Hledání ztraceného ráje – alternativní místa pro transplantaci izolovaných Langerhansových ostrůvků

Souhrn

Transplantace Langerhansových ostrůvků představuje zavedenou metodu léčby pacientů s diabetem 1. typu se syndromem porušeného vnímání hypoglykemie, u kterých selhává použití moderních technologických postupů. Nejčastěji se jedná o radiointervenční metodu, při které se suspenze pankreatických ostrůvků podává perkutánně zavedeným katétrem do větve portální žíly. Ačkoliv se na rozdíl od orgánové transplantace pankreatu jedná o výkon jen minimálně invazivní, řada technických problémů zůstává nevyřešena. Mezi možné komplikace patří zejména krvácení a trombóza portální žíly. Na rozdíl od svého přirozeného umístění disperzně ve tkáni exokrinního pankreatu jsou izolované transplantované ostrůvky v jaterním parenchymu vystaveny bezprostřední hypoxii, přímému působení toxinů a imunosupresivních léčiv. Přímý kontakt s krví příjemce vyvolává bezprostřední zánětlivou reakci, tzv. IBMIR (instant blood mediated inflammatory reaction), díky které i více než polovina transplantovaných buněk po aplikaci zaniká. Velikost ostrůvkového štěpu je proto často nedostatečná a řada pacientů potřebuje po výkonu určité množství exogenního inzulinu. To všechno jsou důvody, proč hledáme pro ostrůvkový štěp jiné místo transplantace s příznivějšími podmínkami pro dlouhodobé přežívání. V experimentálním i klinickém výzkumu byla zkoušena různá aplikační místa, jejichž výhody a nevýhody shrneme v tomto sdělení. Jako nejnadějnější se v současné době jeví transplantace do velkého omenta, která již byla na několika pracovištích klinicky použita.

Klíčová slova:

syndrom porušeného vnímání hypoglykemie – diabetes mellitus 1. typu – transplantace – Langerhansovy ostrůvky – omentum

ÚVOD

Transplantace Langerhansových ostrůvků představuje dnes již zavedenou metodu léčby pro vybrané pacienty s diabetem 1. typu se syndromem porušeného vnímání hypoglykemie. Ve střednědobém horizontu se v některých centrech výsledky již začínají blížit výsledkům po orgánové transplantaci pankreatu [1]. K dosažení úplné nezávislosti na inzulinu je však často potřeba transplantaci jednou či dvakrát opakovat [2]. Langerhansovy ostrůvky se získávají procesem izolace z dárcovského pankreatu digescí pomocí enzymu kolagenázy a následně jsou od exokrinní tkáně odděleny v hustotním gradientu. Samotná transplantace tkáňové suspenze pankreatických ostrůvků se provádí nejčastěji radiointervenčně aplikací do větve portální žíly perkutánně zavedeným katétrem. Ostrůvky se následně usadí v jaterních sinusoidách.

Pankreas – přirozené prostředí pro Langerhansovy ostrůvky

Ačkoliv tvoří ostrůvky pouze 1–2 % celkové tkáně pankreatu, jejich krevní zásobení zahrnuje až z 20 % všech terminálních arteriol pankreatu. Průtok krve ostrůvky je přibližně desetkrát vyšší než v exokrinním pankreatu, a proto jeho narušení vede snadno k hypoxickému poškození [3]. Uspořádání jejich cévního řečiště usnadňuje parakrinní signalizaci mezi buňkami ostrůvků a exokrinního pankreatu [4]. Pro správnou funkci β-buněk ostrůvků jsou zásadní složení a mikroarchitektonika okolního prostředí, kontakty s proteiny extracelulární matrix a autonomní nervové zásobení. β-buňky komunikují s ECM přes integrinové receptory, tento kontakt je důležitý zejména pro přežívání a glukózou regulovanou sekreci inzulínu [5]. Při procesu izolace z exokrinního prostředí s použitím enzymatických a hrubých mechanických prostředků se vazby mezi ostrůvky, exokrinními buňkami a proteiny extracelulární matrix kompletně přeruší. Ostrůvky tak ztrácejí svůj ráj a jejich další osud značně závisí na tom, jak se nám při transplantačním procesu podaří jej napodobit.

