Hyperviskozita ejakulátu v kooperácii (asociácii) s niektorými fyzikálno-morfologickými a mikrobiologickými parametrami

Corelation between hyperviscosity of the ejaculate and physical-morphological and biochemical parameters

Objective:
The aim of our study was to investigate the corelation between hyperviscosity and physical-morphological and biochemical parameters of the ejaculate and potential influence of local infections on spermatic plasma viscosity and observed parameters.

Design:
Retrospective analysis.

Setting:
Associated Tissue Bank of P. J. Šafárik University of Faculty of Medicine and L. Pasteur Faculty Hospital, Košice, Slovak Republic.

Methods:
The study was based on semen samples showing increased viscosity obtained from 100 consecutive men undergoing fertility assessment (median 35 years, range 27–49 years) in Associated Tissue Bank between years 1996 and 2006. The ejaculates were obtained by masturbation after 2–7 days of sexual abstinence (median 5 days).

Results:
Increased viscosity correlated with lower motility and increased pathology (95% and 91%, respectively). Within the diagnosis of asthenozoospermia there was a correlation between PMN (polymorphonuclear granulocytes) (95%), higher seminal fluid pH (94%), decreased sperm vitality (100%), decreased total seminal plasma fructose (100%) and positive microbiology (95%).

There was significant positive correlation between high visco-elasticity and positive microbiology (85%), although a leukocytospermia (>1 x 106/mL) was present just in 10% of the semen samples.

Conclusion:
Hyper-visco-elasticity is simple but important parameter of men fertility assessment and is associated with the diagnosis of asthenoteratozoospermia. It is suggested from our patient data that decrease of the leukocytospermia cutoff criteria could detect a chronic and/or latent infection of the urogenital tract. Furthermore, combination of the diagnoses of viscopathy and asthenoteratozoospermia seems as potential marker and indication, respectively, for microbiology examination.

Key words:
hyperviscosity of ejaculate, asthenoteratozoospermia, urogenital infections.

Autoři: L. Bobák ¹; J. Rosocha ¹; L. Lehocká ¹; A. Halagovec ²; M. Hrivňák ³; V. Kraus ⁴; J. Petrovičová ⁵
Působiště autorů: Združená tkanivová banka, Lekárska fakulta Univerzity P. J. Šafárika a FN L. Pasteura, Košice, prednosta MVDr. J. Rosocha, CSc. ¹; Klinika dermatovenerológie, LF Univerzity P. J. Šafárika a FN L. Pasteura, Košice, prednostka doc. MUDr. J. Jautová, PhD., mim. prof. ²; Oddelenie urológie, Nemocnica Šaca, a. s. ³; 1. gynekologicko-pôrodnicka klinika, LF Univerzity P. J. Šafárika a FN L. Pasteura, Košice, prednosta doc. MUDr. V. Kraus, CSc. ⁴; Ústav lekárskej informatiky, Lekárska fakulta Univerzity P. J. Šafárika, Košice, prednosta Ing. J. Majerník, PhD. ⁵
Vyšlo v časopise: Ceska Gynekol 2009; 74(3): 219-224

Souhrn

Cieľ:
Cieľom našej štúdie bolo skúmať koreláciu hyperviskozity s fyzikálno-morfologickými, biochemickými parametrami ejakulátu a potenciálny vplyv lokálnych infekcií na viskozitu semennej plazmy a na skúmané parametre.

Typ štúdie:
Retrospektívna analýza.

Pracovisko:
Združená tkanivová banka Univerzity P. J. Šafárika, Lekárska fakulta a Fakultná nemocnica L. Pasteura, Košice.

Metodika:
Do súboru bolo vybraných 100 mužov vyšetrených v Laboratóriu pre diagnostiku infertility a spermiovej banke pri Združenej tkanivovej banke UPJŠ LF a FN LP v Košiciach (SR) v rokoch 1996 do 2006, z dôvodu porúch fertility. Všetky vyšetrené ejakuláty vykazovali zvýšenú viskozitu. Vekový priemer bol 36,2 roka, SD 5,177, medián 35 rokov, rozmedzie 27-49 rokov. Ejakuláty boli získané per onaniam po 2-7 dňovej sexuálnej abstinencii, v priemere 5,32; medián 5 dní. Ejakuláty analyzované podľa manuálu WHO (1999). Vyšetrované parametre: počet dní ejakulačnej abstinencie, viskozita, pH, objem, koncentrácia, vitalita, motilita (lineárny progresívny pohyb - A, lineárny pomalý pohyb - B), bunkovosť, počet polymorfonukleárnych leukocytov na ml (PMN Le/ml), fruktóza.

