Biologická dozimetrie a moderní (-omické) metody

Souhrn

Riziko akutního ozáření větší části populace stoupá a s ním i potřeba vyvíjet nové metody, které by mohly poskytnout rychlé posouzení obdržených dávek za použití moderních vysokokapacitních technologií. Současně vzrůstá i zájem o vývoj nových biomarkerů umožňujících kategorizaci ozářených osob, které by mohly být použity v epidemiologických studiích, a umožnily korelovat odhadované přijaté dávky s následným dopadem na zdraví pacienta. K tomu napomáhají rovněž aktuální poznatky v oblasti radiační genomiky, metabolomiky a proteomiky.

Ačkoli většina studií, které poskytly mnoho užitečných informací o biomarkerech expozice ionizujícímu záření, byla prováděna na zvířecích modelech, nejdůležitějšími testy zůstávají studie prováděné na pacientech, zejména onkologických. Pro predikci účinku záření lze použít různé biologický materiály, ideální se pro tento účel zdají být plazmatické proteiny. Z řady kandidátních markerů je velmi slibná ferredoxin-reduktáza (FDXR), která byla v několika biodozimetrických studiích potvrzena jak na úrovni lidského genu, tak proteinu.

Klíčová slova:

radiační ochrana – biomarker – proteomika – metabolomika – biodozimetrie

ÚVOD

Nebezpečí radiačních havárií nebo zneužití jaderných zbraní v současnosti poukazuje na rostoucí význam biologické dozimetrie. V případě hromadných nehod lze očekávat vystavení velké části populace ionizujícímu záření (IZ) za současné absence přesných fyzikálních dozimetrických dat. Důležitá úloha při bezprostřední selekci ozářených a neozářených jedinců tak připadne biologickým testům, jež však prozatím trpí mnoha problémy (časová náročnost, nízká senzitivita, výrazný pokles signálu s časem po ozáření apod.). Pro toto první, rychlé třídění jsou tedy nezbytné účinnější a pokročilejší testovací metody založené na biomarkerech, jejichž kvalitativní změny umožní stanovit časovou intenzitu a interval od ozáření organismu (1). Velké úsilí bylo proto věnováno nalezení vhodných biomarkerů expozice záření, které mohou poskytnout informace o efektivní dávce (2).

Hlavní zasaženou biomolekulu pro IZ představuje DNA, jejíž poškození má pro organismus největší důsledky. Genetickou informaci a správné fungování buněk ohrožují zejména dvouřetězcové zlomy DNA (DSB), jež mohou být generovány buď nepřímo, reaktivními kyslíkovými radikály (ROS) vznikajícími radiolýzou vody, nebo přímo, interakcí DNA se zářením. IZ ovšem poškozuje také proteiny, lipidy a aktivuje reparační mechanismy DNA, které mohou následně vést k oslabení buňky, v důsledku čehož dochází k projevům genotoxického stresu. Buňky jedinců vystavených IZ často zvýšeně produkují ROS v mitochondriích, což vede k řadě molekulárních procesů, na jejichž konci může být rozvoj akutní nemoci z ozáření (3).

Obecně vzato poškození vyvolaná IZ zahrnují senescenci a různé formy buněčné smrti, stárnutí buněčných struktur a abnormality v kompartmentu kmenových buněk (3). Tyto procesy vedou k aktivaci proteinu p53, což je důležitý transkripční faktor mnoha genů zapojených v buněčné odpovědi na ozáření (4).

Velikost absorbované dávky IZ má pro oběti události významné důsledky. Nízké dávky mají systémově za následek poškození krvetvorby a trávicího traktu, zatímco vysoké dávky vyvolávají poškození kardiovaskulární a centrálního i periferního nervového systému (5). Nízké dávky nemusejí mít okamžitě rozpoznatelné projevy, po delší době mohou vést ke vzniku nádorů (6). Na druhou stranu akutní radiační syndrom doprovází okamžité změny stavu organismu s výraznými patologickými projevy (7). V obou případech však následkem ozáření dochází k rychlým, avšak pouze dočasným změnám exprese některých proteinů, které můžeme následně analyzovat v tělních tekutinách (krev, moč, sliny apod.). Pro co nejpřesnější zpětný odečet obdržené dávky by proto měly být vzorky biologického materiálu odebírány a změny hladin biomarkerů kvantifikovány pokud možno již během prvních dnů po ozáření. Individuální reakce na ozáření je nicméně komplexní. Vedle dávkového příkonu, typu záření a absorbované dávky závisí také na genetických a epigenetických predispozicích každého jednotlivce (8).

