Chromozomové aberace a jejich role v transformaci chronické lymfocytární leukemie v éře léčby inhibitory BCR signalizace

Souhrn

Použití inhibitorů BCR signalizace znamenalo obrovský pokrok v léčbě pacientů s relabovanou/refrakterní (R/R) chronickou lymfocytární leukemií (CLL), zejména s prognosticky negativními cytogenetickými změnami. Navzdory tomu však stále dochází u části pacientů k  transformaci do agresivnějšího lymfoproliferativního onemocnění, tzv. Richterova syndromu (RS). Účinná léčba pacientů s RS v současné době není k dispozici. Pochopení molekulární podstaty transformace je kritické pro vývoj nových léčiv a jejich kombinací.

Klíčová slova:

chronická lymfocytární leukemie – Richterův syndrom – CDNK2A – TP53 – komplexní karyotyp

ÚVOD

Chronická lymfocytární leukemie (CLL) je onemocnění s vysoce variabilním klinickým průběhem. U 2–10 % pacientů dochází k tzv. Richterovu syndromu (RS), transformaci onemocnění do agresivnějšího typu lymfoproliferativního onemocnění s mediánem přežití pouze 2,6–3,5 měsíce [1, 2]. Tento problém přetrvává i v moderní éře léčby inhibitory BCR signalizace (BCRi), kdy onemocnění přechází do RS u třetiny až poloviny progredujících pacientů [3–5].

Nejčastěji se jedná o transformaci do difuzního velkobuněčného lymfomu (DLBCL) [6, 7], méně častěji (< 1 %) dochází k transformaci do klasického Hodgkinova lymfomu (HL) [8, 9]. Vzácně byly také popsány případy transformace do plazmablastického lymfomu a jiných typů lymfomů nebo transdiferenciace do histiocytárního sarkomu [10].

Většina případů RS-DLBCL je klonálně příbuzná s předcházející CLL, tzn. detekujeme u nich stejnou klonální přestavbu těžkých řetězců imunoglobulinu (IGH) jako u původního onemocnění a nejčastěji vykazují nemutovaný stav variabilní oblasti genu IGH (IGHV) [6, 9]. Medián přežití u této skupiny pacientů je kratší než 1 rok. Přibližně u 70 % těchto klonálně příbuzných RS se předpokládá lineární evoluce z původního CLL klonu akumulací dalších aberací [11, 12]. Většina aberací (60 %) získaných během transformace je delečního typu, jedná se o ztráty počtu kopií určitých oblastí genomu. V průměru připadá na jednoho pacienta přes 12 změn počtu kopií a buňky RS představují v tomto modelu konečné stadium evoluce. Zbývající případy klonálně příbuzných RS se vyvíjejí ze společné prekurzorové buňky, potom se ale jejich vývoj rozvětví a buňky RS a CLL prochází svým vlastním klonálním vývojem, dále akumulují rozdílné aberace a existují paralelně vedle sebe [12]. U pacientů s klonálně nepříbuznou transformací pozorujeme nejčastěji mutovaný stav IGHV a nízký výskyt delecí/mutací genu TP53. Prognóza těchto pacientů je podobná jako u  de novo DLBCL [13, 14].

Pro většinu případů transformace do HL (RS-HL) je charakteristický mutovaný stav IGHV, pozitivita viru Epsteina-Barrové (EBV) a klonální nepříbuznost s původní CLL. Připomínají tedy spíše de novo EBV-pozitivní lymfomy vyvinuté u CLL pacientů, avšak o biologické podstatě momentálně není známo nic. Prognóza těchto pacientů je příznivější než u RS-DLBCL [15].

Mechanismus transformace do RS zatím zůstává neznámý. Předpokládá se, že různé typy transformace by měly být doprovázeny specifickými genetickými událostmi a měly by se lišit přítomností různých prediktivních a prognostických faktorů.

PROGNOSTICKÉ A PREDIKTIVNÍ FAKTORY TRANSFORMACE

Klinické rizikové faktory zahrnují pokročilé (III–IV) Rai/Binet stadium v době diagnózy, přítomnost lymfatických uzlin o velikosti 3 cm a více a hladinu sérové thymidinkinázy vyšší než 10 U/l [16]. Další markery asociované s progresí CLL, jako jsou např. zvýšená hladina β2-mikroglobulinu, kratší zdvojovací čas lymfocytů a typ infiltrace v kostní dřeni, nejsou nutně s RS spojeny. Typický je nález nemutovaného stavu IGHV řetězců a zkrácení telomer (< 5000 párů bází) [17]. Jako nejdůležitější prognostický faktor se dnes jeví klonální příbuznost mezi původní CLL a buňkami RS, kdy klonálně nepříbuzné onemocnění představuje lepší prognózu [14]. Klíčovou roli pro stanovení prognózy u CLL mají chromozomové aberace, mezi které patří delece oblastí 13q, 11q, 17p a 6q a trizomie chromozomu 12. Tento skórovací systém však nezahrnuje riziko transformace [18]. Proto v současné době intenzivně probíhá hledání prognostických markerů transformace na cytogenetické a molekulárně cytogenetické úrovni.