Výsledky:
Demonštrovali sme redukujúci vplyv viskozity na motilitu spermií, koreláciu výskytu PMN Le so zvyšujúcou sa viskozitou. Ďalej sme potvrdili štatisticky významný rozdiel vo výskyte pozitívnej mikrobiológie vo viskóznych skupinách, ale bez korelácie so zvyšovaním viskozity. Zistili sme klesajúci trend fruktózy a koncentrácie spermií v skupinách MV, V, VV, ale bez korelácie so zvyšovaním viskozity. Zistili sme, že hyperviskozita je prevažne asociovaná s diagnózou asthenozoospermiou a teratozoospermiou.

Záver:
Hyperviskozita ejakulátu je jednoduchým, ale dôležitým ukazovateľom mužskej neplodnosti a je asociovaná s diagnózou asthenoteratozoospermia. Z našich výsledkov vyplýva, že zníženie hranice kritéria pre leukocytospermiu by pomohli detekovať chronické a/alebo letentné infekcie urogenitálneho traktu. Kombinácia diagnóz hyperviskozita a asthenoteratozoospermia sa prejavil ako vhodný marker, resp. indikácia pre mikrobiologické vyšetrenie.

Klúčové slová:
hyperviskozita ejakulátu, asthenoteratozoospermia, urogenitálna infekcia.

ÚVOD

Mužská (sub)infertilita je považovaná za multifaktoriálne ochorenie, na ktorom sa genetické faktory podieľajú súčasne s faktormi životného štýlu, faktormi životného prostredia (environmentálnymi) alebo pracovného prostredia a chorobami, ako je varikokela a infekcie prídavných pohlavných žliaz (MAGI = male accessory gland infection) [1]. Mužská neplodnosť je odprevádzaná rôznymi patologickými parametrami fyzikálno–morfologickými, biochemickými, imunologickými, mikrobiologickými. Jedným z nich je aj hyperviskozita (viscopathia), ktorá je definovaná podľa kritérií WHO [2] ako hustota ejakulátu, prejavujúca sa tvorbou vlákna nad 2 cm pri manipulácii s ejakulátom. Poznatky o korelácii viskozity semennej tekutiny s inými parametrami ejakulátu, respektíve náväznosť na niektoré externé vplyvy a hlavne jej vplyv na mužskú fertilitu sú zatiaľ nedostatočné.

Korelácia hyperviskozity s niektorými biochemickými faktormi, ako je epididimálny marker neutrálna alfa-glukozidáza (NAG) nebola potvrdená [3]. Prostatický špecifický antigén (PSA), ktorý je považovaný za hlavný proteolytický enzým semennej plazmy (degraduje semenogelín I (SgI) a semenogelín II (SgII), ktoré pochádzajú z vesicules seminalis pravdepodobne neovplyvňuje viskozitu semena, pretože ani jeho znížená sekrécia nie je príčinou hyperviskozity [4]. Zinok, pochádzajúci z prostaty, ktorý je ďalším faktorom v procesoch súvisiacich s viskozitou semena, spolu s PSA a proteázami semena prispieva k proteolytickému rozkladu SgI a SgII [5]. Avšak vo vzorkách semena s normálnnou a zvýšenou viskozitou neboli zistené signifikantné rozdiely v hladinách zinku [3].

Koncentrácia fruktózy v semennej plazme je doporučená WHO [2] ako marker sekretorickej aktivity vesicules seminales a je hlavným zdrojom energie pre spermie [6]. Predpoklad štúdie [7],že hyperviskozita semennej plazmy je spojená s hypofunkciou vesicules seminales sa nepotvrdil [3, 8].

Podľa Everaerta a kol. [9] je príčinou zvýšenej viskozity ejakulátu porucha sekrečnej činnosti prostaty, ktorá má za následok nedostatok až absenciu proteolytických enzýmov. Vysoké viskozity boli pozorované u defektných ejakulátov a najčastejšie sa vyskytovali u mužov s asthenozoospermiou [10, 11].Pri postkoitálnych testoch bola hyperviskozita príčinou slabého prenikania spermií do cervikálneho hlienu [12].