Transplantace ostrůvků do jater

Implantace izolovaných ostrůvků cestou vena portae je zatím dlouhodobě nejúspěšnější metodou využívanou v klinické praxi. Jedná se o miniinvazivní výkon, který nevyžaduje celkovou anestezii. Rekonvalescence je krátká v řádu dní a výskyt komplikací je ve srovnání s orgánovou transplantací malý. Jedním z rizik po aplikaci tkáňové suspenze je zvýšení portálního tlaku. Čím méně je výsledný produkt zbavený exokrinní tkáně, a tím tedy objemnější, tím více může tlak ve vena portae během transplantace stoupnout. Dalšími riziky výkonu jsou žilní trombóza nebo naopak krvácení. Funkce jater po transplantaci sice nebývá alterována, ale v okolí ostrůvků se mohou tvořit okrsky steatózy a amyloidu [6]. Alotransplantace dále vyžaduje chronickou imunosupresivní léčbu.

Jaterní parenchym není pro ostrůvky metabolicky ani imunologicky příznivým prostředím. V jaterních sinusoidách si mísí arteriální a portální žilní krev. Ostrůvkový štěp je zde vystaven nízké tenzi kyslíku, což je významné zejména v období, než se obnoví kapilární zásobení. Díky kombinaci nepříznivých faktorů zaniká časně po transplantaci významná část štěpu [7].

Indikace k transplantaci

Nejčastější indikací k transplantaci Langerhansových ostrůvků je syndrom porušeného vnímání hypoglykemie při léčbě inzulinem. Diabetes je u takových pacientů velmi nestabilní a provázený život ohrožujícími hypoglykemiemi. Z hlediska jeho léčby jsou výsledky transplantace ostrůvků velmi dobré [11]. Přežívání štěpů je však v dlouhodobém měřítku stále nižší než při orgánové transplantaci pankreatu [12]. Kromě zlepšování stávající intraportální metody se výzkum zaměřuje na hledání nových výhodnějších míst pro aplikaci ostrůvkového štěpu.

Pro pacienty s diabetem 1. typu a chronickým onemocněním ledvin je možná kombinovaná transplantace ledviny a pankreatických ostrůvků. Operační zákrok je kratší a pro pacienta méně zatěžující, proto se k této variantě může přiklonit u pacientů starších s pokročilými komplikacemi [13].

Autotransplantace Langerhansových ostrůvků se provádí u pacientů s chronickou pankreatitidou, kteří jsou indikováni k totální pankreatektomii.

Alternativní místa transplantace

Nové místo transplantace by mělo lépe vyhovět nárokům ostrůvků na přísun kyslíku. Mělo by být jednoduše dostupné, transplantace by měla být pro příjemce co nejméně zatěžující a výhodou by byly také přístup k biopsii štěpu či možnost graftektomie, což může být důležité zejména u vyvíjejících se metod s použitím biologicky modifikované ostrůvkové tkáně. Některá místa by rovněž mohla poskytovat imunologickou ochranu, což by umožnilo redukování či vysazení imunosupresivní léčby. Na zvířecích modelech i v klinických experimentech bylo vyzkoušeno několik alternativních míst, žádné však zatím nedosahuje výsledků jako při transplantaci do portálního řečiště [14].

Příznivě se vyvíjí technika implantace do velkého omenta, která se v experimentu i v klinické praxi provádí i v našem centru. Vyžaduje ale laparoskopickou operaci, a je tudíž technicky rovněž náročná. Splňuje však požadavky pro případně větší objem štěpu, který se v omentu nedostane do přímého kontaktu s krví příjemce [15]. Přehled klinicky či experimentálně používaných míst pro implantaci shrnuje (Tab. 1).

