Funkce mitochondrií ve spermii u mužů s normozoospermií a astenozoospermií

Souhrn

Cíl studie:
Jednou z příčin mužské neplodnosti je snížená motilita spermií. Ukazuje se, že ve vývoji této poruchy může hrát roli snížená efektivita respirační aktivity mitochondrií. Cílem naší studie bylo komplexní stanovení respirační aktivity mitochondrií spermií s normální a sníženou pohyblivostí.

Typ studie:
Prospektivní studie.

Název a sídlo pracoviště:
Ústav histologie a embryologie, LF UK, Plzeň; Ústav fyziologie, LF UK, Plzeň; Institut reprodukční medicíny a endokrinologie, IVF Centrum Prof. Zecha, Plzeň.

Metodika:
Ejakuláty byly získány od 14 mužů z IVF Centra Prof. Zecha v Plzni. Podle klasifikace World Health Organization byli muži rozděleni do skupiny normozoospermatiků (n = 7) a astenozoospermatiků (n = 7). Respirační aktivitu spermií jsme měřili na dvoukanálovém oxygrafu Oroboros.

Výsledky:
V astenozoospermatických vzorcích byla nalezena signifikantně snížená aktivita komplexu I(p = 0,007), zvýšená respirace po aplikaci inhibitoru ATP-syntázy oligomycinu (ukazující na zvýšené rozpřažení oxidace a fosforylace; p = 0,046). Inhibice komplexu I rotenonem ukázala, že příspěvek komplexu I k celkové kapacitě oxidační fosforylace byl i u zdravých spermií relativně nižší, než je tomu typicky v somatických buňkách.

Závěr:
V naší studii jsme měřili respirační aktivitu mitochondrií lidských spermií permeabilizovaných digitoninem vysokoúčinnou oxygrafií, která umožňuje stanovení spotřeby kyslíku z nejmenšího možného množství zárodečných buněk. Výsledky studie potvrzují sníženou aktivitu komplexu I u astenozoospermatiků a naznačují, že na snížené pohyblivosti spermií by se mohl podílet i zvýšený únik protonů z mitochondriální matrix, který vede ke snížené efektivitě fosforylačního procesu. Lepší charakterizace mužských zárodečných buněk, ať zcela zdravých, či s postiženou motilitou, nám pomůže lépe pochopit proces fyziologického oplodnění a zároveň pomůže i ve výběru té nejvíce životaschopné spermie pro léčbu neplodnosti metodami asistované reprodukce.

Klíčová slova:
neplodnost – spermie – respirometrie

ÚVOD

Snížená plodnost je rostoucím problémem mužské populace ve fertilním věku. Androgenní faktor je zodpovědný přibližně za 50 % případů infertility [32], z 25 % jsou příčiny stále neznámé.

Jednou z častých příčin mužské neplodnosti je snížená motilita spermií – astenozoospermie [13, 14, 30, 32, 38]. Astenozoospermie je podle definice Světové zdravotnické organizace (WHO) definována jako: méně než 40 % spermií s progresivní a neprogresivní motilitou nebo méně než 32 % spermií s progresivní motilitou [39]. U spermie můžeme pozorovat dva druhy fyziologického pohybu – symetrický s nízkou amplitudou, kdy spermie udržuje rovný směr. Tento druh pohybu je viditelný v čerstvém ejakulátu a nazývá se aktivovanou motilitou. Druhým typem je tzv. hyperaktivovaná motilita, kdy se spermie pohybuje asymetricky s vysokou amplitudou a její pohyb je cirkulární [15, 35, 36, 37]. Oba druhy pohybů jsou závislé na dodávce energie ve formě ATP, který je získáván procesem oxidační fosforylace v mitochondriích nebo glykolýzou [9, 32].

Mitochondrie se ve zralé spermii nacházejí po dvojicích helikálně uspořádaných ve spojovacím oddílu, jedné ze tří zřetelných částí bičíku – spojovací (střední) oddíl, hlavní část a terminální konec [12]. Celkový počet mitochondrií v jedné spermii je jen 72 až 80 [2, 32]. Umístění mitochondrií je znázorněno na obrázku 1.

V somatických buňkách hrají mitochondrie ústřední roli v metabolických procesech a stanovení jejich aktivity je klíčové pro analýzu, diagnózu a případnou léčbu četných patologických stavů, které mitochondriální dysfunkce provázejí (např. neurodegenerativní, metabolická a zánětlivá onemocnění). Mitochondriální dýchací řetězec přenáší elektrony systémem proteinových komplexů (CI – CIV) umístěných na vnitřní mitochondriální membráně z NADH a FADH₂ na O₂ (oxidace). Činností některých komplexů dochází k pumpování protonů z mitochondriální matrix do intermembránového prostoru. Protonový gradient je pak využit k syntéze ATP (fosforylace). V modernějším pojetí jde o konvergentní systém přenašečů elektronů, kde uzlovým bodem je koenzym Q (obr. 2) [22].