Hyperviskozita semena je asociovaná s mužskou infertilitou, ale jej patogenéza a mechanizmus pôsobenia nie sú zatiaľ dostatočne preskúmané. S určitosťou sa dá tvrdiť, že je signifikantný vzťah medzi prídavnými pohlavnými žľazami, epidydimidom a viskozitou semena a viskozitou a motilitou spermií [13].

CIEĽ

Cieľom našej štúdie bolo skúmať koreláciu hyperviskozity s fyzikálno-morfologickými, biochemickými parametrami ejakulátu a potenciálny vplyv lokálnych infekcií na viskozitu semennej plazmy a na uvedené parametre.

MATERIÁL A METODIKA

Ejakuláty

Do súboru bolo vybraných 100 mužov vyšetrených v Laboratóriu pre diagnostiku infertility a spermiovej banke pri Združenej tkanivovej banke UPJŠ LF a FN LP v Košiciach (SR) v rokoch 1996 do 2006, z dôvodu porúch fertility. Všetky vyšetrené ejakuláty vykazovali zvýšenú viskozitu. Vekový priemer bol 36,2 roka, SD 5,177, medián 35 rokov, rozmedzie 27-49 rokov. Ejakuláty boli získané per onaniam po 2-7 dňovej sexuálnej abstinencii, v priemere 5,32; medián 5 dní (tab. 1).

Analýza ejakulátov

Po inkubácii v biologickom termostate pri 37 °C, 30 minút, boli ejakuláty analyzované podľa manuálu WHO [2]. Boli vyšetrované a hodnotené nasledovné parametre: počet dní ejakulačnej abstinencie, viskozita, pH, objem, koncentrácia, vitalita, motilita (lineárny progresívny pohyb – A, lineárny pomalý pohyb – B), bunkovosť, počet plymorfonukleárnych leukocytov na ml (PMNLe/ml), fruktóza (tab.1).

1. Ejakulačná abstinencia: zistená v rámci anamnézy pacienta, bola v rozmedzí doporučenom manuálom WHO [2] 2-7 dní.

2. Viskozita bola stanovená pomocou pipety, pri naberaní sa vytiahla špička z ejakulátu a hodnotilo (meralo) sa vlákno, ktoré sa vytiahlo z hladiny. Ejakuláty, u ktorých bolo namerané vlákno dlhšie ako 2 cm, boli hodnotené ako viskózne. Pre podrobnejšiu analýzu sme rozdelili viskózne ejakuláty do 3 skupín:

A. skupina: mierne viskózne, s ťažnosťou 2 – 4 cm (ďalej MV),
B. skupina: viskózne, s ťažnosťou 4,1 – 6 cm (ďalej V),
C. skupina: vysoko viskózne, s ťažnosťou 6,1 – 9 (15) cm (ďalej VV) (15 cm bolo najdlhšie namerané vlákno vytiahnuté z hladiny ejakulátu).

3. pH bolo merané pH metrom Sentron 1001 (fy Sentron Europe, Holandsko) so sondou ISFET Red-Line pre meranie malých objemov roztokov až polotuhých látok.

4. Objem ejakulátov bol meraný v graduovanej skúmavke s presnosťou na 0,1 ml.

5. Koncentrácia spermií v 1 ml ejakulátu bola stanovená v Thomovej komôrke.

6. Vitalita bola stanovená vyhodnotením 100 spermií v mikroskopickom poli natívneho preparátu s pridaním kvapky (5 μl) eozínu.

7. Motilita (rozbor pohybu na progresívny lineárny – A, pomalý lineárny – B, nelineárny – C, nehybné spermie – D) bola stanovená analýzou pohybu 100 spermií v mikroskopickom poli natívneho preparátu alebo natívneho preparátu s pridaním kvapky (5 μl) eozínu.

8. Bunkovosť – koncentrácie buniek (leukocyty, vývojová štádia spermií a iné) v 1 ml ejakulátu bola stanovená v Bürkerovej komôrke (475 μl Turkovho roztoku + 25 μl ejakulátu).

