Nanočástice jako nosiče léků přes hematoencefalickou bariéru –  naděje pro léčbu neurodegenerativních onemocnění v budoucnosti?

Souhrn

Neurodegenerativní onemocnění, mezi něž patří např. Alzheimerova a Parkinsonova nemoc, se kvůli své neustále se zvyšující prevalenci a nedostupnosti efektivní léčby staly jedním z nejpalčivějších problémů moderní medicíny. Ačkoli existují látky s potenciálním terapeutickým účinkem, hematoencefalická bariéra vytváří účin­nou překážku pro transport léků do centrálního nervového systému. Naději pro vyřešení tohoto problému přinesl nástup nanotechnologií umožňujících přípravu částic s přesně navrženými vlastnostmi pro překročení hematoencefalické bariéry. Širokému využití nanočástic pro transport léků brání nedostatečné zmapování jejich bio­logických vlastností a bezpečnostních rizik. Pokrok v této oblasti společně s rostoucím porozuměním patogenezi neurodegenerativních onemocnění by v budoucnu mohl vést k nalezení jejich efektivní léčby.

Klíčová slova:
hematoencefalická bariéra – dendrimery – lipozómy – nanotuby – uhlík – nano-částice – neurodegenerativní onemocnění

Úvod

Neurodegenerativní onemocnění se vyznačují masivním odumíráním neuronů spojeným s akumulací patologické formy proteinu specifického pro konkrétní onemocnění v mozkové tkáni (Alzheimerova nemoc –  beta-amyloid a hyperfosforylovaný protein tau, Parkinsonova nemoc –  alfa-synuklein, Creutzfeldtova-Jakobova choroba –  prionový protein PrP^TSE, frontotemporální lobární degenerace –  tau protein nebo protein TDP-43, aj.).

Abnormální protein vzniká změnou konformace nativního proteinu, při níž dochází k nahrazení sekundární proteinové struktury obsahující alfa šroubovice (helixy) strukturou beta skládaného listu. Vytváří se „cross beta helikální“ struktura, která je rezistentní vůči proteolytickému štěpení a agreguje za vzniku amyloidových fibril [1,2]. Pokud se během vzniku a následné kontroly kvality proteinů v endoplazmatickém retikulu (ER) vyskytne špatně sbalený, nesbalený nebo abnormální protein, dochází ke spuštění dráhy degradace spojené s ER (Endoplasmic Reticulum As­sociated Degradation; ERAD). Chaperon BiP (im­munoglobulin heavy-chain bind­ing protein) rozpozná špatně sbalené, popř. abnormální proteiny a umožní jejich transport do cytozolu, kde jsou ubikvitinovány a degradovány v proteazómu. Neodstraní-li tato dráha abnormální proteiny, dochází k jejich akumulaci, stresu ER a aktivaci dráhy buněčné odpovědi na nesbalené proteiny (Unfolded Protein Response; UPR).

Aktivace části nebo celé této dráhy byla shodně pozorována u Alzheimerovy nemoci (AN), Parkinsonovy i Creutzfeldtovy-Jakobovy nemoci [3]. U AN v této dráze hraje zřejmě důležitou úlohu karboxy-terminální fragment-β (C99, též CTFβ), který vzniká štěpením prekurzorového proteinu beta-amyloidu a inhibuje ERAD dráhu a proteazomální degradaci, což vede k jeho transportu do lyzozomu. Pokud dojde i k poškození lyzozomu, jsou abnormální proteiny transportovány na buněčný povrch [4– 6] a dochází ke vzniku amyloidových plak, které jsou barvitelné pomocí Kongo červeně nebo thioflavinu T [7,8]. Současný výzkum naznačuje, že nejvíce toxické jsou pro buňky oligomery abnormálního proteinu, ale přesný mechanizmus jejich toxicity není znám [9,10].

