Imúnne podmienené hemolytické anémie novorodencov − patofyziológia a diagnostika

ÚVOD

Anémia u novorodenca je všeobecne definovaná ako patologický stav zníženej koncentrácie hemoglobínu (Hb) pod referenčnú hodnotu pre daný postnatálny vek. V klinickej praxi je zaužívaná klasifikácia anémií podľa príčiny, ktorá ich delí na anémie z nedostatočnej tvorby a anémie z nadmerného zániku erytrocytov. Narušená tvorba erytrocytov môže súvisieť s poruchou na úrovni jednotlivých komponentov červenej krvinky (erytrocytárna membrána, enzymatický systém, hemoglobín), alebo má svoj podklad v nedostatočnej funkcii kostnej drene (aplastické a hypoplastické anémie). Nadmerný zánik erytrocytov je výsledkom viacerých vonkajších (extrakorpuskulárnych) a vnútorných (intrakorpuskulárnych) príčin.

Imúnne podmienené hemolytické anémie patria do veľkej skupiny extrakorpuskulárnych hemolytických anémií. Schopnosť indukovať hemolýzu má rôznorodá skupina protilátok namierených proti erytrocytárnym antigénom. Základným krokom v správnej diagnostike je potvrdenie prebiehajúcej hemolýzy a verifikácia jej imúnnej etiológie. Špecifikácia antierytrocytárnych protilátok následne vedie k spresneniu diagnózy a k určeniu správneho terapeutického postupu.

FYZIOLOGICKÁ HEMOLÝZA ERYTROCYTOV

Priemerná životnosť erytrocytu v cirkulácii je 100 až 120 dní. Starnutie erytrocytov sprevádza pokles ich enzymatickej aktivity, postupná inhibícia proteosyntézy a úbytok bunkových komponentov (mitochondrie, ribozómy). Prechod červenou pulpou sleziny navyše predstavuje pre erytrocyt metabolicky náročný proces, ktorý vedie k ďalšiemu poklesu energetických zásob vo forme adenozíntrifosfátu (ATP). Konečným dôsledkom deplécie energie je strata selektívnej permeability membrány erytrocytu a následná zmena bikonkávnej formy červenej krvinky na sférický tvar. Takto morfologicky zmenené erytrocyty strácajú schopnosť prechádzať úzkymi sínusmi sleziny, sú sekvestrované a fagocytované. Slezina predstavuje hlavné miesto fyziologickej hemolýzy, menšia časť prebieha v pečeni a kostnej dreni, približne len 20 % prebieha v intravaskulárnom priestore [8, 24].

Fagocytárne bunky podieľajúce sa na lýze erytrocytu obsahujú enzým hemooxygenázu, ktorý je zodpovedný za rozpad hemoglobínu na hém a globín. Globín je degradovaný na úroveň aminokyselín, ktoré sa môžu opätovne zapájať do syntézy globínových reťazcov. Konečným produktom metabolizmu hémovej skupiny je nekonjugovaný bilirubín, ktorý sa uvoľňuje z makrofágov do plazmy a po väzbe na albumín je transportovaný do pečene. V pečeni podlieha konjugácii s kyselinou glukurónovou, čím sa menia jeho biochemické vlastnosti. Z pôvodne hydrofóbnej zlúčeniny sa stáva polárna molekula dobre rozpustná vo vode. Konjugovaný alebo priamy bilirubín následne opúšťa pečeň ako súčasť žlče, v gastrointestinálnom trakte sa vplyvom baktérií mení na urobilinogén a je vylučovaný močom, stolicou, respektíve podlieha opäť enterohepatálnemu metabolizmu. Železo uvoľnené pri hemolýze erytrocytov je uskladňované v makrofágoch a následne transportované cez feroportín do plazmy, kde sa viaže na transferín [8, 10].

Za fyziologických podmienok len minimálna časť hemolýzy prebieha intravaskulárne, tento podiel sa zvyšuje až pri patologicky akcentovanej deštrukcii erytrocytov (imúnne podmienené anémie, mikroangiopatická hemolýza).

