace (adaptory) (19).

Obohacení knihovny o oblasti zájmu (testované geny) lze provést buď pomocí PCR amplifikace nebo cíleným vychytáváním sekvencí (targeted capture)(20).

Obohacení knihovny pomocí PCR využívá jedné nebo více multiplexových PCR k amplifikaci cílových oblastí z jednoho vzorku DNA. V následné PCR reakci jsou ke všem amplikonům z první PCR přidány indexy společně s adaptory nutnými pro sekvenaci. Přípravu knihovny pomocí PCR využívá řada komerčně dostupných kitů pro detekci somatických variant genů BRCA. Je to rychlá, jednoduchá a robustní metoda (21).

Obohacení knihovny pomocí cíleného vychytávání sekvencí je založeno na principu hybridizace fragmentu izolované DNA se syntetickými cDNA specifickými oligopróbami. Na trhu jsou na výběr hotové sekvenační panely nebo próby navržené na zakázku podle požadovaných sledovaných genů – např. SeqCap EZ choice (Nimblegen/ Roche) nebo SureSelect (Agilent). Vstupní DNA je enzymaticky či fyzikálními metodami (ultrazvukem) fragmentována na úseky dlouhé cca 200 párů bazí. DNA fragmenty jsou po úpravě (end-repair, A-tailing, ligace adaptorů) označeny pomocí LM-PCR (ligation-mediated PCR) indexy specifickými pro každý vzorek individuální DNA. Takto označené vzorky jsou následně proporcionálně spojeny. Fragmenty DNA všech analyzovaných vzorků jsou poté společně hybridizovány se sondami panelu. Po ukončení hybridizace jsou biotinylované sondy s navázanými fragmenty DNA vychytány magnetickými kuličkami na základě vazby biotin-streptavidin. Vychytané fragmenty DNA jsou nakonec amplifikovány a po přečištění je obohacená knihovna kvantifikována a sekvenována.

Při NGS je cílová oblast knihovny sekvenována mnohokrát (až několik tisíckrát) – tzv. hloubka čtení, čímž je zaručeno, že bude možné eliminovat náhodné chyby v jednotlivých čteních, ke kterým by mohlo dojít a skutečnou změnu v pořadí nukleotidů (mutaci) je tak možné odlišit od informačního šumu na pozadí (22).

Při sekvenaci knihovny připravené pomocí kteréhokoli z výše zmíněných přístupů lze detekovat polymorfismy v sekvenci nukleotidů (jednobodové záměny, inserce, delece) s dosažením dostatečné hloubky čtení. NGS má rovněž potenciál při stanovení variability v počtu kopií genů a rozsáhlejších genových přestaveb (23-25), zatím je pro účely této analýzy stále nejvíce využívaná metoda MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification (26-28).

BIOINFORMATICKÉ ZPRACOVÁNÍ DAT

Bioinformatické zpracování NGS dat je poslední částí procesu sekvenování nové generace. Slouží k vyvolání čtených sekvencí (tzv. readů) z formátu generovaného sekvenátorem do formátů zobrazovaných některým z vizualizačních softwarů.

Bioinformatický proces se skládá z několika dílčích částí, zahrnujících posouzení kvality hrubých dat, pre-processing, přiřazení čtených sekvencí k referenčnímu genomu, post-alignment processing, identifikaci variant a jejich anotace, tj. přiřazení k již známým a v mezinárodně dostupných databázích dostupným změnám (29,30).

Výstupem bioinformatické analýzy sekvenačních dat je anotovaný seznam odchylek sekvenovaného vzorku od referenčního genomu. Všechny tyto kroky lze provádět mnoha komerčními i veřejně dostupnými algoritmy pomocí postupu nastaveného na míru v dané laboratoři (BWA mapping, GATK variant calling atd), s využitím softwarových řešení dodávaných s konkrétním sekvenátorem (Ion reporter Life Technologies, Somatic Variant Caller llumina) nebo s využitím komerčního software (např. SEQNext JSI, Nextgene Softgenetics).

INTERPRETACE NALEZENÝCH VARIANT

Klasifikace nalezených variant je prováděna pomocí pětibodového klasifikačního systému IARC (International Agency for Research on Cancer). Na základě klasifikačního systému IARC jsou vydány výsledky, které lze rozdělit do tří kategorií (31,32):

1. Pozitivní, kdy nalezená mutace prokazatelně ovlivňuje funkci proteinu (klasifikační varianty 5-patogenní a 4-pravděpodobně patogenní, s malým klinickým významem)
2. Negativní, kdy není v DNA sekvenci nalezena odchylka (klasifikační varianty 1- nepatogenní, bez klinického významu, 2- pravděpodobně nepatogenní)
3. S nejasným klinickým významem, kdy není dosud známo, zda varianta ovlivňuje funkci protein (klasifikační varianta 3).

Obecně jsou za kandidátní varianty, tj. genetické změny potenciálně hrající roli v patogenezi nádoru považovány nesynonymní záměny, záměny vnášející nebo rušící terminační kodon, sestřihové varianty a inzerce a delece způsobující posun čtecího rámce. Synonymní záměny, které mohou tvořit až polovinu nalezených variant, jsou pro zjednodušení považovány za funkčně nevýznamné.

ZÁVĚR

Na vzniku ovariálních karcinomů se u významné části pacientek podílí mutace v genech BRCA 1 a BRCA 2, a to nejen germinální mutace, ale též somatické, tj. vzniklé v průběhu kancerogeneze. Přítomnost patogenní či potenciálně patogenní mutace v těchto genech je pokládána za prediktor léčebné odpovědi na novou skupinu cílených biologických léčiv, využívaných v terapii ovariálních karcinomů, tzv. PARP inhibitorů.

Zavedení rutinně použitelné metodiky testování BRCA1/2 mutací ve tkáni ovariálního karcinomu a vypracování algoritmu postupu vyšetřování těchto mutací v laboratořích patologii ve spolupráci s pracovišti lékařské genetiky, která vyšetřují germinální mutace stanovené v krvi, patří aktuálně mezi nejdůležitější úkoly molekulární patologie v ČR.

Z hlediska vyšetřovacích metodik pro oddělení molekulární patologie se díky své komplexitě, rychlosti implementace do rutinního provozu a citlivosti detekce pro účely diagnostiky mutací BRCA 1/2 aktuálně jeví jako nejvýhodnější metoda NGS.

Při zavádění této metodiky do rutinní laboratorní praxe na jednotlivých pracovištích musí být primárně kladen důraz na zajištění systému kontroly kvality. Vzhledem k velké pravděpodobnosti nálezu dosud nereportovaných změn v genech BRCA 1/2 by také bylo velmi výhodné vytvořit sdílenou databázi nalezených somatických variant v rámci ČR.

PODĚKOVÁNÍ

Podpořeno částečně granty PRVOUK P37/11 a BBMRI_CZ LM2015089.

PROHLÁŠENÍ

Autor práce prohlašuje, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku není ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou. Toto prohlášení se týká i všech spoluautorů.

Adresa pro korespondenci

Prof. MUDr. Aleš Ryška, Ph.D.

Fingerlandův ústav patologie LF UK a FN

HRADEC KRÁLOVÉ

e-mail: ryskaale@fnhk.cz