S narůstajícím stárnutím populace se výrazně zvyšuje výskyt zejména AN, pro kterou, stejně jako pro další neurodegenerativní onemocnění, neexistuje kauzální léčba. Symp­tomatickou terapii AN zahrnují inhibitory acetyl-cholinesterázy (donepezil, rivastigmin nebo galantamin) a nekompetitivní antagonisté N-metyl-D-aspartátových (NMDA) glutamátových receptorů (memantin). K nadějným (ale zatím rutin­ně nedostupným) strategiím léčby AN patří inhibitory β- a γ-sekretázy, inhibitory zabraňující tvorbě amyloidových agregátů či imunoterapie cílená proti beta-amyloidu (Aβ42), anebo proteinu tau. Při léčbě Parkinsonovy nemoci slouží jako léky první volby levodopa prostupující přes hematoencefalickou bariéru (HEB) do mozku, kde je dekarboxylována na dopamin. Problémy s využitím těchto léků souvisí především s účin­ností transportu přes HEB, nežádoucími účinky (trávicí obtíže u inhibitorů acetylcholinesterázy, levodopou indukované dyskineze, možná toxicita vůči nervovým buňkám) nebo zvýšenou rychlostí odstraňování z krevního oběhu [11– 14]. Naději pro řešení těchto problémů představují cíleně modifikované nanočástice sloužící jako distributory léků přes HEB [15– 17].

Struktura HEB a hlavní transportní mechanizmy

Centrální nervový systém (CNS) je od zbytku organizmu oddělen HEB, která udržuje stálé vnitřní prostředí a zároveň brání vniku cizorodých a potenciálně škodlivých látek. HEB je tvořena jednou vrstvou endotelových buněk, které jsou mezi sebou spojeny těsnými a adherentními spoji. Endotelové buňky jsou v apikální části mezibuněčného prostoru propojeny do tzv. těsného spoje prostřednictvím transmembránových proteinů: klaudinů, okludinů a cytoplazmatických proteinů. V bazolaterální části mezibuněčného prostoru dochází k propojení buněk pomocí proteinů kadherinu, integrinů a s nimi asociovaných proteinů za vzniku adherentního spoje. Těsný spoj spolu s adherentním určují fyzickou bariérovou funkci HEB a jejich narušení vede ke zvýšené propustnosti HEB pro cizorodé látky. Do vrstvy endotelových buněk vybíhají pericyty a axonální patky astrocytů, jež spolu s endotelovými buňkami určují, pro které molekuly bude HEB propustná a pro které nikoliv [18– 20].

Výsledkem těchto interakcí je semi-permeabilní bariéra, která propouští pouze:

• a) malé molekuly (O₂, CO₂, H₂O);
• b) malé, lipofilní molekuly o maximální velikosti 400– 600 Da (steroidní hormony jako kalcitriol, aj.), které volně difundují přes plazmatickou membránu endotelových buněk [21,22].

Pro ostatní molekuly, které nesplňují tyto podmínky a jsou nezbytné pro zajištění výživy CNS, existují přenašeče. Transport glukózy zajišťují přenašeče rodiny GLUT (-1, -3, -4, -5 ad.) usnadněnou difúzí. Přenašeče pro ně­kte­ré aminokyseliny, organické kyseliny nebo nukleotidy jsou obvykle spřaženy s transportem specifických iontů. Makromolekuly (inzulin, transferin ad.) bývají transportovány receptorem zprostředkovanou trans­cytózou přes cytoplazmu endotelových buněk. Export odpadních produktů metabolizmu nebo molekul, které by v nadměrném množství mohly fungovat neurotoxicky (glutamát), či různých cizorodých látek zajišťují specifické přenašeče z rodiny ABC proteinů obsahující ATP vazebnou kazetu. Patří sem transportéry skupiny ABCA (např. ABCA1 –  zajišťuje odstraňování cholesterolu ad.) [23 24], ABCB (ABCB1 –  p-glykoprotein 1, který je odpovědný za export xenobio­tik, steroidů ad.), ABCC, ABCG (ABCG2 –  protein rezistence rakoviny prsu (Breast Cancer Resistance Protein; BCRP) zajišťující rovněž export xenobio­tik, flavonoidů či porfyrinů) atd. [25]. Přenos organických aniontů a kationtů zajišťuje skupina transportérů rozpuštěných látek (Solute Car­rier; SLC), mezi které patří transportéry organických kationtů (Organic Cationt Transporter; OCT) a transportéry organických aniontů OAT, které odpovídají za vstup a výstup živin, neurotransmiterů, metabolitů a toxinů z resp. do buněk [26,27].