Dôsledkom intravaskulárnej hemolýzy je uvoľňovanie hemoglobínu priamo do prostredia plazmy. Organizmus disponuje viacerými mechanizmami, ktoré sú zamerané na reutilizáciu uvoľneného hémového železa a zároveň sú použiteľné v diagnostickom procese. Typickými predstaviteľmi sú plazmatické glykoproteíny haptoglobín a hemopexín, ktoré majú schopnosť viazať uvoľnenú hémovú skupinu a následne sú z obehu eliminované bunkami retikuloendoteliálneho systému. Pomocným systémom pre obnovu zásob železa je aj komplex methém-albumín, kde albumín zohráva funkciu nosiča a odovzdáva hémovú skupinu hemopexínu [10].

IMUNITNE INDUKOVANÁ HEMOLÝZA − PATOFYZIOLÓGIA

V patofyziológii imunitne indukovanej hemolýzy majú ústredné postavenie protilátky triedy IgM a IgG (zriedkavo IgA), ktoré sa viažu na povrchové antigény erytrocytov. Mechanizmus hemolýzy závisí od typu protilátky a prípadnej účasti komplementu.

Komplement je systém viac ako tridsiatich glykoproteínov, ktoré sú vzájomne zapojené do kaskády na seba nadväzujúcich lytických reakcií a je dôležitou súčasťou vrodenej nešpecifickej imunity. Vo všeobecnosti môže aktivácia komplementu prebiehať viacerými cestami. V imúnne mediovanej hemolýze má kardinálne postavenie najmä klasická cesta aktivácie komplementu. Naštartovať ju môže imunoglobulín triedy IgM, ktorý je hlavným zástupcom chladových imunoglobulínov s teplotným optimom menej ako 20 °C. Molekula IgM je schopná premostiť dva erytrocyty, čím sa na imunoglobulíne odkryje väzobné miesto pre C1q zložku. Po naviazaní C1q zložky nastáva jej konformačná zmena na C1r a C1s, vzniká aktivovaný komplex C1rs. Ten je schopný rozštiepiť C4 a C2 zložky komplementu a výsledkom sú fragmenty C4a, C4b, C2a, C2b. Následným spojením C4b a C2a vzniká C3 konvertáza, ktorá je schopná štiepiť C3 zložku. V tejto fáze komplementovej kaskády sa klasická cesta spája s ostatnými cestami aktivácie komplementu. V ďalšom kroku C3 konvertáza štiepi C3 na C3a (anafylatoxín) a C3b (opsonín). C3b sa viaže na C4bC2a a premieňa C5 na C5b fragment, ktorý v súčinnosti s C6 − C9 vedie k vzniku membránového útočného komplexu (MAC). Uvedený komplex (obr. 1) je schopný narušiť erytrocytárnu membránu, vytvoriť v nej póry, cez ktoré dochádza k efluxu bunkových komponentov, čoho výsledkom je osmotická lýza červených krviniek. Tento proces je charakteristický pre intravaskulárnu hemolýzu [13]. Vzniknuté zložky komplementovej kaskády C4a, C3a, C5a majú prozápalový, anafylaktický a prokoagulačný potenciál. Ich účinok sa typicky uplatňuje pri vzniku akútnej potransfúznej reakcie, šoku, DIC a renálnom zlyhaní. Procesy aktivácie komplementu prebiehajú pod neustálou kontrolou regulátorov CCP, tzv. complement control proteins. Úloha regulátorov spočíva v udržiavaní aktivácie komplementu v primeranom rozsahu [16].

Naproti tomu, protilátky triedy IgG (podtriedy IgG 1 − 4) majú schopnosť cestou senzibilizácie a čiastočnej aktivácie komplementu sprostredkovať extravaskulárnu hemolýzu. Dokážu vytvoriť komplex erytrocyt − protilátka IgG, ktorý je rozpoznaný a extrahovaný makrofágmi sleziny a pečene, kde následne dochádza k jeho cytotoxickej deštrukcii. Najvyššiu aktivitu dosahujú pri teplotnom optime 37 °C [16].

Imunitné hemolytické anémie môžeme vo všeobecnosti rozdeliť do viacerých kategórií, z ktorých každá má svoju etiológiu a špecifický patofyziologický mechanizmus. Hemolýza môže byť spôsobená tvorbou aloprotilátok proti„cudzím“ erytrocytárnym antigénom alebo produkciou autoprotilátok proti antigénom vlastných červených krviniek. Osobitnú skupinu predstavujú transplacentárne prenesené protilátky od matiek s autoimunitnými ochoreniami a liekmi indukované protilátky (tab. 1).