Pankreas, stěna gastrointestinálního traktu

Jako přirozené prostředí ostrůvků k transplantaci se nabízí pankreas. Transplantace do pankreatu je však technicky invazivní s rizikem pankreatitidy. Nevýhodou je též riziko návratu autoimunitní reakce ve štěpu, která byla příčinou vzniku samotného diabetu 1. typu. Implantace ostrůvků pod kapsulu pankreatu jako alternativa k transplantaci do portálního řečiště byla zkoušena pouze na malých hlodavcích a na psech při autotransplantaci po parciální pankreatektomii. I přes uspokojivé výsledky v experimentu u hlodavců nebyl tento přístup pro svou invazivitu a rizika dále použit u primátů ani jiných větších zvířat [16].

Jako další možné místo k transplantaci se nabízí stěna žaludku či duodena. Submukóza žaludku i duodena má denzní vaskulární síť, která by zajistila dostatečné zásobení ostrůvků kyslíkem a živinami. Střevní submukózní matrix poskytuje v buněčných kulturách beta buňkám příznivé prostředí [17]. Výhodou je možnost laparoskopické či endoskopické transplantace do stěny zažívacího traktu, snadný přístup k biopsii, a tím k následnému sledování přežívání štěpu. Tento přístup k transplantaci byl v experimentu zkoušen na drobných hlodavcích, psech a prasatech [18]; na syngenním modelu došlo k nastolení normoglykemie a po explantaci štěpu byla prokázána regenerace beta buněk s minimálními zánětlivými infiltráty [19]. Autologní transplantace ostrůvků do sliznice žaludku u lidí byla provedena u 2 pacientů, alogenní transplantace u 1 pacienta s poklesem potřeby inzulinu na méně než 50 % původní dávky [20,21].

Renální kapsula

Implantace Langerhansových ostrůvků pod pouzdro ledviny je již dlouhodobě využívána k transplantačním experimentům a studiu metabolismu štěpu. Ten se dá po výkonu bioptovat či jednoduše explantovat k histologickému hodnocení. I přes systémovou žilní drenáž štěpu jsou výsledky experimentálních transplantací uspokojivé, štěp pod renální kapsulou rychle nastolí normoglykemii na malých i velkých zvířecích modelech, má nejkratší operační čas a nejnižší mortalitu [22]. Pod pouzdro ledviny se dá transplantovat pouze omezený objem štěpu. Nevýhodou je nízká tenze kyslíku a relativní invazivita výkonu. Lidské pouzdro ledviny je málo elastické a nepojme velké objemy. Proto se k lidským transplantacím jako léčebné metodě nepřistupuje [23].

Slezina

Výhodou transplantace do sleziny jsou: příznivé cévní zásobení s portální žilní drenáží, relativně snadný operační přístup a tolerance větších objemů nepurifikovaných štěpů. Ostrůvky mohou být transplantovány přes splenickou žílu či přímo do dřeně sleziny [24,25]. Při transplantaci do žíly je stále přítomno riziko rozvoje nespecifické zánětlivé reakce při kontaktu štěpu s krví příjemce. Autotransplantace ostrůvků do sleziny u psů mají obdobné výsledky jako transplantace do jater [26]. Přestože je slezina metabolicky příhodné místo k transplantaci, neskýtá proti játrům žádné jasné výhody. Aplikace ostrůvků do sleziny je riziková stran krvácení nebo vzniku infarktu sleziny. Při totální pankreatektomii je slezina často odstraňována, což limituje toto potenciální místo při použití u autotransplantací.

Kostní dřeň

Kostní dřeň má výborné cévní zásobení a pro transplantované ostrůvky dostatečnou tenzi kyslíku. Při aplikaci ostrůvků nedochází k rozvinutí IBMIR. Kostní dřeň je jednoduše přístupná k transplantaci i následnému sledování štěpu. Po transplantaci nebyly pozorovány nežádoucí účinky na hematopoézu. Imunoprotektivita je sice sporná, v literatuře se objevují doklady o toleranci ostrůvkových antigenů a hyporesponzitivitě, stejně tak i o nedostatečné odpovědi na T-depleční imunosupresi a o zvýšeném riziku rejekce [27,28]. Jako příhodné místo se nabízejí femur, tibie či lopata kosti kyčelní. Metabolické výsledky na zvířecích modelech mají nadějné výsledky [29], k posouzení efektu u lidí je třeba více klinických studií [30].