Tento propracovaný systém přenašečů aktivně transportuje většinu léků procházejících přes HEB zpět do krve a je hlavní příčinou problému cílené dopravy léků do CNS a tvoří základ tzv. mnohočetné lékové rezistence. Po dlouhou dobu byl CNS považován za kompletně imunoprivilegovaný orgán. Nejnovější výzkumy však odhalily přítomnost lymfatických cév, které přemosťují HEB a umožňují vstup imunitních buněk z těla do CNS [28]. To ale nemění nic na faktu, že překonání komplexního systému HEB je velká výzva pro současný výzkum zaměřený na cílený transport léků do CNS.

Nanočástice –  koncept trojského koně

Limitovaná propustnost HEB pro řadu léků, které nesplňují požadavky pro transport do CNS (velikost nad 400 Da, nedostatečná hydrofobicita aj.), vede ke snaze o navržení alternativní strategie transportu. Jednou z možností je využití nanočástic jako tzv. trojského koně. V tomto konceptu dojde k připojení nebo zabalení léku do nanočástice s cíleně navrženými vlastnostmi umožňujícími přechod přes HEB. V dalším kroku se nanočástice s lékem dostávají do cílových buněk, kde následně dojde k uvolnění léku do tkáně.

Agregace nanočástic a jejich interakce s proteiny v organizmu

Nanočástice jsou definovány jako velmi malé částice, jejichž jeden rozměr je menší než 100 nm. Hydrofobicita mnohých nanočástic (uhlíkové nanotuby, ně­kte­ré dendrimery aj.) snižuje jejich rozpustnost ve vodných roztocích a v tělních tekutinách. To má za následek jejich agregaci a tvorbu shluků. Minimalizace tvorby shluků a zvýšení rozpustnosti lze dosáhnout zavedením funkčních skupin, např. -COOH, -NH₂, -SO₃H, na povrch nanočástic nebo jejich spojením s neiontovými kopolymery (pluronický F108, F127 aj.), které často snižují jejich toxické vlastnosti při dlouhodobém působení v okolí buněk [29– 31].

Po vstupu nanočástic do krevního řečiště nebo po jejich aplikaci do CNS dojde na základě elektrostatických a hydrofobních sil k navázání proteinů a dalších makromolekul krevní plazmy, resp. mozkomíšního moku na jejich povrch. Slabě navázané proteiny jsou vytěsňovány jinými a postupně se ustaluje jejich skladba za vzniku stabilního proteinového obalu, tzv. tvrdé korony. Konkrétní zastoupení jednotlivých proteinů v tvrdé koroně závisí ve větší míře na povrchových vlastnostech nanočástic, v menší míře pak na jejich velikosti [32]. Mezi nejvíce zastoupené proteiny krevní plazmy, např. u korony uhlíkových nanotub, patří fibrinogen, lidský sérový albumin, apolipoprotein A a imunoglobulin G [33].

Nabalováním dalších proteinů na vrstvu tvrdé korony vzniká tzv. měkká korona, jejíž složení se postupnou asociací a disociací proteinů ustálí do dynamické rovnováhy a dosáhne téměř stabilního složení [34]. Vznik proteinové korony a interakci nanočástic s proteiny krevní plazmy lze omezit funkcionalizací a inkubací nanočástic s ve vodě rozpustnými polymery, jako je polyetylen­glykol (PEG) [35,36]. Složení proteinové korony do velké míry ovlivňuje výsledky interakce nanočástic s buňkami a studium vlivu změn složení proteinové korony při průchodu HEB na funkční vlastnosti nanočástic představuje důležitý krok v jejich použití pro cílený transport léků do mozku.

Prostup nanočástic přes HEB

S přihlédnutím k architektuře a bariérové funkci HEB ovlivňuje celková velikost nanočástice nesoucí lék mechanizmus prostupu do CNS. Mezi možné cesty patří receptorem zprostředkovaná endocytóza (specifický ligand se váže na specifický receptor), adsorpcí zprostředkovaná endocytóza (pozitivní náboj ligandu interaguje s negativním nábojem na povrchu plazmatické membrány) a buňkou zprostředkovaná trans­cytóza (nanočástice jsou neseny monocytem či makrofágem; obr. 1) [37].