HEMOLYTICKÁ CHOROBA PLODU A NOVORODENCA

Hemolytická choroba plodu a novorodenca (HCHN), v literatúre tiež uvádzaná pod pojmom fetálna erytroblastóza je hematologické ochorenie charakterizované aloimunitnou hemolytickou anémiou vznikajúcou na podklade inkompatibility erytrocytárnych antigénov matky a plodu.

Prvotným stimulom je prestup fetálnych erytrocytov do krvného obehu matky. V prípade, že erytrocyty plodu nesú antigén, ktorý nemá matka vo svojej fenotypovej výbave, organizmus matky reaguje tvorbou špecifických protilátok. K fetomaternálnej imúnne podmienenej interakcii dochádza počas diagnostických a terapeutických výkonov (kyretáž, amniocentéza, odber choriových klkov), počas patologických stavov (abrupcia placenty, abortus, extrauterinné tehotenstvo) a cisárskeho rezu. Počas gravidity, a to najmä v 3. trimestri, dochádza k prestupu erytrocytov plodu do krvného obehu matky. Na aloimunizáciu postačuje len 0,1 ml fetálnych erytrocytov. Toto množstvo erytrocytov sa dostáva do krvného obehu matky aj počas fyziologického pôrodu. Keďže imunizácia matky prebehne až pri pôrode, dopad pre tento plod je klinicky bezvýznamný. Riziko predstavuje situácia, keď je senzibilizovaná matka opakovane tehotná a ďalší plod má rovnakú antigénovú výbavu ako predchádzajúci. Transplacentárny prestup materných protilátok môže viesť k závažnej hemolýze a k vzniku bilirubínovej encefalopatie [5, 21]. Transport materských protilátok je aktívny proces, ktorý je sprostredkovaný FcRn-receptormi placenty a dynamicky stúpa s blížiacim sa termínom pôrodu. V klinickej praxi je najvýznamnejšia inkompatibilita v Rh a ABO krvnom systéme [16]. Netreba však zabudnúť na inkompatibility v iných erytrocytárnych antigénnych systémoch, ako sú napr. Kell a Duffy [5].

Rh inkompatibilita predstavuje situáciu, keď Rh negatívna matka po predchádzajúcej senzibilizácii Rh antigénom vytvára protilátky triedy IgG proti Rh pozitívnemu plodu [21]. Riziko a závažnosť imunizácie závisí od množstva fetálnych erytrocytov a sila antigénnej odpovede stúpa s každou ďalšou inkompatibilnou graviditou. V prípade, že matka nebola doposiaľ senzibilizovaná, prvorodené dieťa má len minimálne riziko rozvoja hemolytickej choroby (menej ako 1 %). S každou ďalšou graviditou toto riziko stúpa [7]. Zaujímavou i keď raritnou je forma Rh imunizácie nazývaná syndróm babičky. Predstavuje situáciu, kedy počas tehotenstva alebo pôrodu dochádza k maternofetálnej hemorágii s následnou erytrocytárnou izoimunizáciou. Týmto spôsobom môže byť Rh negatívny plod ženského pohlavia prvýkrát imunizovaný svojou Rh pozitívnou matkou. V dospelosti počas tehotenstva je po strete s Rh antigénom plodu imunitná odpoveď rýchlejšia a závažná hemolýza sa prekvapivo objaví už pri prvej gravidite. K zníženiu výskytu ťažkých foriem hemolytickej choroby novorodenca pri Rh inkompatibilite prispeli preventívne opatrenia v zmysle podávania anti-D protilátok Rh negatívnym matkám, ktoré porodili Rh pozitívneho novorodenca [1, 5].