Přední komora oka, thymus a ostatní imunopriviligovaná místa

Transplantace malého objemu tkáně, jako je purifikovaný štěp Langerhansových ostrůvků, dává možnost využití tzv. imunoprivilegovaných míst – thymu, mozkových komor, varlete či přední oční komory. Mechanismy imunologické bariéry jsou komplexní, zahrnují např. Th2-like odpověď, snížení počtu paměťových CD8+ T buněk a zvýšení počtu alospecifických CD4+CD25+ regulačních T buněk. Cílem transplantace do těchto míst je snížení dávek či úplné vysazení imunosupresivní léčby, což se ale zatím ani na zvířecích modelech nedaří [31]. Klinická studie transplantace ostrůvků do přední komory oka u nevidomých pacientů s diabetem 1. typu probíhá v Miami (NCT02846571) [32].

Podkoží

Transplantace Langerhansových ostrůvků do podkoží patří v současnosti mezi nejstudovanější alternativy. Nespornou výhodou je minimálně invazivní přístup, jednoduché zobrazování a v případě potřeby snadná biopsie nebo graftektomie. První studie na zvířatech prokázaly, že pouhá aplikace ostrůvků do podkoží není dostatečná, nejspíš díky nedostatečné vaskularizaci, nízké tenzi kyslíku a mechanickému stresu [33]. Proto se výzkum v posledních letech zaměřil na modifikaci subkutánního prostoru, zejména prevaskularizaci s použitím různých komůrek a insertů, nebo lokální aplikaci vaskulárních růstových faktorů. Cílem je připravit komůrku – makroskelet, který by bylo možné implantovat do podkoží a do něj aplikovat izolované dárcovské Langerhansovy ostrůvky nebo v laboratoři připravené inzulinprodukující buňky. Materiál makroskeletu musí zajistit ochranu štěpu před buňkami imunitního systému, ale zároveň musí být dostatečně porézní pro obousměrnou difuzi kyslíku a metabolitů.

V Laboratoři Langerhansových ostrůvků IKEM využíváme v experimentu makroporézní komůrky vyrobené ze silonu (Obr. 1), k jejichž prevaskularizaci vede přirozené hojení podkožní tkáně po implantaci do abdominální krajiny. Při optimálním načasování transplantace Langerhansových ostrůvků od vložení komůrky do podkoží jsme schopni navodit normoglykemii u diabetických potkanů i pomocí hraniční velikosti štěpu ostrůvků [34].

Několik implantabilních zařízení již prochází klinickými zkouškami. Jedná se většinou o tubulární nebo planární selektivně permeabilní makroskelety. Mohou být implantovány do peritoneální dutiny, do velkého omenta nebo do podkoží [35]. Doposud prokazují dobrou bezpečnost, avšak nadále se čeká na výsledky jejich účinnosti. Nejvýznamnějšími jsou βAir (Beta O2Technologies, Rosh-Haayin, Israel) [36], ViaCyte (San Diego, USA) [37], Cell pouch (Sernova) [38] a MailPan (CEED, Defymed) [39].

Sval

Intramuskulární transplantace má výhodu jednoduchého přístupu, jedná se o příznivé místo pro implantaci např. příštítných tělísek [40]. Snadné jsou taktéž zobrazování, biopsie či explantace štěpu [41]. Štěp umístěný do svalu bohužel čelí časné hypoxii z nedostatečné neovaskularizace, která vede k apoptóze buněk, infiltraci štěpu makrofágy a fibrotizaci [42]. Lepší výsledky při aplikaci do svalu mají studie, kdy byl ostrůvkový štěp do svalu aplikován v několika menších injekcích [43]. Dokumentován je případ úspěšné autotransplantace ostrůvků u pacienta po totální pankreatektomii do m. brachioradialis [44].