#obr:1#

Atraktivní je využití receptorem zprostředkované endocytózy [38,39]. Buňky HEB exprimují specifické receptory pro transport molekul uplatňujících se v metabolizmu CNS, jako je transferinový, inzulinový nebo lipoproteinový receptor [40]. Navázáním specifických ligandů na povrch nanočástic lze docílit receptorem zprostředkované endocytózy nanočástice a její následné transcytózy endotelovými buňkami [41,42].

Ně­kte­ré typy nanočástic se však po endocytóze hromadí v perinukleární oblasti endotelových buněk (obr. 2), nedokončují transcytózu a jsou buňkou směrovány do lyzozomu, kde nastává odbourávání funkčních skupin, dokud se neodhalí nefunkcionalizované jádro. Toto jádro buňky problematicky štěpí a vznikají toxické efekty [43] (příkladem mohou být uhlíkové nanotuby [39,44]). Dochází k indukci apoptózy a autofágie, při níž jsou nanotuby exportovány z buňky v autofagických váčcích [45]. Navázání IgG na nanočástice vede k jejich zvýšené fagocytóze buňkami imunitního systému, což nepříznivě ovlivňuje cirkulaci nanočástic v krevním řečišti [46]. Tento problém může být řešen např. konjugací nanočástic s PEG. PEG konjugované lipozómy neváží opsoniny z krve, a to jim umožňuje delší setrvání v krevním oběhu [47].

#obr:2# 

Uvolnění léku z nanočástice a její degradace

Po dosažení buněk cílové oblasti mozku je zapotřebí, aby došlo k uvolnění léku z nanočástice a její degradaci, popř. transportu zpět do krevního řečiště a vyloučení z těla bez poškození organizmu.

Společnou destinací většiny typů nanočástic je endozomální-lyzozomální systém, který degraduje buňce vlastní i cizorodé částice a je místem, v němž obvykle dochází k uvolnění léku z nanočástice [30,49,50]. Rychlost uvolňování léku se liší podle typu nanočástic a způsobu navázání léku. Např. u polymerních nanočástic závisí na prosté difúzi, která je ovlivněna složením polymeru a vlastnostmi léku. Kontrolované uvolňování léku může být zajištěno jeho uvolňováním spolu s degradací molekul polymerního obalu. Tak se lék může postupně uvolňovat i několik dní [51].

Po odhalení vlastního povrchu nanočástic tedy může docházet buď k jejich bio­degradaci (např. lipozomy), nebo k destabilizaci a následné destrukci lyzozomu (např. uhlíkové nanotuby [30]) či k transportu ven z buňky (např. polymerní nanočástice [52]) a dalšímu postupu krevním řečištěm.

Nanočástice využitelné pro přenos léků přes HEB

Lipozomy

Lipozomy vznikají z lipidů a fosfolipidů, které se na základě van der Waalsových sil a hydrofobních interakcí za specifických podmínek (pH, teplota, polarita média) spontán­ně uspořádávají do dvojvrstvy [53– 55].

Jejich výhoda spočívá v lipidovém materiálu, který je základním stavebním kamenem bio­logických membrán a je dobře odbouratelný. Nevýhodou těchto struktur je poměrně nízká stabilita, která může být zvýšena zavedením PEG do fosfolipidové dvojvrstvy (obr. 3A) [56]. Lipozomy nesoucí lék proti nádoru a konjugované s protilátkou proti transferinovému receptoru byly schopny prostoupit přes HEB a hromadit se v mozkové tkáni [57].

#obr:3#  

Pevné lipidové nanočástice

Pevné lipidové nanočástice vznikají z lipidových nanoemulzí se zakomponovanými glyceridy a vosky s vysokou teplotou tání (obr. 3B). Při pokojové teplotě dochází k jejich přechodu z tekutého stavu do pevného. Pro svou přirozenou hydrofobicitu musejí být hydrofilizovány např. PEG, polyvinyl alkoholem či chitozanem, čímž se minimalizuje nespecifická vazba proteinů a snižuje se jejich vychytávání RES.