9. PMN Le sme stanovili komerčným testom LeucoScreen (FertiPro, Belgicko), ktorým detegujeme peroxidázu produkujúce bunky. Norma PMN Le v ejakuláte podľa manuálu WHO [2] považuje za patologickú hodnotu 1 mil. buniek v ml a viac. Takýto počet PMN Le sa vyskytuje najčastejšie pri akútnych infekciách urogenitálneho traktu, doprevádzaných väčšinou klinickými príznakmi. V našom súbore bolo len 10 % takýchto nálezov. Na základe dlhoročných pozorovaní sme zistili, že v posledných rokoch sa pacienti s klinickým priebehom mikrobiologicky potvrdenej urogenitálnej infekcie vyskytovali zriedkavo. Najčastejšie bol diagnostikovaný chronický až latentný priebeh, bez klinických príznakov, ale väčšinou aj bez zvýšenia PMN Le nad 1 mil./ml. Na základe týchto pozorovaní sme si stanovili internú normu PMN Le od 0,1 mil/ml ejakulátu ako pozitívnu.

10. Stanovenie fruktózy bolo robené komerčným testom FructoScreen (FertiPro, Belgicko), alebo testom zostaveným v našom laboratóriu: do semennej plazmy sú pridané roztoky ZnSO4.7 H₂O a NaOH, po scentrifugovaní je pridaná indolová reagencia a HCl. Intenzitu oranžového zafarbenia roztoku meriame fotometricky pri vlnovej dĺžke 470 nm.

11. Morfológia spermií bola hodnotená mikroskopicky na prearátoch ejakulátu na podložnom sklíčku zafarbených komerčným farbivom Spermac Stain (FertiPro, Belgicko), pri 1200 násobnom zväčšení v imerznom oleji. Na hodnotenie morfológie sme použili tzv. „striktnú“ metódu (14), čo je morfologická klasifikácia Tygeberského pracoviska [15] a je založená na modifikovanej metóde MacLeoda, R. [16] a Eliasona, R. [17].Anatómia celej spermie je podrobená morfologickej analýze. Bolo vyšetrených 100 spermií na každom sklíčku, minimálne v 4 rozdielnych oblastiach, čo zodpovedá základným kritériám tejto metódy.

12. Na overenie hypotézy rovnosti stredných hodnôt sme použili analýzu rozptylu a jednoduchého triedenia (ANOVA – One way analysis of variance.) a na štatistické vyhodnotenie malých súborov Fisherov exaktný test. Na testovanie absolútnych početností výskytu (napr. znižovanie vitality v skupinách MV, V, VV) sme použili χ² test.

VÝSLEDKY

Do súboru bolo vybraných 100 vzoriek ejakulátov, ktoré vykazovali zvýšenú viskozitu s ťažnosťou nad 2 cm a boli u nich vyšetrené parametre uvedené v tab. 1. Až 95 % pacientov so zvýšenou viskozitou ejakulátu (tab. 4) malo zníženú motilitu spermií, diagnózu „astheno“. Potvrdili sme tým zistenie [13], že pohyblivosť spermií prirodzene klesá v hustejšom prostredí. Percentuálny rozbor ukázal významnú súvislosť asthenozoospermie s koncentráciou PMN Le (95 %), so zvýšeným pH (94 %), so zníženou vitalitou (100 %), so zníženou fruktózou (100 %) a s pozitívnou mikrobiológiou (95 %) (tab. 4). Podobná situácia bola aj v skupine s diagnózou „terato“, 91 % viskóznych vzoriek semena (tab. 4). Čo sa týka kombinácií diagnóz vyskytujúcich sa v súbore sledovaných pacientov, najčastejšia bola astheno-teratozoospermia (70 %) so značným rozdielom od druhej najčastejšej diagnózy oligo-astheno-teratozoospermia (17 %). Ostatné diagnózy sa vyskytovali od 8 % do 1 %.

**Tab. 2. Asociácia diagnóz spermiogramu, viskozity a vyšetrovaných parametrov**

**Tab. 3. Vzťah diagnóz asthenozoospermia a teratozoospermia k hyperviskozite a vyšetrovaným parametrom**

Najvyššia korelácia viskozity bola zistená s mikrobiologickou pozitivitou až 85 % (tab. 3), ale prítomnosť PMN Le v ejakuláte, ktorá úzko súvisí s lokálnou infekciu bola potvrdená iba v 44 %, aj to len za podmienky zníženia normy na 0,1 mil/ml. Z toho iba v 10 % ejakulátov bolo dokázané viac ako 1 mil. PMN Le/ml a iba v 8 % bola zistená zvýšená bunkovosť podľa normy WHO[2]. Medzi skupinami MV, V, VV a PMN Le sa potvrdil štatisticky významný rozdiel na hladine významnosti 0,048. Rozdiel sa uplatnil medzi skupinami MV a VV. Potvrdila sa korelácia PMN Le so zvyšovaním viskozity semena.

