Nový cíl specifické protinádorové léčby mnohočetného myelomu – endoplazmatické retikulum a jeho signální dráhy

Souhrn

Východiska: Endoplazmatické retikulum (ER), organela tvořená soustavou cisteren a tubulů, je esenciální pro řadu buněčných dějů, mj. pro syntézu a transport proteinů. Pokud se chybně složené proteiny hromadí v lumen ER, dochází k rozvoji stresu ER, přičemž následnou odpovědí na narušení homeostázy je aktivace signální dráhy UPR (z angl. unfolded protein response, tj. odpověď na přítomnost nesbalených proteinů). Cílem procesu je obnovit homeostázu zvyšováním kapacity ER a jeho schopnosti skládat proteiny. K aktivaci homeostatické UPR dochází prostřednictvím některého ze tří transmembránových proteinů, kterými jsou enzym vyžadující inositol 1a (inositol-requiring enzyme 1a – IRE1a), kináza ER podobná R kináze (proteine kinase R-like ER kinase – PERK) a aktivující transkripční faktor 6 (activating transcription factor 6 – ATF6). V případě selhání pokusu o obnovu homeostázy naopak dochází prostřednictvím hyperaktivace týchž proteinů k rozvoji terminální UPR a apoptóze. Aktivace různých větví UPR byla popsána u mnoha nádorových onemocnění vč. mnohočetného myelomu (MM), který se vyznačuje maligní transformaci plazmatických buněk a zvýšenou syntézou monoklonálního imunoglobulinu, kdy je role ER zvláště podstatná. Navzdory pokrokům v léčbě MM zůstává onemocnění jen obtížně léčitelné a cílení na signální dráhy spojené s UPR by mohlo např. podpořit účinek inhibitorů proteazomu.

Cíl: Tato práce si klade za cíl představit molekulární odpověď na stres ER za fyziologických okolností i v kontextu nádorových onemocnění, a to zejména s přihlédnutím k potenciálním terapeutickým cílům u MM.

Klíčová slova:

mnohočetný myelom – endoplazmatické retikulum – signální dráha UPR

Úvod

Mnohočetný myelom (MM) je hematoonkologické onemocnění způsobené maligní transformací plazmatických buněk v kostní dřeni [1].

Endoplazmatické retikulum (ER) tvoří složitý systém membrán a tubulů soustředěných kolem jádra (obr. 1). Strukturně lze rozlišit dva typy ER, drsné a hladké. Drsné ER je tvořeno převážně plochými cisternami, na jejichž povrch je navázáno velké množství ribozomů. Tyto ribozomy překládají proteiny do cisteren ER prostřednictvím signální sekvence, která slouží jako ligand pro translokon [2–5]. V lumen ER jsou nascentní polypeptidy pomocí chaperonů a enzymů skládány a modifikovány (N-glykosylace), a získávají správnou terciární strukturu [6]. Hladké ER je tvořeno převážně tubuly a na rozdíl od drsného ER na něj nenasedají ribozomy, jeho funkce spočívá zejména v syntéze lipidů [2,3]. V plazmatických buňkách převládá drsné ER, často v podobě dilatovaných a vakuolizovaných cisteren. Primární funkcí ER plazmatických buněk je proteosyntéza, skládání a kontrola kvality imunoglobulinů. Podobně maligní plazmatické buňky vytvářejí stejným mechanizmem paraprotein [7].

Správný průběh proteosyntézy a skládání proteinů a jejich průchod ER je komplikovaný biochemický děj. Chybně syntetizované nebo poskládané proteiny jsou degradovány prostřednictvím ER-asociované degradace. Pokud vzniká nesprávně složených proteinů velké množství, začnou se hromadit v lumen ER, dochází k selhání homeostázy ER a nastalý stav je označován jako stres ER. Buňka na něj reaguje zvýšením kapacity a schopnosti ER skládat proteiny. K tomu slouží signální a metabolický proces souhrnně označovaný jako odpověď na přítomnost nesbalených proteinů (unfolded protein response – UPR) [8].