Omentum

Velké omentum je dobře vaskularizovaná duplikatura peritonea, která je jako možné místo transplantace Langerhansových ostrůvků studována již od 80. let minulého století [45]. Omentum pojme velké objemy tkáně i nepurifikovaných ostrůvků. Štěp je možné laparoskopicky či z laparotomie aplikovat mezi listy omenta [46] anebo celý do omenta zabalit. To skýtá výhodu oproti transplantaci do portální žíly, kdy při infuzi velkých objemů vzniká riziko portální hypertenze či trombózy portální žíly. Ostrůvkový štěp v omentu není přímo vystaven krvi příjemce, proto je zde nižší riziko spuštění nespecifické zánětlivé reakce. Rizikem výkonu je, kromě jiných, vznik adhezí a střevní obstrukce.

Metabolická funkce samotného štěpu v omentu však v experimentu nikdy nedosahovala uspokojivých dlouhodobých výsledků. Dalším krokem je proto příprava matrix, která by ostrůvky v omentu udržela na místě, byla by dobře prostupná pro kyslík a živiny a podpořila by neovaskularizaci štěpu. Jedním ze směrů výzkumu je příprava prevaskularizovaných makroskeletů, komůrek z umělých materiálů. V experimentech na diabetických potkanech dochází po transplantaci ostrůvků do makroskeletu v omentu úspěšně k nastolení normoglykemie [47].

Další možností, jak zlepšit přežívání ostrůvků v omentu, je úprava média, ve kterém jsou ostrůvky transplantovány. V Diabetes Research Institute (DRI) v Miami vznikl projekt biodegradabilního fibrinového lepidla – ostrůvky jsou transplantovány na omentum resuspendované v plazmě příjemce a překryty rekombinantním thrombinem [48]. Tímto se spustí koagulační kaskáda a tvorba fibrinového gelu, omentum je přeloženo přes sebe a v gelu aplikované ostrůvky zůstávají na místě bez nutnosti další sutury. Fibrinový gel umožňuje difuzi kyslíku v časných fázích přihojení štěpu a nebrání prorůstání nových cév. Tato metoda byla úspěšně vyzkoušena v Miami na zvířecím modelu [49] a na základě výsledků byla použita u 3 pacientů s diabetem 1. typu se syndromem porušeného vnímání hypoglykemie. Došlo u nich k redukci dávek inzulinu a zlepšení vnímání hypoglykemií [50]. V Čechách byla tato metoda zkoušena od roku 2017 s použitím humánního thrombinu v experimentu (Obr. 2) [51], v roce 2019 byla transplantace laparoskopicky provedena u první pacientky (Obr. 3). Další pacient tento výkon podstoupil z laparotomie v roce 2020 (Obr. 4). Během 9 měsíců po transplantaci přetrvávala obnovená produkce C-peptidu, nevyskytovaly se závažné ani středně těžké hypoglykemie, výrazně klesla potřeba inzulinu a zlepšilo se vyrovnání diabetu [52].

„Bioarteficiální“ pankreas

Žádné z dosud studovaných míst k transplantaci zatím nedokáže plně nahradit mikroprostředí ostrůvků v pankreatu. Proto se výzkum obrací k metodám tkáňového inženýrství, regenerativní medicíny a přípravě tzv. „bioarteficiálního“ pankreatu. Cílem těchto metod je transplantovat ostrůvky či experimentálně připravené inzulin produkující buňky v ochranném prostředí ve formě umělých komůrek, proteinových lešení nebo hydrogelů. Tyto konstrukty lze obohatit o růstové faktory k podpoře lokální angiogeneze a spolu s inzulin produkujícími buňkami je do nich možné aplikovat směsi mezenchymálních a endoteliálních kmenových buněk [53]. Použití kmenových buněk v experimentu podporuje neovaskularizaci štěpu a buněčné produkty ukotvují štěp v prostoru [54].