**Tab. 4. Korelácia viskozity s vyšetrovanými parametrami**

Hyperviskozita (MV) zistená v jednom prípade pri normozoospermii bola doprevádzaná leukocytospermiou, zvýšeným pH a pozitívnou mikrobiológiou (Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum). Pravdepodobne sa jednalo o primárnu akútnu infekciu.Najčastejšími pôvodcami urogenitálnych infekcií v súbore našich pacientov boli práve Chlamydia trachomatis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis alebo genitalium, Candida albicans, Trichmonas vaginalis.

U 32 % pacientov sme zistili zvýšené pH v rozmedzí 7,9 – 8,3. Najvyššie percent bolo v kategórii „mierne viskózne“, 39 %. V tejto kategórii bolo aj najvyššie percent mikrobiologických nálezov (88 %) a nálezov PMN Le (54 %) (tab. 3).

V kategórii vysoko viskóznych ejakulátov dominovala znížená vitalita (78 %) a znížená fruktóza (78 %). Znížená vitalita spermií bola zistená celkove v 64 % prípadov, čo je druhý najčastejší patologický parameter. Fruktóza bola znížená celkove v 47 % ejakulátov, čo je tretí najčastejší parameter. Fruktóza ako energetická zložka koreluje skôr s motilitou spermií ako s ich vitalitou, čo potvrdzuje 100% asthenozoospermia v kategórii VV ejakulátov. To znamená, že na zníženej motilite spermií sa podiela jednak zvýšená hustota prostredia, ako aj nedostatok energetickej zložky.

Štatistický významný rozdiel medzi vekom, abstinenciou, pH, objemom, koncentráciou spermií, bunkovosťou, vitalitou, hladinou fruktózy a hyperviskozitou v jednotlivých skupinách sa nepotvrdil (p≥0,05), ale hladiny fruktózy vykazovali klesajúci trend v jednotlivých skupinách viskozity (graf 1). Rovnaký trend vykazovala aj koncentrácia spermií a koncentrácia PMN Le.

**Graf 1. Klesajúci trend hladín fruktóza v skupinách MV, V, VV**

Fisherovým exaktným testom sa potvrdil štatisticky významný rozdiel na hladine p=0,04 vo výskyte pozitívnych mikrobiologických výsledkov medzi skupinami MV (36) a VV (5). Trend má klesajúcu tendenciu ale nepotvrdzuje koreláciu medzi pozitívnou mikrobiológiou a zvyšovaním viskozity semena.

Zhrnutie výsledkov

Demonštrovali sme redukujúci vplyv viskozity na motilitu spermií, koreláciu výskytu PMN Le so zvyšujúcou sa viskozitou. Ďalej sme potvrdili štatisticky významný rozdiel vo výskyte pozitívnej mikrobiológie vo viskóznych skupinách, ale bez korelácie so zvyšovaním viskozity. Zistili sme klesajúci trend fruktózy a koncentrácie spermií v skupinách MV, V, VV, ale bez korelácie so zvyšovaním viskozity. Zistili sme, že hyperviskozita je prevažne asociovaná s diagnózou asthenozoospermia a teratozoospermiou.

DISKUSIA

Nízke percento bunkovosti aj PMN Le potvrdzuje naše presvedčenie nadobudnuté dloročnými skúsenosťami a tiež touto štúdiou, že chronické, latentné, či perzistentné infekcie prebiehajú nielen bez klinických, ale aj bez laboratórnych príznakov. Väčšinou sa jednalo o recidivujúce infekcie alebo opätovné nakazenie po liečbe. Pravdepodobné vysvetlenie je, že imunitný systém po dlhodobej expozícii už nereaguje na patogéna v urogenitálnom trakte po opakovanej terapii ATB. Do úvahy treba zobrať skutočnosť, že ATB terapia infekčných ochorení, iných ako STD, ovplyvňuje aj urogenitálnu mikroflóru. Preto je nevyhnutné v anmnéze zistiť kedy, aké, ako dlho a z akého dôvodu brali pacienti ATB v nedávnej minulosti. Recidívy môžu byť v dôsledku stanovenia nesprávnej alebo neúplnej diagnózy, čo vedie k nevhodnej terapii (nevhodne zvolené preparáty ATB, nevhodne zvolená schéma liečby v zmysle doby trvania liečby aj výberu ATB preparátu) alebo v prípade falošnej negativity sa liečba neuskutočnila. Platí to hlavne pri liečbe infekcií spôsobených Chlamydia trachomatis, ktorá je často doprevádzaná ďalšími patogénmi, napr. Neisseria gonorrhoeae a tiež enterobaktérie [18, 19, 20]. Ďalším závažným (dôležitým) patogénom, ktorý sa vyskytoval v našom súbore, je grampozitívna baktéria Enterococcus foecalis. Infekcia touto baktériou je u mužov ťažko liečiteľná. Požívajú sa kombinácie ATB a chemoterapeutík, v prípadoch, keď je to možné aj liečba autovakcínami [21]. Problém môže byť v diagnostickej metóde, teda v dôkaze pôvodcu. Výsledky sú závislé na kvalite odberu, na záchytnosti laboratórnej techniky a na možnosti znehodnotenia vzorky pri transporte [22].