Aktuálne najčastejšou je aloimunizácia v ABO systéme. Najtypickejšia je u plodu s erytrocytárnym antigénom A alebo B, ktorého matka má krvnú skupinu 0. Zriedkavo môže vznikať v kombinácii A / B, respektíve B / A (matka verzus plod). Najväčšiu antigenicitu má A1 a najväčšou hemolytickou aktivitou sa vyznačujú anti-B protilátky. Prirodzene sa vyskytujúce protilátky anti-A a anti-B sú triedy IgM, čiže nie sú schopné transplacentárneho prechodu a nespôsobujú hemolýzu plodu. Za hemolytickú chorobu v ABO systéme sú zodpovedné aloprotilátky anti-A a anti-B, ktoré sú najčastejšie podtriedy IgG2. Vznikajú senzibilizáciou v priebehu predchádzajúcej gravidity, po transfúziách, ale aj vplyvom očkovacích vakcín s obsahom substancií antigénu A / B [5, 21]. ABO inkompatibilita spôsobuje miernejšiu formu HCHN, keďže substancie A a B sa nachádzajú vo fetálnych tkanivách a tekutinách a protilátky anti-A a anti-B sú neutralizované skôr, než vôbec zareagujú s antigénmi na erytrocytoch. Ďalším vysvetlením je, že expresia antigénov A a B na erytrocytoch plodu a novorodenca je omnoho nižšia než u dospelých jedincov. Hemolýza pri ABO inkompatibilite je väčšinou mierneho stupňa, intrauterinne je dobre kompenzovaná a zvyčajne ju nesprevádza kritická anemizácia [7]. Koincidencia Rh a ABO inkompatibility znižuje riziko Rh senzibilizácie, pretože erytrocyty s A alebo B antigénom sú z cirkulácie prednostne eliminované [21].

V rámci ABO systému predstavuje zriedkavý variant fenotyp Bombay, ktorý môže byť zodpovedný za závažnú potransfúznu hemolytickú reakciu pri nesprávne určenej krvnej skupine. Ako je všeobecne známe, krvná skupina 0 sa síce vyznačuje absenciou antigénu A a B, ale na erytrocytárnom povrchu má antigén H, ktorý je prekurzorom v tvorbe A a B antigénov. V prípade Bombay variantu je porušená tvorba H antigénu a pacient vykazuje pri štandardných testoch fenotypické znaky krvnej skupiny 0, i keď v genotype môže mať determinovanú krvnú skupinu A, B, alebo AB. Donorom transfúzie pre pacienta s potvrdeným Bombay variantom môže byť len ďalší jedinec s Bombay fenotypom. Incidencia sa v Európe odhaduje na 1 : 1 000 000 [17].

TRANSFÚZNA HEMOLYTICKÁ ANÉMIA

Transfúzne reakcie môžeme klasifikovať podľa viacerých kritérií. Z časového hľadiska ich delíme na akútne, ktoré sa prejavia v priebehu 24 hodín po podaní, a neskoré, ktoré sa manifestujú po 24 hodinovom časovom intervale. V kontexte možnej deštrukcie erytrocytov ich členíme na hemolytické a nehemolytické [5]. Príčinou ich vzniku je podanie inkompatibilnej transfúzie zlyhaním ľudského faktora, alebo prítomnosť slabej protilátky, ktorú nemožno zistiť v čase realizácie krížovej skúšky. Definuje ich zrýchlená deštrukcia darcovských erytrocytov, erytrocytov príjemcu alebo oboch v dôsledku naviazaných protilátok. Tie môžu byť pôvodom z plazmy príjemcu a reagovať s antigénmi darcovských erytrocytov, alebo opačne z plazmy darcu a interagovať s antigénmi erytrocytov príjemcu [22].

Nevyhnutným predpokladom bezpečného a nekomplikovaného podania transfúzie u novorodencov je medicínsky správne naplnenie indikačných kritérií. Štandardom je dôsledné dodržiavanie procedurálnych postupov. Najčastejšou príčinou potransfúznej hemolýzy je podanie inkompatibilnej transfúzie v systéme ABO, čo prakticky znamená podanie inkompatibilných erytrocytov pacientovi s prirodzenými pravidelnými protilátkami anti-A, anti-B, ktoré sú triedy IgM. Prvotné príznaky nie sú špecifické, ale klinický obraz môže byť už po podaní pár mililitrov transfúzie alarmujúci. V klinickom obraze dominuje nepokoj, triaška, potenie, nauzea, zvracanie, tachypnoe a dyspnoe. Opatrnosť, dôsledný monitoring klinického stavu a vitálnych funkcií je u novorodencov zvlášť dôležitý. Všímame si vzostup telesnej teploty, zmeny sfarbenia kože (erytém, bledosť, krvácavé prejavy) a rozvíjajúce sa príznaky šoku. V rámci diagnostiky je potrebné odlíšiť iné komplikácie krvných transfúzii, ktoré sú relatívne častejšie a môžu sa prezentovať rovnakými klinickými príznakmi. Príkladom je septický šok spôsobený bakteriálnou kontamináciou transfúzie [5, 22].