Mezi výhody tohoto typu nanočástic patří fyzická stabilita a rozpustnost, kapacita pro přenos velkého množství léku a jeho pomalé uvolňování, nízká vazba opsonínů a nízký vliv na tvorbu trombů [58]. Pevné lipidové nanočástice konjugované s antidepresivním lékem venlafaxinem zvyšovaly transport tohoto léku do mozku bez indukce produkce p-glykoproteinu 1, který je odpovědný za intenzivní odstraňování venlafaxinu z mozku [59].

Dendrimery

Dendrimery jsou vysoce větvené polymery, které se připravují postupnou syntézou, při níž se k jádru váží další vrstvy větvených monomerů. Jádro dendrimerů může být tvořeno např. etylendiaminem (PAMAM dendrimery) [60] nebo iontem kovu (Cu²⁺, Pd²⁺, Pt²⁺, Ni²⁺, Fe³⁺ nebo Mn²⁺ [61]). Počet vrstev větvených monomerů obalujících jádro se nazývá generace (G0, G1, G2 a vyšší; obr. 3D). Tyto vrstvy jsou zakončeny „koncovou skupinou“, kterou může být aminová skupina propůjčující dendrimerům polykationtový náboj (PAMAM dendrimery), karboxylová skupina, peptid (peptidové dendrimery), aj. [62]. Například lék doxorubicin používaný pro léčbu nádorů neprochází přes HEB, protože je exportován z mozku p-glykoproteinem. Pokud byl doxorubicin konjugován s PAMAM dendrimery, zvyšovala se jeho akumulace v mozku až šestkrát (ve srovnání s volným doxorubicinem) [63].

Široké spektrum typů koncových skupin patří mezi největší výhody dendrimerů. Naopak jejich nevýhodou je vyšší toxicita stoupající s počtem vrstev (generací) [64].

Uhlíkové nanotuby

Uhlíkové nanotuby se díky svým výborným elektrickým vlastnostem dají využít v medicíně jako nanosenzory či nanosondy [65– 67]. Vznikají z jednovrstevné formy grafitu zvané grafén. Grafénový plát lze srolovat buď v jedné vrstvě za vzniku jednovrstevných nanotub (SWCNT; obr. 3C1), nebo ve více vrstvách, které jsou koncentricky uspořádány jedna do druhé za vzniku mnohovrstevných nanotub (MWCNT; obr. 3C2). Průměr nanotub kolísá od 10 do 100 nm a délka může dosáhnout až několik mikrometrů.

Uhlíkové nanotuby mají tyčinkovitý tvar, na jehož povrchu a dovnitř dutiny lze navázat velké množství molekul léku a transportovat je do mozku [44,68]. Karboxylované MWCNT modifikované PEG s konjugovaným ligandem angiopep-2 pro LRP receptor (Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein) dokáží prostoupit HEB a dopravit navázaný lék do cílového místa v mozku [69]. Přes tyto výhody uhlíkových nanotub nejsou stále uspokojivě vyřešeny problémy s jejich možnou toxicitou. Nemodifikované nanotuby mohou na svůj povrch adsorbovat životně důležité enzymy, jako je např. acetylcholinesteráza [68]. Navíc jsou obtížně degradovatelné a jejich hromadění v buňce může vést k jejímu poškození [44,70]. Například u krevních destiček zvyšují MWCNT prostup vápenatých iontů přes plazmatickou membránu a poškozují je [71,72]. Zavedení funkčních skupin, které naruší strukturu nanotub, může přispět k jejich účin­nější degradaci vnitrobuněčnými enzymy [43].