Molekulární odpověď na stres ER

UPR je molekulárním nástrojem buňky, jak kompenzovat narušení homeostázy ER a proteosyntézy. K aktivaci UPR dochází třemi cestami, prostřednictvím tří transmembránových proteinů, které fungují jako senzory nahromaděných nesprávně poskládaných proteinů v ER. Jedná se o tyto transmembránové proteiny: enzym vyžadující inositol 1a (inositol-requiring enzyme 1a – IRE1a), kináza ER podobná R kináze (protein kinase R-like ER kinase – PERK) a aktivující transkripční faktor 6 (activating transcription factor 6 – ATF6) [9]. Pokud se ER nachází v homeostatickém stavu (nedochází k hromadění nesprávně poskládaných proteinů v lumen ER), jsou transmembránové proteiny inaktivní díky interakci s chaperonem označovaným jako protein vázající imunoglobulin (binding Ig protein – BiP). BiP selektivně váže aminokyselinové zbytky typické pro nesbalené nebo chybně sbalené proteiny. Pokud je kapacita ER dostatečná, nesbalené proteiny se nevytvářejí ve zvýšeném množství, BiP vytváří komplex s IRE1a, PERK a ATF6 a inaktivuje je. Naopak, v případě akumulace nesbalených proteinů se BiP z komplexu s transmembránovými proteiny uvolňuje a umožnuje tak jejich aktivaci (obr. 2) [10].

IRE1a je transmembránový protein v membráně ER. V inaktivní formě se vyskytuje ve formě monomeru. K jeho aktivaci dochází navázáním nesprávně poskládaného proteinu na jeho lumenální doménu a oligomerizací. Je-li ER v homeostatickém stavu, je na lumenální doménu vázán chaperon BiP, např. GRP78 nebo HSPA5. Jeho funkcí je s využitím ATP podporovat skládání proteinů nebo bránit jejich agregaci. Při nahromadění abnormálně poskládaných proteinů nebo přetížení kapacity ER se BiP uvolní z vazby s IRE1a. Po uvolnění BiP dochází k oligomerizaci IRE1a a tím také k jeho aktivaci [10,11]. Aktivovaná forma IRE1a má RNázovou aktivitu, která umožňuje alternativní sestřih transkriptu X-box vázajícího proteinu 1 (X-box binding protein 1 – XBP1), čímž vzniká variantní transkripční faktor XBP1s, který selektivně podporuje transkripci genů podílejících se na biogenezi ER a skládání a sekreci proteinů [8]. Aktivovaná forma IRE1a také dokáže štěpit a tím degradovat některé mRNA, které tak nemohou být překládány do polypeptidového řetězce a nevstupují do cisteren ER. Tato schopnost IRE1a se nazývá regulovaný rozklad závislý na IRE1a (regulated IRE1a-dependent decay – RIDD) [12].

Transmembránový protein PERK je ve své inaktivní formě (stejně jako IRE1a) monomer. Také způsob jeho aktivace je stejný jako u IRE1a, regulovaný prostřednictvím vazby BiP [9]. V aktivované formě má schopnost fosforylovat translační iniciační faktor eIF2a, a tlumit tak translaci velkého množství mRNA. Zároveň ale umožňuje translaci specifických mRNA, označovaných jako „integrated stress response“ (ISR) mRNAs, kódujících např. transkripční faktor ATF4 nebo protein QRICH1 s dosud ne zcela zřejmou funkcí. ATF4 reguluje expresi dalších chaperonů, QRICH1 je zřejmě zapojený do regulace programované buněčné smrti [9,13].

ATF6 je třetí z transmembránových proteinů. Způsob jeho aktivace je odlišný než ve dvou předchozích případech. Po disociaci BiP je proteolyticky aktivován S1P a S2P proteázami v Golgiho aparátu. Jeho aktivovaná forma translokuje do jádra, kde společně s XBP1s indukuje expresi genů, jejichž regulační oblasti obsahují specifické sekvence označované jako „ER stress specific elements“ (ERSE) [9,10].

Souhrnně lze tedy říct, že ať už je UPR aktivována jakoukoliv ze zmíněných cest, vede ve výsledku ke zvýšení schopnosti ER skládat proteiny a obnovit homeostázu. V takovém případě se jedná o tzv. homeostatické UPR. Když se však homeostázu obnovit nedaří a ER je vystaveno trvalému stresu, přechází homeostatické UPR v UPR terminální, kdy aktivace transmembránových proteinů vede k destrukci buňky. Děje se tak např. prostřednictvím proteinů ze skupiny BCL-2, které ovlivňují integritu mitochondriální membrány a mohou mít jak antiapoptotický, tak i proapoptotický účinek [14]. Hyperaktivace transmembránového proteinu PERK pak může pomocí zvýšené exprese transkripčního faktoru CHOP/GADD153 inhibovat expresi antiapoptotických a naopak iniciovat expresi proapoptotických BCL-2, což vede k buněčné smrti [15]. Dalším z mechanizmů terminální UPR je zvýšená exprese či aktivace prozánětlivých a proapoptotických proteinů iniciovaná hyperaktivovaným oligomerizovaným IRE1a. Ten pak pomocí své RNázové aktivity může degradovat specifické mikroRNA, které by se podílely na represi proapoptotických faktorů, jako je např. protein TXNIP. To vede k nárůstu koncentrace těchto proteinů, které pak pomocí aktivace dalších prozánětlivých a proapoptotických faktorů způsobí apoptózu buňky [16].