Neskorá hemolytická transfúzna reakcia vzniká následkom sekundárnej odpovede u primárne imunizovaného pacienta. Najčastejšie sú za neskorú transfúznu hemolytickú reakciu zodpovedné IgG protilátky v systéme Rh, Kidd, Kell, Duffy. Hemolýza je väčšinou extravaskulárna a jej klinické príznaky sú miernejšie a menej závažné. Typická je teplota neznámeho pôvodu a všeobecné príznaky anémie. Na neskorú hemolytickú anémiu treba myslieť v prípade poklesu Hb a rozvoja ikteru u pacienta s anamnézou transfúzie, ktorá bola podávaná pred niekoľkými dňami až mesiacom. Podozrenie z imúnnej hemolýzy môže byť častokrát vyslovené len na základe laboratórnych výsledkov [18, 22].

AUTOIMUNITNÉ HEMOLYTICKÉ ANÉMIE

Autoimunitné ochorenia sú diagnostickou a terapeutickou výzvou vo všetkých odboroch medicíny a výnimku nepredstavuje ani oblasť pediatrickej hematológie. V etiopatogenéze autoimunitných hemolytických anémií (AIHA) je kľúčovým momentom strata imunologickej tolerancie voči antigénom exprimovaným na povrchu erytrocytov. Na tomto procese sa podieľajú tri základné mechanizmy: porucha prezentácie autoantigénov imunokompetentným bunkám, porucha indukcie tolerancie T-lymfocytov voči autoantigénom a indukcia tvorby protilátok B-lymfocytmi [3].

Autoimunintné hemolytické anémie sú podmienené prítomnosťou protilátok proti erytrocytárnym antigénom, pôsobením ktorých dochádza k predčasnejlýze inak zdravých erytrocytov [8]. Táto skupina anémií je asociovaná s HLA antigénmi II. triedy a hemolýza vzniká najmä na podklade prítomnosti protilátok triedy IgM a IgG. V závislosti od druhu protilátky prebieha hemolýza v rôznych teplotných podmienkach a v rôznom prostredí (intravaskulárne alebo extravaskulárne) [20]. V novorodeneckom období života predstavuje AIHA extrémne vzácnu diagnózu s ročným výskytom 1 : 80 000 živonarodených novorodencov [11].

Pre potreby klinickej praxe postačuje základné rozdelenie AIHA na primárnu (idiopatickú) a sekundárnu − ktorá je asociovaná s imunodeficienciami, autoimunitnými a infekčnými ochoreniami. Z primárnych AIHA anémií sa môžeme v klinickej praxi stretnúť s teplotnou w-AIHA (warm antibody autoimunne hemolytic anemia), ktorá je sprostredkovaná IgG protilátkou a je zodpovedná za extravaskulárnu hemolýzu. Vo väčšine prípadov sa príčina poruchy imunitného systému nezistí a uzatvorí sa ako idiopatická. Príčinou AIHA je zmena imunitnej regulácie, častokrát vplyvom vírusových, bakteriálnych a parazitárnych agensov. V prípade hemolýzy v dôsledku chladových protilátok hovoríme o chorobe chladových aglutinínov. Chladové aglutiníny sú imunoglobulíny aglutinujúce červené krvinky v teplotnom optime 3 − 4 °C. Chladové IgM sa pri nízkych teplotách viažu na bunkový povrch erytrocytu, s následným rozbehnutím klasickej komplementovej dráhy [2]. Ochorenie je v novorodeneckom veku raritné, ale v prípade ak sa vyskytne, má akútny priebeh a sprevádza infekcie vyvolané Mycoplasma pneumoniae, EBV alebo VZV. Mycoplasma pneumoniae pravdepodobne adheruje na membránu erytrocytu a mení jeho antigénnu štruktúru smerom k väčšej imunogenecite. Nástup hemolýzy je typický v 3. týždni ochorenia [12].

Liekmi indukovaná imúnna hemolytická anémia je pomerne zriedkavá, avšak je známych viac ako 150 liečiv, ktoré ju môžu spôsobiť. Častokrát sú to bežne používané lieky ako napr. penicilín, cefalosporínové antibiotiká, či nesteroidné antiflogistiká. Vznik liekmi indukovanej hemolýzy možno vysvetliť niekoľkými mechanizmami, z ktorých najvýznamnejším je produkcia špecifických IgG protilátok voči jednotlivým liečivám. V ďalšom kroku dochádza k naviazaniu týchto protilátok na povrch erytrocytov a takto „označené“ erytrocyty sú bez účasti komplementu odstraňované makrofágmi sleziny [6].