REKURENTNÍ CHROMOZOMOVÉ ABERACE

Mezi nejčastější nenáhodné cytogenetické aberace pozorované u RS-DLBCL patří delece genu TP53, delece genů CDKN2A/B a abnormality genu MYC. Tyto aberace obecně spočívají v inaktivaci funkce p53 a aktivaci dráhy MYC a hrají tedy zásadní roli v opravách poškození DNA, kontrole buněčného cyklu a proliferaci [12, 19, 20]. U RS-DLBCL často pozorujeme další cytogenetické abnormality, typická je přítomnost komplexního karyotypu (tři a více klonálních chromozomových aberací) a klonální vývoj. Předpokládá se, že kromě delece oblasti 13q14, aberace TP53 a trizomie chromozomu 12 vzniká většina změn až v době transformace [21].

Delece krátkých ramen chromozomu 17

Delece krátkého ramene chromozomu 17 (17p) představují jednu z nejčastějších chromozomových změn vyskytujících se až u 40 % nemocných s RS, zatímco v době diagnózy CLL je nacházíme pouze u 5–7 % pacientů [12, 16, 18]. Ve většině případů zasahují oblast 17p13.1, kde je lokalizován gen TP53, tumor supresorový gen, který je zodpovědný za opravy poškozené DNA. Jeho aberace vede k nestabilitě genomu a hromadění dalších aberací [22]. Často jsou u těchto pacientů nalézány intrachromozomové přestavby a chromotripse chromozomu 17 [23]. Monoalelické delece bývají u více než 40 % pacientů spojeny s bodovými mutacemi druhé alely, popř. se ztrátou heterozygozity [19].

Delece krátkých ramen chromozomu 9

Další častou cytogenetickou aberací spojenou specificky s transformací je delece na krátkých ramenech chromozomu 9 (9p), která se vyskytuje u více než 30 % případů RS a u CLL pacientů se jinak běžně nevyskytuje. Mono- či bialelická delece nejčastěji postihuje oblast 9p21, kde je lokalizován gen CDKN2A/B (inhibitor cyklin-dependentní kinázy 2A/2B). Tento gen kóduje negativní regulátor buněčného cyklu p15INK4B a protein ARF, který působí jako inhibitor MDM2, negativního regulátoru p53. Delece CDKNA/B proto ve svém důsledku uvolňuje  represi cyklinu D3, CDK1 a CDK2 a vede k down-regulaci TP53. Delece 9p21 bývají až u 50 % případů RS asociovány s delecí/mutací genu TP53 a aktivací genu MYC, zatímco společně s trizomií chromozomu 12 se nevyskytují téměř nikdy [21].

Trizomie chromozomu 12

Trizomie 12 je jednou z dalších velmi častých chromozomových aberací pozorovaných až u 30 % RS, zatímco u CLL v době diagnózy nalézáme trizomii 12 jen v cca 14 % případů [18]. Velmi často se vyskytuje současně s mutacemi v genu NOTCH1 [21].

Další rekurentní chromozomové aberace

Zbylých cca 20 % případů RS má heterogenní profil genetických změn odlišných od výše uvedených skupin. Nejčastěji se u těchto případů vyskytují delece oblastí 7q31, 8p a 14q a zmnožení 8q21, 18q a 13q [21]. Delece dlouhých ramen chromozomu 13 v oblasti 13q14.3 zahrnuje u RS ve srovnání s CLL častěji kromě MIR15/MIR16 i více centromericky umístěný gen RB1. Dále byly u RS ve srovnání s CLL mnohem častěji pozorovány ztráty kopií oblastí 7q31.31–36.3, 8p, 14q23.2 až q32.3 a 15q a zmnožení oblastí 8q, 11q, 13q a 18q. Mezi geny postižené těmito aberacemi patří např. gen POT1 (7q31.33), který je důležitý pro udržování délky telomer, gen TRAF3 (14q32.32) – negativní regulátor nekanonické dráhy NFκB, gen MGA (15q15.1) – negativní regulátor MYC, onkogeny MYC (8q24.21), ETS1 (11q24.3), MIR17HG (13q31.3) a BCL2 (18q21.33). V žádném z těchto výše uvedených genů ale nebyly nalezeny bodové mutace [12].