Keď v deväťdesiatych rokoch minulého storočia bola zavedená metóda PCR a LCR (pre vzorky moču) na detekciu chlamydiálnej DNA, bola považovaná za vysoko senzitívnu a špecifickú metódu, vhodnú na efektívny skríningový program [23]. V posledných rokoch sa napriek tomu považujú za nedostatočné, a to hlavne pre dôkaz chronickej (latentnej, perzistentnej) chlamýdiovej infekcie [24]. Na základe vyhodnotenia súboru 250 mužských pacientov autori považujú za najvhodnejšiu metódu dôkazu aktívnej chlamýdiovej infekcie prítomnosť slizničných IgA protilátok v semennej plazme [24, 25], najlepšie proti proteinu vonkajšej membrány (anti-MOMP) Chlamydia trachomatis [26]. Förstl a kol. [27] tvrdia, že komplexné hodnotenie mikrobiologického materiálu v kvalitnom laboratóriu musí byť založené na viacerých metodikách a dodávajú, že jediná úplne spoľahlivá metóda prosto neexistuje. Naďalej ostáva spoľahlivou diagnostickou metódou priama detekcia antigénu Chlamydia trachomatis imunofluorescenčnou metódou, kde sa ako kontrola alebo konfirmácia sporných výsledkov môže použiť metóda PCR.

ZÁVER

Hyperviskozita ejakulátu je jednoduchým, ale dôležitým ukazovateľom mužskej neplodnosti a nepriamou indikáciou na dôkladné mikrobiologické vyšetrenie. Je významne naviazaná na diagnózu astheno-terato-zoospemia (95 % a 91 %). Prítomnosť PMN Le (10 % nad 10⁶/ml a 44 % nad 10⁵/ml /ml) nebola signifikantná pri 85 % dokázaných infekcií. Ale zníženie normy PMN Le na 10⁵/ml je prínosom pre odhalenie chronických a latentných infekcií. Kombinácia diagnóz hyperviskozita a astheno-terato-zoospermia, v niektorých prípadoch doprevádzaných klesajúcimi hladinami fruktózy a klesajúcou koncentráciou, sa prejavil ako vhodný marker, resp. indikácia pre mikrobiologické vyšetrenie.MVDr. Ladislav Bobák, CSc.

Združená tkanivová banka

UPJŠ LF a FN LP

Trieda SNP 1

040 66 Košice

Slovenská republika

Zdroje

1. Comhaire, FH., Mahmoud, AM., Depuydt, CE., et al. Mechanisms a effects of male genital tract infection on sperm quality and fertilizing potential: the andrologist’s viewpoint. Hum Reprod, 1999, 5, p. 393-398.

2. WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction. Cambridge University Press, 1999.

3. Caprino, A., Siciliano, L. Unaltered prtein pattern/genital trect secretion marker levels in seminal plasma of highly viscous human ejaculates. Arch Androl, 1998, 41, p.31-35.

4. Dube, JY., Gaudreault, D., Trembly, RR. The concentration of immunoreactive prostate specific antigen is not decreased in viscous semen samples. Andrologia, 1989, 21, p. 136-139.

5. Lilja, H. A kallikrein-like serine protease in prostatic fluid cleaves the predominant seminal vesicle protein. J Clin Investigation, 1985, 76, p. 1899-1903.

6. Mann, T. Fructose, polyols, and organic acids. In: The Biochemistry of Semen and of the Male Reprodictive Tract. (ed. T. Nam). London: Methuen & Co. Ltd, 1964.