V prípade postihnutia aspoň dvoch krvných radov (autoimunitná hemolytická anémia, autoimunitná neutropénia alebo trombocytopénia) je v diferenciálno-diagnostickom procese nutné zvážiť diagnózu Evansovho syndrómu. Prvé zmienky o tomto ochorení pochádzajú z roku 1951, kedy Robert Evans popísal v jednej nozologickej jednotke idiopatickú trombocytopenickú purpuru (ITP) a AIHA s teplotnou IgG protilátkou. Autoprotilátky proti jednotlivým krvným bunkám sú špecifické a nereagujú skrížene. Pacienti vykazujú všeobecné prejavy anemického syndrómu a v dôsledku trombocytopénie sa na koži a slizniciach objavujú krvácavé prejavy. V rámci diferenciálno-diagnostickej úvahy je potrebné zvážiť napr. trombotickú trombocytopenickú purpuru (TTP) alebo Kasabach-Merittovej syndróm. Tieto ochorenia musia byť čo najskôr vylúčené, keďže terapeutický prístup v ich liečbe je odlišný [9, 14].

Ďalšou raritnou príčinou hemolytickej anémie novorodenca je novorodenecký lupus. Ochorenie rovnako ako aj samotná hemolýza je len tranzitórné, keďže vzniká na základe pasívneho transplacentárneho prenosu materských protilátok (Ro/SSA La/SSB). Incidencia je pomerne nízka, postihuje približne 2 % novorodencov matiek so SLE [4].

ZÁKLADY IMUNOHEMATOLOGICKÉHO TESTOVANIA

V diagnostike imúnne mediovanej anémie majú dôležité postavenie Coombsove testy, ktoré označujeme za základné testy imunohematológie. V klinickej praxi sa používajú jeho dve varianty, na základe ktorých sme schopní jednoducho preukázať prítomnosť erytrocytárnych protilátok vo vyšetrovanej pacientskej vzorke krvi. Priamy antiglobulínový test (PAT), priamy Coombsov test, tiež uvádzaný ako DAT (direct antiglobulin test) slúži na dôkaz prítomnosti antierytrocytárnej protilátky, alebo zložky aktivovaného komplementu, ktorá je naviazaná na membráne erytrocytu. Používa sa k diagnostike imunitne podmienených hemolytických anémií, ako je napríklad hemolytická choroba plodu a novorodenca, potransfúzne hemolytické anémie a autoimunitné hemolytické anémie. Počas testu za pomoci antiglobulínového séra, tzv. anti-humánneho globulínu (AGH) možno preukázať in vivo senzibilizáciu erytrocytov [15]. Ako je známe, IgM protilátky vďaka svojim molekulárnym vlastnostiam veľmi jednoducho aglutinujú susedné erytrocyty. Naopak protilátky IgG to za obvyklých podmienok nedokážu. Základom vyšetrenia je tak pridanie AGH činidla k vyšetrovaným erytrocytom pacienta, ktorý je schopný premostiť a následne aglutinovať susedné erytrocyty s naviazanou (najčastejšie IgG) protilátkou. K vyšetreniu PAT možno použiť polyšpecifické, alebo monošpecifické testovacie činidlo. Vo väčšine laboratórií sa najskôr používa polyšpecifické, ktoré deteguje IgG alebo C3 zložku komplementu. V prípade, že je polyšpecifický PAT pozitívny, pristúpi sa k vyšetreniu monošpecifickým AGH na presnú identifikáciu naviazanej molekuly. Monošpecifický AGH obsahuje anti-IgG, alebo anti-C3d, anti-IgM, anti-IgA, anti-C3b [14, 15].