ČETNOST KVANTITATIVNÍCH GENOMICKÝCH ABERACÍ

Počet kvantitativních genomických aberací se zvyšuje během progrese CLL až k transformaci do RS-DLBCL [19]. Podle Chigrinova et al. se nejvíce změn nachází u pacientů s de novo DLBCL, jedná se zejména o přestavby genů BCL6 a BCL2, které se naopak nevyskytují u RS-DLBCL. Tyto odlišné molekulárně genetické profily svědčí pro rozdílnost obou entit. Pacienti s RS-DLBCL se na úrovni komplexnosti genomických změn pohybují mezi pacienty před transformací CLL a de novo DLBCL. Nejčastější typické aberace u RS-DLBCL jsou již zmiňované delece oblastí 17p13 a 9p21 (delece CDKN2A/2B se vyskytuje výhradně u RS-DLBCL a DLBCL, a je tak považována za nejtypičtější změnu doprovázející transformaci) a trizomie chromozomu 12. Kromě těchto změn pozorovali autoři také zmnožení oblastí 8q, 13q, 15q a 18q, ve kterých docházelo k amplifikacím známých onkogenů: JAK2 (9p24.1), MIR17HG (13q31.3), MYC (8q24.1) a BCL2 (18q21.3). Mezi oblasti s nejčastěji pozorovanými delecemi patřily například regiony 13q14.2–q14.3 (DLEU2/MIR15A/MIR16-1) a 14q24.2–q32.33, 6q a 9q. Některé aberace se vyskytovaly se stejnou frekvencí u pacientů ve fázi CLL i RS-DLBCL, např. delece 13q14.3 (DLEU2/MIR15A/MIR16), delece 17p13 (TP53) a 11q21–q23 (ATM), 8p, ale i trizomie chromozomu 12 a zmnožení 2p25.3–p12 (REL, MYCN). Pokud ale autoři ze skupiny CLL vybrali pacienty, u kterých se posléze vyvinul RS, vykazovali tito vyšší frekvenci určitých specifických genomických aberací ve srovnání s pacienty CLL bez transformace.

GENETICKÉ RIZIKOVÉ FAKTORY V ÉŘE TERAPIE BCR INHIBITORY

Léčba CLL pacientů se během posledních let velmi dramaticky změnila, nastoupily nové cílené léky, které inhibují klíčové B-buněčné signální dráhy [24]. V současnosti se u prognosticky nepříznivých R/R CLL používají k léčbě inhibitory BCR signalizace (BCRi), jako je např. ibrutinib nebo idelalisib, nebo inhibitor BCL2 proteinu venetoclax. Nicméně ani tato moderní léčba nedokáže u pacientů zabránit vzniku rezistence, progresi onemocnění a případně jeho transformaci. Molekulární podstata transformace CLL při léčbě BCRi však zatím zůstává nejasná. Objevují se první publikace týkající se této problematiky, například autoři Miller et al. [25] se domnívají, že by potenciálním prognostickým faktorem transformace CLL na léčbě ibrutinibem mohla být near-tetraploidie. Near-tetraploidie, tedy přítomnost čtyř kopií většiny chromozomů v jedné buňce (počet chromozomů 81–103), je cytogenetická abnormalita, která už byla popsána u různých typů lymfomů. U CLL se však téměř nevyskytuje. Autoři popsali near-tetraploidii u 9 z 297 pacientů s CLL, u šesti pacientů z těchto devíti se později na léčbě ibrutinibem vyvinul RS. Near-tetraploidie však byla doprovázena delecí genu TP53 a u všech případů také komplexním karyotypem. Nelze tedy s jistotou říci, zda můžeme near-tetraploidii považovat za nezávislý prognostický faktor, nebo zda hlavní roli sehrává přítomnost komplexního karyotypu. U dalších 12 pacientů, kteří v této studii transformovali do RS, nebyla near-tetraploidie popsána, ale byl zachycen komplexní karyotyp. Autoři neměli k dispozici sériové vzorky, takže nebylo možné určit, kdy se přesně near-tetraploidie objevily, zda před léčbou ibrutinibem, v průběhu léčby nebo až v době transformace. V našem centru jsme sledovali 5 pacientů s R/R CLL, kteří vyvinuli RS při léčbě ibrutinibem a kteří byli cytogeneticky vyšetřeni, avšak u žádného z nich nebyla near-tetraploidie prokázána. U jedné pacientky jsme prokázali přítomnost hypertriploidního klonu (71–76 chromozomů). Hypertriploidie nebyla zachycena před léčbou ibrutinibem, detekovali jsme ji až v době transformace. U všech pacientů však byl již v době zahájení léčby BCRi detekován komplexní karyotyp, jehož součástí byly aberace chromozomů 9, 13 a 17 [26].