Ideální radiační biomarker by měl poskytovat informace o obdržené dávce a měl by být nezávislý na environmentálních a dalších faktorech (kouření, léková terapie, věk atd.) (9). Takový biomarker dosud neznáme, ale již byly navrženy způsoby zpětného odhadu dávky spojením několika genetických a metabolických biomarkerů (10). K tomu lze přidat i  proteomické biomarkery krevní plazmy, jejichž zvýšené hladiny zejména po vysokodávkovém ozáření lze pozorovat v relativně krátkém čase (1).

GENOMIKA V RADIAČNÍ BIODOZIMETRII

Analýza změn v expresi genů nabízí novodobý přístup k radiační biodozimetrii (11). Jak již bylo uvedeno, mnoho genů, které reagují na IZ, ovlivňuje protein p53. Oh et al. (2012) studovali 13 genů indukovaných zářením, ze kterých bylo 12 regulováno právě proteinem p53; 9 z nich je dobře známých: BBC3, CDKN1A, CCNG1, DDB2, FDXR, GADD45, MDM2, MYC a PCN (12).

Manningová et al. (2013) provedli podobný experiment, když studovali expresi 13 genů na úrovni mRNA v lidské krvi ozářené ex vivo rentgenovým zářením. Zjistili, že kombinace genů FDXR, DDB2 a CCNG1 by mohla být použita pro stanovení nízkých dávek záření a kombinace FDXR, DDB2 a PHPT1 potom dávek vysokých. Důležitým poznatkem je, že u posledních 3 jmenovaných genů získali statisticky významnou odpověď s lineárním charakterem, což naznačuje dobrou citlivost a reprodukovatelnost tohoto přístupu (13).

Úroveň exprese 8 genů (BBC3, FDXR, CDKN1A, PCNA, XPC, GADD45A, DDB2 a POLH) ve vzorcích krve byla 24 hodin po celotělovém ozáření vyšší než ve vzorcích před tímto ozářením a v kontrolní skupině zdravých jedinců. Dále bylo zjištěno, že pro všechny testované dávky se lišila úroveň exprese mezi dvěma časovými intervaly, kdy 6 hodin po ozáření byla vyšší než po 24 hodinách (14), což signalizuje určitou časovou závislost. Ghandhiová et al. (2015) informovali o genech, které byly citlivější na IZ než ostatní. Ex vivo ozařovali lidskou krev dávkami 0,56 Gy, 2,23 Gy a 4,45 Gy. Výsledkem bylo, že u genů FDXR, AEN, DDB2, PHLDA3, PCNA, GADD45A a ZMAT3 došlo ke zvýšení jejich exprese a u genů MYC, PFKP a PTGDS naopak k jejímu snížení (15).

Recentně uvedli Lacombe et al. (2018) dalších 5 top genů s nejvyšší korelací mezi dávkou a úrovní exprese: FDXR, TNFSF4, TMEM30A, ZMAT3 a AEN (16).

Řada kandidátních genů (AEN, CCNG1, CDKN1A, DDB2, FDXR, GADD45A, PCNA, SESN1 a ZMAT3) byla identifikována jako slibná a byla uvedena v několika publikacích. V současné době se na základě několika studií dostává do popředí zájmu FDXR, který se ukazuje být slibným transkriptomickým kandidátem. Lacombe et al. shrnuli další informace o genomových biomarkerech ve své rešerši (16).

METABOLOMIKA V BIOLOGICKÉ DOZIMETRII

Biomarkery vyskytující se v krvi, moči, slinách, podkožním tuku či stolici mohou poskytovat řadu údajů pro hodnocení radiační zátěže u  savců včetně člověka. Podle Byrumové et al. jsou nejběžnějšími biologickými vzorky pro detekci biomarkerů moč a plazma (1).