Ve spermii byla mitochondrie dlouho opomíjenou organelou, nyní je však doloženo, že má klíčovou roli v mnohých fyziologických a patologických procesech [21, 25, 26]. Kromě produkce ATP nutného pro zajištění pohyblivosti spermie hrají mitochondrie významnou úlohu v regulaci zrání a životnosti spermií a regulaci osmotické a vápníkové homeostázy [21].

Mezi možné příčiny astenozoospermie z pohledu mitochondriální problematiky patří jednak jejich strukturální anomálie [19, 23], ale také jejich funkční porucha [6, 7]. Ukazuje se, že určitou roli u astenozoospermatických mužů by mohla hrát právě snížená účinnost respirační aktivity. Publikací na toto téma je zatím velice málo [7, 31], a proto také v současnosti není žádné polarografické vyšetření spotřeby kyslíku rutinně využíváno.

V naší studii jsme měřili mitochondriální respiraci celých permeabilizovaných spermií vysokoúčinnou oxygrafií, která umožňuje stanovení aktivity jednotlivých komplexů dýchacího systému postupně na témže vzorku. Ověřili jsme sníženou aktivitu komplexu I u astenozoospermatických vzorků [8]. Novým nálezem je zvýšená spotřeba kyslíku nutná především pro kompenzaci úniku protonů a udržení mitochondriálního membránového potenciálu, která může být důvodem nižší účinnosti produkce energie v méně pohyblivých spermiích.

METODIKA

Příprava vzorku

Ejakuláty byly získány od 14 mužů z IVF Centra Prof. Zecha v Plzni. Podle klasifikace World Health Organization byli muži rozděleni do skupiny normozoospermatiků (n = 7, průměrný věk 33,1 let) a astenozoospermatiků (n = 7, průměrný věk 36,7 let). Vzorek je vždy odebírán přímo v IVF centru, aby bylo pokud možno zcela eliminováno znehodnocení vzorku skladováním a transportem. Po zkapalnění (30 minut) je stanoven nativní spermiogram (podle kritérií WHO 2010). Dalším krokem je kapacitace vzorku pomocí gradientu roztoku médií Sperm Filter Medium (SFM, CRYOS, Německo) a Quinn´s Sperm Washing Medium (QSWM, SAGE, USA). Sperm filter medium je naředěno na 90 % (0,15 ml QSWM: 1,35 ml SFM), 70 % (0,09 ml QSWM: 0,21 ml SFM) a 50 % (0,15 ml QSWM: 0,15 ml SFM). Do kónické zkumavky je na sebe postupně navrstveno 1,5 ml 90%, 0,3 ml 70% a 0,3 ml 50% gradientu médií. Poté je přidán plný ejakulát a vzorek je centrifugován 20 minut při 2000 otáčkách. Po odstranění supernatantu je přidáno 8 ml Quinn´s Sperm Washing Media a opět je vzorek centrifugován 8 minut při 2000 otáčkách. Po odstranění supernatantu je vzorek připraven k aplikaci do přístroje Oroboros (Oroboros, Innsbruck, Rakousko).

Oxygrafie

Respirační aktivitu spermií jsme měřili na dvoukanálovém oxygrafu Oroboros (Oroboros, Innsbruck, Rakousko) při 36 oC v komůrkách o objemu 2 ml. Po 40–50minutové ekvilibraci odpovídala koncentrace kyslíku v respiračním médiu jeho aktuální koncentraci v atmosférickém vzduchu a rozpustnosti v respiračním médiu (0,92), které mělo následující složení: EGTA 0,5 mm l/l; MgCl₂.6H₂O 3 mmol/l; laktobionát draselný 60 mmol/l; taurin 20 mmol/l; KH₂P0₄ 10 mmol/l; HEPES 20 mmol/l; sacharóza 110 mmol/l, hovězí albumin 1 g/l [11]. Následně byly komůrky uzavřeny a dávkovací stříkačkou Hamilton do nich byl aplikován vzorek spermií. Nejprve byla buněčná membrána spermií permeabilizována digitoninem a změřena respirace vzorku před přidáním substrátů a ADP. Sekvenční titrační protokol aplikace substrátů a inhibitorů jednotlivých komplexů respiračního systému byl zvolen následovně:a) rychlost respirace za klidových podmínek (stav S2 nebo LEAK) byla stanovena pomocí substrátů komplexu I glutamátu (10 mmol/l), malátu (2 mmol/l) a pyruvátu (5 mmol/l); b) aktivní respirace (stav S3 nebo OXPHOS) byla stimulována ADP (2,5 mmol/l); c) spotřeba kyslíku byla dále zvýšena aplikací sukcinátu (10 mmol/l), substrátu komplexu II; d) integrita vnitřní mitochondriální membrány byla ověřena pomocí cytochromu c (10 µmol/l); e) stav OXPHOS při stimulaci komplexu II byl navozen inhibitorem komplexu I rotenonem (0,5 µmol/l); f) inhibitor ATP-syntázy oligomycin (2 µg/ml) opět navodil stav LEAK (S4) nutný k udržení mitochondriál-ního membránového potenciálu; g) pomocí rozpřahovače oxidace a fosforylace karbonylkyanid-p-trifluoromethoxyfenylhydrazonu (FCCP; 0,05–0,25 µmol/l) jsme indukovali stav S3u nebo ETS charakterizující maximální kapacitu elektrontransportního systému; h) inhibitorem komplexu III antimycinem A (2,5 µmol/l ) jsme navodili stav reziduální spotřeby kyslíku (ROX), tj. spotřebu kyslíku způsobenou převážně nemitochondriální oxidací.