Uplatnění nanočástic v léčbě neurodegenerativních onemocnění

Současný stav výzkumu zaměřeného na využití nanočástic pro transport léků přes HEB ukazuje první úspěchy snah o transport nanočástic do cílových míst v mozku. Zhang et al využili tzv. dvojitého značení neboli zavedení dvou peptidů do povrchu polymerních nanočástic. První peptid byl složen ze specifické sekvence aminokyselin zvyšující prostup nanočástic přes HEB. Druhý peptid nesl specifickou sekvenci pro vazbu na Aβ_1– 42 v amyloidových depozitech. Takto připravené nanočástice byly schopny in vivo projít přes HEB a vázat se na amyloidové plaky [73]. Nanočástice však nebyly konjugovány s molekulou léku. V tomto případě pak vznikají další možnosti postupu výzkumu. První možností je pro dvojité značení použít nanočástice, které samy dokáží pracovat s patologickou formou abnormálního proteinu. Mezi takové nanočástice patří např. PAMAM a polypropyleniminové (PPI) dendrimery, které umí nejen inhibovat formování struktury beta skládaného listu [74], ale také účin­ně brání tvorbě fibril vzniklých agregací ně­kte­rých forem alfa-synukleinu, beta-amyloidu a prionového proteinu. Navíc rozrušují již vzniklé amyloidové fibrily [74,75]. Na druhou stranu při rozrušování amyloidových fibril alfa-synukleinu nedocházelo k jejich rozkladu na jednotlivé monomery, ale na jinou formu nerozpustných amorfních agregátů [74]. Podobně by mohly fungovat i uhlíkové nanotuby, neboť bylo ukázáno, že SWCNT na sebe dokáží nabalovat beta skládané listy molekul beta-amyloidu [76].

Druhou možností může být zakomponování molekul léku do vnitřku nanočástice a následné obalení nanočástic receptory pro dvojité značení. K tomuto účelu by mohly být vhodné třeba pevné lipidové nanočástice, ve kterých inkubací s tekutými lipidy vznikají nepřesnosti v krystalové struktuře. Tyto „mezery“ lze vyplnit molekulami léku, a zvýšit tak kapacitu nanočástice pro jejich množství. Tekuté lipidy navíc umožňují lepší rozpouštění lipofilních léků než pevné lipidy [58]. Konjugace nanokapsulí s lipidovým jádrem a konjugovaným indometacinem, který snižuje aktivaci mikroglií vzniklou v reakci na poranění (v tomto případě na akumulaci amyloidových depozitů), vedla po aplikaci beta-amyloidu (Aβ_1– 42) do transgen­ních myší pro AN ke snížení projevů zánětu a snížení aktivace mikroglií [77]. Konjugace SWCNT s acetylcholinem a jejich aplikace do žaludku myší vedla k transportu acetylcholinu do mozku a zvyšovala schopnost myší s AN učit se, a to až na úroveň zdravých jedinců [44].

Nanočástice lze také využít jako přenašeče malých inhibičních RNA schopných blokovat expresi genů zodpovědných za ně­kte­ré z dědičných forem neurodegenerativních onemocnění. Problém malých RNA je nízká účin­nost transfekce. Transfekce buněk a následná inhibice genů byla výrazně zvýšena, pokud jsou malé RNA transportovány do buněk prostřednictvím PAMAM dendrimerů [78,79].

Přes tyto povzbudivé výsledky bude zavedení nanočástic do běžné klinické praxe ještě nějakou chvíli trvat, především z důvodu nedořešené otázky jejich možné toxicity. Aplikace nanočástic ve zvířecích modelech byla často spojena s nežádoucími účinky, jako je genotoxicita, poškození plic a kardiovaskulárního systému. Kromě toho zbývá ještě dořešit i technické otázky efektivní konjugace molekul léku s nanočásticemi a zavádění ligandů/ receptorů do jejich povrchu [80– 82].

Závěr

Současný výzkum v oblasti neurověd přináší řadu nových poznatků o příčinách vzniku neurodegenerativních onemocnění, jako je Alzheimerova, Parkinsonova nebo Creutzfeldtova-Jakobova nemoc. Vzrůstající porozumění mechanizmům patogeneze těchto chorob by mělo vyústit ve vytvoření kauzálních terapeutických přístupů. Nedávné výsledky prokázaly, že transport léků přes HEB za pomocí nanočástic je možný, a to i pro takové léky, které ji za normálních podmínek nejsou schopné překročit. Nanočástice se tak mohou stát klíčovou součástí budoucí účin­né terapie. Další výzkum zaměřený na snížení jejich toxicity a snazší bio­degradaci by měl vést k jejich brzkému využití v klinické praxi.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

doc. Ing. Karel Holada, Ph.D.

Ústav imunologie a mikrobiologie

1. LF UK v Praze

Studničkova 7

128 00 Praha 2

e-mail: karel.holada@lf1.cuni.cz

Přijato k recenzi: 15. 6. 2015

Přijato do tisku: 19. 11. 2015