Současné metabolomické studie poukazují na několik potenciálních biomarkerů. Například vyšší hladina valinu, alaninu, laktátu, argininu, malátu, leucinu, 2-aminobutyrátu, taurinu a  glutathionu byla detekována ve tkáni sleziny u myší po ozáření dávkou 3 a 7,8 Gy (17). V další studii stanovili Cheemová et al. vyšší hladinu fenylalaninu, glutathionu, kreatininu a nižší hladinu adeninu a D-aspartátu ve střevní tkáni myší (jejuno-ileální oblast), která byla izolována 2 měsíce po ozáření dávkou 2 Gy (18). V jiné své práci Cheemová et al. při analýze myších jater a ledvin pozorovali změny v metabolomických a lipidových profilech v časovém intervalu 60 dní po ozáření. Zjistili také výrazné změny v metabolismu karnitinu, cholinu a kyseliny arachidonové (19). V další studii tento tým prokázal změny ve složení metabolitů exosomů a plazmy po ozáření dávkami 5,8 Gy a 6,5 Gy (20).

Metabolity, jako je GSH, NAD+ a spermin, by také mohly sloužit jako důležití ukazatelé ozáření (21). Laiakisová et al. pozorovali zvýšené vylučování taurinu, nikotinátu, alantoinu a kyseliny močové po expozici dávkám 8 a 15 Gy. Tento tým uvedl, že pomocí metabolomiky můžeme rovněž rozlišovat různé stresory (22).

Pravděpodobně nejvíce využívanou biologickou tekutinou v metabolomických studiích je moč. Obsahuje metabolity, které lze použít k detekci různých onemocnění nebo stavů, včetně ozáření. Tyto metabolity odrážejí specifičnost konkrétních tkání a jejich změny jsou detekovatelné v různých časových intervalech, na rozdíl od ukazatelů stanovovaných v krvi (23).

V jiné studii byli onkologičtí pacienti vystaveni celotělově dávce 1,25 Gy. Bylo zjištěno, že dva metabolity, konkrétně trimethyl-L-lysin a hypoxanthin, jsou v moči až 10× zvýšené ve srovnání s kontrolní skupinou (24). Zvýšené hladiny hypoxanthinu u celotělově ozářených pacientů potvrdili také Chen et al. (25).

Sliny mohou být použity k predikci tíže radiačního poškození organismu, protože obsahují metabolity citlivé na záření i po nízkých dávkách (26).

Mooreová et al. ve své studii, kde analyzovali vzorky slin onkologických pacientů celotělově ozářených dávkami 1,5, 1,65 a 2 Gy, identifikovali monocytový chemoatraktantový protein 1 (MCP-1), interleukin 8 (IL-8) a intercelulární adhezní molekulu 1 (ICAM-1) jako potenciální slinné biomarkery ozáření. Bohužel zatím nebylo publikováno mnoho studií o využití slin jako biologického materiálu v radiační biodozimetrii, zejména kvůli metodologickým potížím s přípravou vzorku (27).

V kalcifikovaných či zrohovatělých lidských tkáních (zuby, vlasy, nehty) se tvoří radikály, které jsou natolik stabilní, že jsou detekovatelné pomocí elektronové paramagnetické rezonance (EPR) i v delších časových intervalech po ozáření (28). Demidenko et al. ve své studii uvádějí, že vyšší dávky IZ vyvolaly u exponovaných lidí zvýšené signály EPR (29).

EPR měří tzv. radiačně indukované signály (RIS) např. ze vzorků nehtů po expozici IZ. RIS jsou natolik stabilní, že je lze považovat za vhodné kandidáty pro biologickou dozimetrii (30). Využití EPR zubní tkáně in vivo zvyšuje přesnost odhadu absorbované dávky zasaženého organismu, což by mohlo vést k využití této metody při třídění velkého počtu obětí (31).

Podrobněji se touto problematikou zabývají ve svých pracích Kulkarniová et al. a Singh et al. (10).

PROTEOMIKA V RADIAČNÍ BIODOZIMETRII

Moč se zdá být ideálním substrátem pro stanovení radiačních biomarkerů, ale vhodnější volbou z proteomického hlediska se ukázaly být plazma a sérum, jež navíc obsahují další molekuly včetně proteinů. Analýzy těchto tělních tekutin poskytují cenné informace například o  poškození tkáně, metabolickém fenotypu, zánětlivém a protizánětlivém stavu tkání apod. (32). Vhodnou metodou pro detekci proteinů ze séra a plazmy je vysoce rozlišovací hmotnostní spektrometrie kombinovaná s vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC), což je robustní, reprodukovatelná a velmi citlivá technika (33).