Cytogenetická data o CLL pacientech transformujících na léčbě idelalisibem nebo venetoclaxem zatím nejsou k dispozici.

Mutace v genu BTK (Brutonova tyrozinkináza), které jsou zodpovědné za rezistenci vůči ibrutinibu [27], byly u pacientů s rezistencí zachyceny pouze v CLL klonu, v buňkách RS se nevyskytovaly. Tento fakt svědčí pro rozvětvený klonální vývoj z původní prekurzorové buňky. Jedinou rekurentní novou aberací, která se objevila při paralelním klonálním vývoji v buňkách RS ve srovnání s CLL, bylo zmnožení 8q [19]. Podstata transformace tak zůstává stále neznámá. Role terapie jako spouštěče RS je nejasná a stále diskutovaná. Ačkoli je výskyt RS u pacientů léčených BCRi vyšší, je za to zřejmě zodpovědná spíše vysoká předléčenost nemocných, přítomnost vysoce rizikových chromozomových aberací a agresivních subklonů.

Možné indikace k novým terapeutickým cílům u RS vycházejí z pozorovaných amplifikací genů JAK2 a JMJD2C (9p24.1), MIR17HG (13q31.3) a BCL2 (18q21.33), které jsou přímo zapojeny v pozitivní regulaci onkogenu MYC. Významnou roli genu MYC v patogenezi RS dále potvrzují nálezy jeho amplifikace. MIR17HG se také podílí na aktivaci PI3K/AKT/mTOR dráhy. Tyto aberace se zdají být vhodným cílem terapií JAK2, MYC, BCL2 a PI3K inhibitory [19].

ZÁVĚR

Heterogenní průběh onemocnění CLL lze vysvětlit variabilitou mnoha různých faktorů, mezi jinými i cytogenetických a molekulárně cytogenetických změn, které tuto diagnózu doprovázejí. V současné době ale není známa žádná specifická chromozomová aberace ani kombinace více aberací, které by byly samy o sobě spouštěčem transformace CLL. U různých případů se liší jak nalezené změny, tak i jejich počet. Obecně se však dá říct, že pro 90 % pacientů je typický klonální vývoj a přítomnost komplexního karyotypu, který zahrnuje kombinaci aberací TP53, NOTCH1, MYC a CDKN2A/B. Zdá se tedy, že se u RS nejedná primárně o postižení specifických B-buněčných signálních drah, jako je tomu u progrese a chemorezistence CLL, ale klíčovými událostmi transformace budou spíše obecně deregulace protinádorových drah, kontroly buněčného cyklu a proliferace. Svůj podíl na patogenezi RS mohou mít také dosud neidentifikované somatické mutace nebo epigenetické změny, jako např. specifické metylace. Sériová cytogenetická a molekulárně cytogenetická data jsou zatím u pacientů s RS na BCRi poměrně vzácná a pro pochopení příčiny transformace je nutné další studium. Pro přesné určení změn probíhajících v nádorové buňce je nezbytná kombinace dostupných cytogenetických, molekulárně cytogenetických a genomických metod. Kromě klasické cytogenetiky k vyšetření chromozomových aberací a přítomnosti komplexního karyotypu je u pacientů s podezřením na RS vhodné bohatit klasický FISH CLL panel o sondy mapující oblasti 8q24 (MYC), 9p21 (CDKN2A/B) a 2p. Další nebalancované chromozomové aberace lze určit také pomocí arrayCGH a v případě prokázané transformace se jeví jako prognosticky významné určení mutačního stavu IGHV pro stanovení klonální příbuznosti CLL a RS.

Podíl autorů na přípravě rukopisu

HU: příprava první a finální verze rukopisu.

LK, MH, RU, PT: připomínkování a korektura rukopisu.

TP: připomínkování a závěrečná kontrola rukopisu.

Poděkování

Podpořeno granty MZ ČR VES16-32339A, MEX-1 (87-91), IGA_LF_2019_001 a MZ ČR_RVO (FNOL, 00098892).

Čestné prohlášení

Autoři práce prohlašují, že vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou. Autoři deklarují tento možný střet zájmů:

Papajík T.: Gilead, Janssen, Abbvie – cestovní a výzkumné granty, konzultace, prezentace

Turcsányi P.: Gilead, Janssen, Abbvie – cestovní a výzkumné granty, konzultace, prezentace

Do redakce doručeno dne 15. 11. 2019.

Přijato po recenzi dne 10. 1. 2020.

Mgr. Helena Urbánková, Ph.D.

Hemato-onkologická klinika LF UP a FN Olomouc

I. P. Pavlova 6

779 00 Olomouc

e-mail: Helena.Urbankova@fnol.cz