K realizácii vyšetrenia sa používa vzorka krvi odobratá do skúmavky s antikoagulačným činidlom EDTA (kyselina etyléndiamínotetraoctová). Vyšetrované erytrocyty pacienta sa pred samotným pridaním AGH premývajú fyziologickým roztokom, čím sa odstránia voľné protilátky a komplement, ktoré by sa počas testu mohli na naše diagnostické sérum vyviazať a skresliť tak jeho výsledok (PAT falošne negatívny). Z rovnakého dôvodu je nutné okamžité spracovanie vzorky. Následne sledujeme silu aglutinácie erytrocytov, ktorá sa hodnotí od 0 do 4+. Vyšetrenie sa realizuje najčastejšie pri izbovej teplote, ale pri podozrení na aktivitu protilátky závislú od teploty testujeme vzorku v rôznom teplotnom rozmedzí, od 0 – 37 °C [8]. Existuje niekoľko metód realizácie PAT. Aktuálne je najčastejšie používanou metóda stĺpcovej aglutinácie za pomoci skúmaviek v plastovej karte. Mikroskúmavky sú tvorené reagenčnou komôrkou s gélovým stĺpcom, ktorý pôsobí ako filter. Neaglutinované erytrocyty prechádzajú pozvoľne na dno skúmavky narozdiel od aglutinátov krviniek, ktoré sú zadržiavané v rôznej výške gélového stĺpca, na základe čoho hodnotíme silu PAT. Priamy Coombsov test môže odhaliť imunizáciu pacienta skôr, než je hemolýza erytrocytov klinicky zrejmá [14, 15].

Nepriamy antiglobulínový test NAT alebo IAT (indirect antiglobulin test) sa používa na dôkaz voľných protilátok cirkulujúcich v plazme pacienta. Nepriamy antiglobulínový test je založený na detekcii reakcie antigén verzus protilátka in vitro. V klinickej praxi ho využívame na detekciu protilátok u tehotných a v rámci predtransfúznych vyšetrení. Test pozostáva z dvoch krokov. V prvej polovici testovania sú premyté nepacientske erytrocyty s vopred známymi antigénmi inkubované so sérom pacienta. Ak sú v pacientskom sére prítomné protilátky voči antigénom erytrocytov, nastane vyviazanie protilátok na ich povrchu. V ďalšom kroku sa erytrocyty premývajú s izotonickým fyziologickým roztokom (3 − 4x) za účelom odstránenia nenaviazaných protilátok. Následne pridávame známe Coombsovo činidlo AGH a sledujeme prípadnú aglutináciu [10]. Nepriamy antiglobulínový test sa používa na preukázanie prítomnosti slabých nekompletných protilátok. Metóda stĺpcovej aglutinácie obchádza premývaciu fázu. V dolnej časti mikroskúmavky je gélová matrix s anti-IgG, v hornej prebieha inkubácia. Pri centrifugácii sa kvôli vyššej špecifickej váhe dostávajú rýchlejšie do spodnej gélovej časti erytrocyty než nenaviazané IgG [19].

DIAGNOSTICKÝ POSTUP

Vyšetrovací postup hemolytickej choroby plodu a novorodenca je v oblasti perinatológie a neonatológie dlhodobo precízne spracovaný. Nasledovný algoritmus sa týka diagnostiky raritných autoimunitných hemolytických anémií. Osnovu týchto vyšetrení primárne tvoria dostupné vyšetrenia, na ktoré nadväzujú špecializované imunohematologické testy. Dôležitá je logická následnosť jednotlivých vyšetrení. V prvom kroku je dôležité detegovať prebiehajúcu hemolýzu a potvrdiť jej imúnny podklad (schéma 1). Indikačné spektrum a interpretácia laboratórnych výsledkov je v kompetencii detského hematológa v súčinnosti s neonatológom. Pre správnu terapiu je kauzálne zadefinovanie anémie ako nozologickej jednotky v skupine AIHA [23].

Anamnesticky pátrame po prekonaných infekciách, užívaných liekoch a koincidencii autoimunitných ochorení v rodine. Vo vyšetrení krvného obrazu pacienta so suponovanou diagnózou AIHA je prítomný rôzny stupeň anémie, ktorá je sprevádzaná zvýšenou retikulopoézou. Výnimku tvoria stavy, keď primárny inzult zapríčinil inhibíciu erytropoézy, respektíve vzniknuté autoprotilátky majú potenciál interagovať s progeniterovými bunkami červenej krvnej rady. V krvnom obraze je väčšinou prítomná leukocytóza s neutrofíliou pri normálnom počte trombocytov. Zriedkavo môže byť prítomná leukopénia s miernym poklesom trombocytov a v prípade, že je trombocytopénia výrazná, v úvahu pripadá Evansov syndróm. Vtedy je nutné vyšetrenie antitrombocytárnych protilátok a v rámci diferenciálnej diagnostiky treba zvažovať aj TTP [14].