Avšak biomarkery akutní nemoci z  ozáření byly studovány i na myších modelech (34). Jako možný biomarker může být použita v  biodozimetrii aminokyselina citrulin (35) obsažená v enterocytech, které jsou vlivem záření poškozeny. Byla zjištěna korelace mezi koncentrací citrulinu a poškozením GIT, což z citrulinu činí ideální biomarker pro gastrointenstinální formu (36). Tato domněnka se potvrdila i v jiné studii na modelu nehumánních primátů (NHP), kde byla použita dávka 10 Gy a hladina citrulinu byla dále zaznamenávána i v následujících dnech (1, 2, 3 a 7 dní) po ozáření (37). NHP modely byly použity k identifikaci proteinových biomarkerů SAA, IL-6 a Flt3L jako indikátorů expozice 7 dní po ozáření (38).

Yi et al. identifikovali změny 18 proteinů v myší krvi po ozáření 100 a 250 μGy/hod. Nejvýraznější změna byla zaznamenána u  glycin-N-methyltransferázy a  nukleofosminu, u  kterých došlo ke zvýšení jejich hladiny, a  glutathion-S-transferázy A3, jejíž hladina se snížila (39).

Leeová et al. použili k identifikaci nových biomarkerů 3 dny po ozáření humanizované myši. Z celkem 46 identifikovaných proteinů reagujících na ozáření byly vybrány jako 4 hlavní biomarkery ozáření FDXR, BAX, DDB2 a ACTN1 (40). Další studie tyto kandidáty (FDXR, DDB2 a ACTN1) identifikovala také v lidské krvi a potvrdila je jako vhodné biomarkery pro odhad dávky záření (14).

Biologické testy prováděné na zvířecích modelech poskytly mnoho užitečných znalostí (biomarkery záření v krvi a moči), do budoucna je ovšem nezbytné výsledky validovat také u lidí. Unikátní příležitost tak v tomto směru poskytují vzorky získané od pacientů s nádorovým onemocněním, kteří podstupují radioterapii (41). Proteinový profil těchto vzorků však může být ovlivněn probíhající malignitou, a není proto vždy snadné odlišit marker reagující na záření od markeru samotného onemocnění.

V  posledním desetiletí byly jako prioritními markery ozáření odhaleny molekuly podílející se na signalizaci poškození DNA, např. kináza ATM, inhibitor cyklin-dependentní kinázy 1A, histon H2AX fosforylovaný na serinu 139 (γH2AX) a protein p53 (42).

Turnerová et al. odebrali vzorky krve od zdravých dárců, jež následně ozářili ex vivo dávkou 0–8 Gy. Došli k  závěru, že vyšší dávky způsobily zvýšení hladiny proteinu γH2AX ve srovnání s  dávkami nižšími (43). Mnoho studií uvedlo podobný závěr o lineární korelaci mezi dávkou a zvyšující se hladinou γH2AX (44). Ohniska γH2AX se objevují v buněčném jádře v místech dvouřetězcových zlomů DNA již 3–15 minut po ozáření, svého maxima pak dosahují zhruba v 30 minut až 1 hodinu po ozáření. Avšak vzorky musejí být odebrány od pacientů co nejdříve po ozáření, jelikož po 24–48 hodinách se fluorescenční signály díky úspěšné reparaci většiny DSB podstatně snižují (43). V  důsledku této časové nestability není γH2AX ideálním kandidátem pro vysokokapacitní biodozimetrii větších populací.

ZÁVĚR

Biomarkery radiačního poškození s potenciálem aplikace v praxi, zejména pro třídění ozářených osob neboli triáž, mohou na rozdíl od fyzikálních dozimetrů poskytnout informace jak o obdržené dávce, tak o účinku IZ na biologické funkce pacienta. Tento přístup zatím není dokonalý a analýza uvedených markerů je poměrně problematická, co se týká znalostí, času a ceny.

V minulosti již bylo navrženo několik metod ke stanovení absorbované dávky, ale žádná z nich není optimální. Nejrozšířenější metodu pro odhad obdržené dávky představuje analýza dicentrických chromosomů (45). Bohužel je časově velmi náročná, a proto nevhodná pro tzv. medicínu katastrof, kde předpokládáme desítky až stovky tisíc suspektně ozářených jedinců. V takových případech potřebujeme rychlé a efektivní metody (46). Několik studií potvrdilo vliv IZ na genovou expresi (14). Gen FDXR představuje horkého kandidáta na radiační biomarker, jelikož jeho exprese se významně zvyšuje během 24 hodin po ozáření v širokém dávkovém rozmezí. O’Brienová et al. nepozorovali rozdíl mezi expresí FDXR u ex vivo a in vivo ozářených vzorků a prokázali její dávkovou závislost (2).