V úvodní sérii experimentů jsme testovali dávku digitoninu (5 µg/ml) nutnou pro permeabilizaci buněčné membrány spermií: K vzorku spermií byl přidán sukcinát, rotenon a ADP a postupně byl aplikován digitonin tak dlouho, dokud se respirace zvyšovala. Vyšší dávka digitoninu vedla k poškození mitochondriální membrány a úniku cytochromu c.

Analýza dat a statistika

Spotřeba kyslíku permeabilizovanými spermiemi byla vypočtena on-line pomocí softwaru DatLab (Oroboros Instruments, Innsbruck, Rakousko) jako záporně vzatá časová derivace poklesu koncentrace kyslíku v komůrce a vyjádřená v pmol O₂/(s.10⁶) buněk. Ke statistickému porovnání jednotlivých hodnot spotřeby kyslíku v obou skupinách jsme použili Mannova-Whitneyova pořadového testu pomocí programu STATISTICA Cz, (StatSoft CR, Praha, Česká republika). Výsledky jsou prezentovány jako průměry ± střední chyby průměru (SEM); hladina pravděpodobnosti < 0,05 byla považována za signifikantní.

VÝSLEDKY

Typická křivka spotřeby kyslíku permeabilizovanými spermiemi je na obrázku 3.

Minimální počet spermií nutný pro detekci spotřeby kyslíku byl 5 x 10⁶ buněk v 1 ml média. Po aplikaci glutamátu, malátu a pyruvátu, substrátů pro komplex I, byla spotřeba kyslíku srovnatelná se stavem bez substrátů, což ukazuje na dobrou permeabilizaci buněčné membrány, která vedla k úniku ADP z buňky. Po přidání ADP došlo ke stimulaci respirace a indukci stavu S3, tj. maximální spotřebě kyslíku při fosforylaci ADP na ATP (OXPHOS_I). U astenozoospermie byla aktivita komplexu I signifikantně nižší než u kontrol (tab. 1). Aplikací sukcinátu dodávajícího do systému elektrony prostřednictvím komplexu II došlo k dalšímu zvýšení spotřeby kyslíku (OXPHOS_I+II), která se mezi oběma skupinami významně nelišila. Následná inhibice komplexu I rotenonem ukázala, že příspěvek komplexu I k celkové kapacitě oxidační fosforylace byl i u zdravých spermií relativně nižší, než je tomu typicky v somatických buňkách, např. jaterních nebo svalových [4, 29]. Inhibice ATP-syntázy oligomycinem snížila spotřebu kyslíku na úroveň nutnou především pro pumpování protonů do intermembránového prostoru. Tato hodnota byla signifikantně vyšší u astenozoospermatických vzorků. Rozpřažení fosforylace a oxidace pomocí FCCP ukázalo, že ve zdravých i astenozoospermatických vzorcích je kapacita elektrontransportního systému přenášet elektrony vyšší než maximální spotřeba kyslíku při zachované fosforylaci. Reziduální spotřeba kyslíku, na kterou byly ostatní respirační parametry korigovány, byla u zdravých spermií 0,14 ± 0,05 pmol O₂/(s.10⁶ buněk) a u spermií s poruchou pohyblivosti 0,15 ± 0,05 pmol O₂/(s.106 buněk).