7. Gomzalesa, GF., Kortebani, G., Mazzolli, AB. Hyperviscosity and hypo-function of the seminal vesicles. Arch Androl, 1993, 30, p. 63-68.

8. Siciliano, L., Tarantino, P., Longobardi, F., et al. Impaired seminal antioxidant capacity in human semen with hyperviscosity or oligoasthenozoospermia. J Androl, 2001, 22, p. 798-803.

9. Everaert, K., Mahmoud, C., Depuydt, C., et al. Chronic prostatitis and male accessory gland infection – is there an impact on male infertility (diagnosis and therapy). Andrologia, 2003, 35, 5, p. 325.

10. Ming-Chung, L., Tsong-Chang, T., Yu-Shih, Y. Measurement of viscosity of the human semen with a rotational viscometer. J Formosan Med Assoc, 1992, 91, p. 419-423.

11. Gopalkrishnan, K., Padwal, V., Balaiah, D. Does seminal fluid viscosity influence sperm chromatin integrity? Arch Androl, 2000, 45, p. 99-103.

12. Gersh, I. Pancreatic dornase for liquefaction of viscid human semen. Fertil Steril, 1970, 21, p. 147-150.

13. Elzanaty, S., Malm, J., Giwercman, A. Visco-elasticity of seminal fluid in relation to the epididymal and accessory sex gland function and its impact an sperm motility. Intern J Androl, 2004, 27, p. 94-100.

14. Sobek, A., Hrbková, K. Hodnocení morfologie spermií „striktní“ metodou. Čes Gynek, 1996, 61, 2, s. 91-95.

15. Menkveld, R., Oettlé, EE., Kruger, TF., et al. Atlas of Human Sperm Morphology. Williams and Wilkins, Baltimore, USA 1991, 121 s.

16. MacLeoda, R. (1952) (cit. Menkveld, R., Oettlé, EE., Kruger, TF., et al. Atlas of Human Sperm Morphology. Baltimore, USA: Williams and Wilkins, 1991, 121 s.

17. Eliasona, R. (1971), cit. Menkveld, R., Oettlé, EE., Kruger, TF., et al. Atlas of Human Sperm Morphology. Baltimore, USA: Williams and Wilkins, 1991, 121 s.

18. McKenna, JG., Young, H., Moyes, A., Smith, IW. Is coexisting chlamydial infection more common in gonococcal infections with serogroup WI? Int J STD AIDS, 1990, 1, p. 340-342.

19. Halagovec, A., Kraus, V., Bobák, L., et al. Urogenitálna chlamýdiová infekcia. Orbis Medicinae, 2008, IX, 1, 1, 82 s.

20. Krause, W. Andrologia, 2008, 40, 2, p. 113-116.

21. Šuk, K., Marešová, H. Nespecifická vaginóza či kolpitis chronica? Prakt Gynek, 2004, 11, 4, s. 178-180.

22. Mašata, J., Řezáčová, J., Sodja, I., Drbohlav, P. Chlamydia trachomatis – epidemiologická situace. Čes Gynek, 1998, 63, 3, s. 217-220.

23. Taylor-Robinson, D. Evaluation and comparison of tests to diagnose Chlamydia trachomatis genital infection. Hum Reprod, 1997, 12, p. 113-120.

24. Řezáčková, J., Mašata, J., Přibylová, M., Dražďáková, M. Naše zkušenosti s vyšetřováním a léčbou mužů s poruchou plodnosti způsobenou chlamydiovou infekcí. Čes Gynek, 2001, 66, 2, s. 113-116.

25. Witkin, SS., Kligman, I., Bongiovanni, AM. Relation between an asymptomatic male genital tract exposure to Chlamydia trachomatis and an autoimmune response to spermatozoa. Hum Reprod, 1995, 10, p. 2952-2955.

26. Pospíšil, L., Čanderle, J., Medková, Z., et al. Protilátky proti tepelnému šoku chlamydií (cHSP 60) v krevním séru a semenné plazmě mužů (partnerů žen v subfertilních párech, dárců semene a dárců krve). Derma, 2003, III., 4, s. 4-8.

27. Förstl, M., Štěpánová, V., Buchta, V., et al. Chlamýdiové infekce urogenitálního systému – využití přímé imunofluorescence v diagnostice Chlamydia trachomatis ve východočeském regionu České republiky v letech 1997-2003. Čes Gynek, 2005, 70, 2, s 128-133.