Z přirozených materiálů pro makroenkapsulaci štěpu jsou vyvíjeny decelularizované skelety celých pankreatů, jež obsahují strukturální proteiny extracelulární matrix bez buněčného materiálu. Tyto proteiny buňkám zprostředkovávají signály k diferenciaci, proliferaci, migraci a podporují jejich funkce [55]. Vytvořená bezbuněčná nativní proteinová lešení mohou být kromě ostrůvků znovu osídlena i podpůrnými typy buněk. Celý konstrukt je poté připraven k transplantaci [56].

Komůrky a membrány, do kterých se implantuje celý ostrůvkový štěp, musejí být dostatečně porézní, aby nedocházelo k hypoxii ostrůvků, ale zároveň musejí buňky ochránit před imunitním systémem. Používány jsou např. prevaskularizované komůrky z umělých materiálů obsahující proangiogenní růstový faktor VEGF [57]. Na zvířecím modelu diabetických potkanů dochází po transplantaci ostrůvků do komůrky v omentu k nastolení normoglykemie [47].

Vzhledem k velmi omezenému množství dárcovských pankreatů je snahou připravit jiný zdroj inzulin produkujících buněk. Jednou z možností je využití reprogramovaných non-beta buněk (např. endokrinních alfa buněk a exokrinních acinárních buněk) vytvořených technologií transdiferenciace, tzn. vnášením specifické skupiny regulačních transkripčních faktorů do buněk [58]. Dalším zkoumaným zdrojem jsou lidské indukované pluripotentní kmenové buňky nebo embryonální kmenové buňky, které však mají rizikový mutagenní potenciál a zatím limitovanou životnost [54].

Transplantace inzulin produkujících buněk v implantabilních zařízeních ve formě „bioarteficiálního“ pankreatu (komůrky, decelularizované skelety) u lidských pacientů je jistě nadějným řešením, ale zatím nemá svoje jasné klinické ukotvení.

ZÁVĚR

Ráj pro transplantované Langerhansovy ostrůvky zatím nalezen nebyl. Nejlepší výsledky má i přes své nedostatky transplantace ostrůvků do jater [14]. Transplantace do omenta může být vhodným pacientům nabízena jako alternativa intraportální transplantace nebo se dá využít u pacientů s jaterním onemocněním či s anomáliemi cévního zásobení jater. Metoda je dále vhodná pro transplantaci větších objemů, např. při autotransplantacích, kdy by následkem transplantace hrozil rozvoj portální hypertenze. Transplantace do omenta sice vyžaduje celkovou anestezii, ale komplikace po výkonu jsou minimální. Ostatní alternativní transplantace jsou nadále více či méně úspěšně předmětem výzkumu.

Transplantační léčba diabetu jde ruku v ruce s moderními technologiemi a vývojem „arteficiálního“ pankreatu, tzv. uzavřené smyčky systému kontinuální monitorace glukózy a inzulinové pumpy. Od loňského roku jsou pro naše pacienty dostupné dvě poloautomatické smyčky dodávání inzulinu hrazené ze zdravotního pojištění. Inzulinová pumpa na podkladě dat o hladině glukózy přicházejících ze senzoru dokáže upravit dávku bazálního inzulinu anebo i poslat malý korekční bolus. Léčba diabetu za pomoci senzorů hladiny glukózy, případně ve spojení senzoru s inzulinovou pumpou s možností prediktivního zastavení dodávky inzulinu, by měla vždy předcházet indikaci transplantace [59].

Tento projekt byl podpořen grantem Ministerstva zdravotnictví České republiky č. 17-29009A a grantem Univerzity Karlovy, 1. lékařské fakulty č. 119.

Konflikt zájmů

Autoři článku prohlašují, že nejsou v souvislosti se vznikem tohoto článku ve střetu zájmů a že tento článek nebyl publikován v žádném jiném časopise, s výjimkou kongresových abstrakt a doporučených postupů.

MUDr. Zuzana Hladíková

Centrum diabetologie

Institut klinické a experimentální medicíny,

Praha

e-mail: zuzana.hladikova@ikem.cz

ORCID: 0000-0002-6545-3911