DISKUSE

Literární údaje o respirační aktivitě mitochondrií ve spermiích jsou relativně chudé, nicméně již první studie ukazují, že poruchy mitochondrií mají vliv na motilitu spermií [8]. Důvodem je zejména malé množství mitochondrií obsažených v jednotlivých zárodečných buňkách a jejich obtížná izolace [25]. Proto je nutné stanovit mitochondriální respiraci na celých buňkách, ideálně tak, aby buněčná membrána byla permeabilizována a umožnila přestup substrátů Krebsova cyklu a adenosindifosfátu k mitochondriím. Dosud používaná metoda byla založena na inkubaci spermií v hypotonickém roztoku, která vedla k narušení buněčné membrány bez poškození membrány mitochondrií [24]. V somatických buňkách však inkubace v hypotonických médiích způsobuje stimulaci mnoha membránových iontových kanálů a receptorů, což vede ke změnám ve složení intracelulární tekutiny a aktivaci intracelulárních procesů včetně uvolňování řady biologicky účinných látek a apoptózy [3, 20]. Proto jsme v naší studii využili permeabilizace membrány spermií digitoninem, detergentem často využívaným ve výzkumu mitochondriální funkce na celých buňkách [22]. V naší práci jsme měřili respirační aktivitu mitochondrií lidských spermií permeabilizovaných digitoninem vysokoúčinnou oxygrafií, která umožňuje stanovení spotřeby kyslíku z nejmenšího možného množství zárodečných buněk.

Oxidativní fosforylaci jakožto zdroji tvorby energie pro pohyb spermií byla dávána nezastupitelná role, proto se také předpokládalo, že poruchy mitochondriální morfologie a funkce jsou hlavním faktorem odpovídajícím za sníženou motilitu spermií [38]. Studie na myších ale ukázaly, že při poškozené oxidativní fosforylaci nedochází k zániku motility u spermií [5] a zdrojem ATP je zejména přeměna glukózy na pyruvát [17]; také spermie králíků pravděpodobně využívají jako hlavní zdroj energie glykolýzu [33]. Spermie některých živočišných druhů dokonce dokážou vytvářet glykogen [10]. Samčí zárodečné buňky dalších živočišných druhů (beran, býk, kanec, primáti) včetně člověka však pro pohyb využívají ve významné míře ATP získaný v mitochondriích oxidativní fosforylací [1, 18, 25]. Otázka primárního zdroje energie pro pohyb spermií ještě není zcela zodpovězena ani u člověka; všeobecně uznávaným pohledem je jejich všestrannost v možnosti získávání ATP, která je ovlivněna přítomností a dostupností substrátů v ženském reprodukčním ústrojí [28, 34].

Některé mitochondriální parametry, např. mitochondriální membránový potenciál měřený pomocí průtokové cytometrie, přímo korelují s výsledky léčby neplodnosti pomocí metod asistované reprodukce [16]. Další výzkum a detailnější stu-dium této problematiky tak slibuje přínos pro další pokrok v diagnostice i terapii neplodnosti.

Naše studie potvrzuje nález snížené aktivity komplexu I v mitochondriálním respiračním systému astenozoospermatických vzorků. Aktivita komplexu II však nebyla astenozoospermií narušena a celková kapacita transportu elektronů při stimulaci komplexů I a II a zachované fosforylaci (stav S3I+II) se mezi oběma skupinami nelišila. Zajímavým nálezem je také pravděpodobná zpětná kontrola přenosu elektronů fosforylací ADPu astenozoospermie, jak ukazuje poměr E/P, který byl u méně pohyblivých spermií signifikantně vyšší (tab. 2). Důvodem pro snížení aktivity komplexu I tedy patrně není jeho snížená exprese. U astenozoospermatických vzorků byl také prokázán signifikantně zvýšený stav LEAK (S4), který vyjadřuje stupeň mitochondriální oxidace nutné zejména pro kompenzaci úniku protonů z mitochondriální matrix, ale podílí se na něm i obrat kationtů přes vnitřní mitochondriální membránu [22]. Známým příkladem rozpřažení respirace a fosforylace ADP je rozpřahovací protein hnědé tukové tkáně (UCP1), který je zodpovědný za tvorbu tepla v mitochondriích [27]. V lidských spermiích byla prokázána mRNA pro další rozpřahovací protein – UCP2, jehož role by mohla spočívat v ochraně před kyslíkovými radikály [40], ale jehož vztah k mitochondriální respiraci spermií nebyl dosud zkoumán.

ZÁVĚR

Lepší charakterizace mužských zárodečných buněk, ať zcela zdravých, či s postiženou motilitou, nám umožní lépe pochopit proces fyziologického oplodnění a zároveň pomůže i ve výběru té nejvhodnější spermie pro léčbu neplodnosti asistovanou reprodukcí.

Tento projekt byl podpořen Programem rozvoje vědních oborů Karlovy univerzity (projekt P36), projektem OP VaVpI PO 2 Biomedicínské centrum ED2.1.00/03.0076, projektem specifického vysokoškolského výzkumu SVV 266 802 a grantem GA UK 696212.

MUDr. Miroslava Čedíková

Ústav histologie a embryologie LF UK

Karlovarská 48

301 00 Plzeň

e-mail: miroslava.cedikova@lfp.cuni.cz