Velmi slibně se jeví výsledky výzkumu zaměřeného na zpracování vlasů, zubů a nehtů. Odběr vzorků je totiž relativně snadný a zářením indukované volné radikály mohou být v těchto vzorcích měřeny pomocí EPR ještě velmi dlouho po ozáření (28, 31).

V neposlední řadě existuje množství proteinů, jejichž hladiny se po ozáření mění dávkově závislým způsobem (47). Ačkoliv je identifikace plazmatických proteinů velmi náročná a pracná, četné proteomické studie identifikovaly radiační biomarkery v plazmě a dalších tkáních (40). Jelikož je však přístup k lidským vzorkům plazmy omezený, většina experimentů byla provedena na zvířecích modelech (10). Metoda ex vivo se zdá být do budoucna vhodným experimentálním modelem pro predikci účinku ozáření in vivo (48).

Současný trend v biologické dozimetrii nespočívá v hledání jediného biomarkeru pro odhad všech dávek (46), nýbrž v použití panelu více „-omických“ biomarkerů s patřičným dávkovým a časovým oknem (49). Dále se zdá být z klinického hlediska důležitější pro triáž predikce účinku IZ než samotná informace o obdržené dávce, i kdyby byla velmi přesná.

Uvážíme-li, že dostupné zavedené biomarkery stále nedisponují optimálními parametry, je přirozené, že vzniká jasná potřeba tento stav zlepšit. Předpokládáme, že s rostoucím úsilím a množstvím finančních prostředků věnovaných na výzkum biologické dozimetrie a s nástupem nových „–omických“ metod se v příštím desetiletí dočkáme výrazného pokroku v této oblasti.

Čestné prohlášení

Autoři práce prohlašují, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku nejsou ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou.

Poděkování

Tato práce vznikla za podpory Ministerstva obrany ČR (Dlouhodobý záměr rozvoje organizace – Zbraně hromadného ničení 1011) a Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy ČR (projekt Specifického výzkumu 2106 – Univerzita Hradec Králové).

Seznam zkratek

ACTN1          alfa-aktinin 1

AEN   apoptosis-enhancing nuclease

ATM   ataxia-telangiectasia mutated kinase

ARS    akutní radiační syndrom

BAX   Bcl2-associated X apoptosis regulator

BBC3  Bcl-2-binding component 3

CCNG1          cyklin G1

CDKN1A       inhibitor cyklin-dependentní kinázy 1

DDB2 DNA damage-binding protein 2

EPR    elektronová paramagnetická rezonance

FDXR ferredoxin reduktáza

Flt3L   FMS-like tyrosine kinase 3 ligand

GADD45A     growth arrest and DNA damage-inducible alpha

GIT     gastrointenstinální trakt

GNMT            glycin-N-methyltransferáza

GSH    redukovaný glutathion

GSTA3           glutathion-S-transferáza A3

HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie

IL        interleukin

IZ        ionizační záření

MS      hmotnostní spektrometrie

MDM2            mouse double minute 2 homolog

MYC   myelocystomatosis oncogene

NAD   nikotinamidadenindinukleotid

NPM   nukleofosmin

PCN    WD repeat-containing protein PCN

PCNA proliferační antigen buněčného jádra

PFKP  destičková izoforma fosfofruktokinázy

PHPT1            protein-histidin fosfatáza

PHLDA3        pleckstrin homology-like domain family A member 3

POLH DNA polymeráza eta

PTGDS           prostaglandin H₂ D-izomeráza

RIS     radiačně indukované signály

SAA    sérový amyloid A

SESN1            sestrin 1

TMEM30A     transmembránový protein 30A

XPC    xeroderma pigmentosum, complementation group C

ZMAT3          zinc finger matrin-type protein 3

Adresa pro korespondenci:

doc. PharmDr. Aleš Tichý, Ph.D.

Fakulta vojenského zdravotnictví UO

Trebešská 1575, 500 01  Hradec Králové

Tel.: 973 253 216

e-mail: ales.tichy@unob.cz