Typickým laboratórnym nálezom hemolýzy je elevácia nekonjugovaného bilirubínu, laktátdehydrogenázy (LD) a pokles hladiny haptoglobínu, ktorý sa spotrebúva na odstraňovanie hemoglobínu uvoľneného do plazmy počas intravaskulárnej hemolýzy. Keďže haptoglobín je reaktant akútnej fázy, jeho zvýšené hodnoty pozorujeme v prípade prebiehajúcej infekcie a zápalu. Prítomnosť hemosiderínu v moči je možné preukázať už 1 týždeň po epizóde intravaskulárnej hemolýzy. Základný biochemický skríning (glykémia, ionogram, urea, kreatinín, celkové bielkoviny, albumín, hepatálne parametre, priamy a nepriamy bilirubín) dopĺňame o vyšetrenie infekčných serológii alebo metódu PCR (Mycoplasma pneumoniae, EBV, CMV, hepatitídy, ...). V prípade podozrenia na neonatálny lupus realizujeme vyšetrenie antinukleárnych protilátok. Za účelom vylúčenia korpuskulárnej hemolytickej anémie dopĺňame súbor základných vyšetrení o krvný náter, stanovenie aktivity erytrocytárnych enzýmov, testy autohemolýzy, ELFO hemoglobínu a molekulárne genetické vyšetrenia [3, 23].

Pre potvrdenie imúnnej hemolýzy je kľúčové vyšetrenie PAT, najskôr polyšpecifickým AGH, ktorý obsahuje anti-IgG a anti-komplement. Následne sa vyšetruje monošpecifický PAT so zameraním na IgG samostatne a C3d zložku komplementu, ktorá svedčí o naviazaní IgM. Vzhľadom na teplotné vlastnosti protilátok jednotlivých typov AIHA, PAT realizujeme v rôznych teplotných podmienkach. Najčastejšia w-AIHA s teplotnou IgG protilátkou vykazuje pozitivitu PAT testu pri izbovej teplote 37 °C, chladová AIHA spôsobená IgM fixuje komplement pri nižších teplotách. V prípade, že je PAT s anti-C3d pozitívny a anti-IgG negatívny, treba určiť, či ide o chladovú IgM alebo IgG Donath-Landsteinerovú autoprotilátku (Donath-Landsteinerov test, DLT). DLT test slúži na dôkaz bifázických protilátok, ktoré sa viažu na erytrocyty pri nízkych teplotách a schopnosť hemolýzy získavajú až pri teplote tela. Literatúra uvádza, že až v 10 % prípadov AIHA je PAT negatívny. Príčinou môže byť koncentrácia naviazaných IgG na erytrocytoch, ktorá je pod prahom citlivosti jednotlivých činidiel alebo protilátky triedy IgA, ktoré nemožno dokázať bežnými komerčnými testami [14, 23].

Schéma 1. Základný diagnostický algoritmus AIHA [upravené podľa 23]

ZÁVER

Imúnne hemolytické anémie tvoria pomerne rôznorodú skupinu ochorení, ktoré navzájom spája zapojenie imunitných mechanizmov do procesov hemolýzy. Na priebehu samotnej deštrukcie erytrocytov sa najčastejšie podieľajú aloalebo autoprotilátky z tried IgG a IgM, častým je zapojenie jednotlivých zložiek komplementu. Jednotlivé typy protilátok a prípadná participácia komplementu determinujú aj prevažujúci spôsob hemolýzy. Klinický obraz a závažnosť ochorenia sa môže meniť od inaparentných foriem až po život ohrozujúce anemizácie. Náhly a kritický pokles hemoglobínu predstavuje v neonatológii urgentnú situáciu, ktorá si vyžaduje adekvátny diagnostický prístup pre možný vývoj imúnne mediovanej anémie. Okrem všeobecne známej hemolytickej choroby plodu a novorodenca sú do tejto skupiny zaradené aj zriedkavejšie ochorenia, ktoré kladú vysoké nároky na senzitivitu a špecificitu jednotlivých imunohematologických vyšetrení. Absolútnym základom vyšetrení naďalej zostáva realizácia Coombsových testov s cieľom primárnej detekcie antierytrocytárnych protilátok.