UPR v patogenezi nádorových onemocnění

U nádorových buněk může být stav ER stresu vyvolán různými vnitřními i vnějšími příčinami [10]. Mezi ty vnitřní patří aktivace onkogenů nebo ztráta tumor supresorových genů, přetížení proteosyntézy a chyby ve skládání proteinů či oxidativní stres. Navíc samotné nádorové mikroprostředí může vyvolat ER stres v důsledku hypoxie, nedostatku živin, působení prozánětlivých signálních molekul nebo cytotoxického působení protinádorové terapie [17–19]. V odpovědi na tento stav dochází s různou intenzitou k aktivaci různých větví UPR, jak bylo prokázáno u různých typů hematologických malignit, jako je MM, leukemie a lymfomy [20–22], i u solidních nádorů, např. nádoru prsu, tlustého střeva, ledvin, jater, plic či slinivky břišní [23–28].

UPR tedy integruje působení řady faktorů a její pronádorový či protinádorový příspěvek k patogenezi tumoru závisí na konkrétním buněčném a molekulárním kontextu, příp. genotypu pacienta. Existují studie poukazující na jeho protinádorové působení [29]. Více je však těch, které dokládají, že aktivace UPR ovlivňuje různé buněčné procesy ve prospěch nádorových buněk, jak bude uvedeno dále.

Jedním ze způsobů pronádorového působení UPR je jeho vliv na angiogenezi. UPR podporuje angiogenezi u solidních nádorů, což jim umožňuje přežít v prostředí, kde jsou vystaveny nedostatku živin a kyslíku. Děje se tak prostřednictvím proangiogenního růstového faktoru VEGF-A, jehož exprese je indukována pomocí ATF4 [10,30].

Důležitou cestou pronádorového působení UPR je také jeho propojení s autofagií – buněčným procesem zodpovědným za degradaci proteinů a organel [31]. Autofagie dokáže zmírnit akumulaci reaktivních forem kyslíku a zabránit tak poškození DNA, čímž může bránit vzniku nádoru. Na druhou stranu však mohou buňky díky autofagii získávat energii a recyklovat organelové komponenty, což může u nádorových buněk vystavených hypoxii a nedostatku živin zajistit přísun potřebné energie a tím přežití [32]. Bylo prokázáno, že složky všech tří aktivačních cest UPR mohou indukovat aktivaci autofagie [10,31].

UPR má dále vliv na schopnost nádorových buněk migrovat a tvořit metastáze. Např. aktivace transmembránového proteinu PERK může vést k expresi proteinu LAMP3, který je asociován s tvorbou metastáz [33].

Nádorové buňky mohou také využít aktivace UPR k pozměnění metabolických drah, což jim zajistí přežití v případě, že se nachází v prostředí s nedostatkem živin. Např. XBP1s i ATF4 indukují produkci enzymu GFAT1, který je prvním enzymem hexosaminové biosyntetické dráhy. Ta produkuje UDP-N-acetylglukosamin, důležitý substrát v glykosylaci proteinů a lipidů [34,35].

Dalším ze způsobů, jak může UPR modulovat progresi nádoru je vliv na odpověď na chemoterapeutika [36]. Zvýšená exprese UPR transmembránových proteinů a dalších komponent UPR koreluje u nádoru prsu s rezistencí nádorových buněk k tamoxifenu [37]. Dále byla pozorována spojitost mezi zvýšenou hladinou BiP a rezistencí k léčivům indukujícím apoptózu, jako je doxorubicin. BiP dokáže např. inhibovat aktivaci kaspázy 7, čímž zabrání apoptóze buňky [38,39]. Aktivovaný transmembránový protein PERK fosforyluje nukleární transkripční faktor Nrf2, který indukuje expresi efluxního transportéru MRP1, vylučujícího cytotoxické léčivo z buňky. Buňky, u nichž byla pozorována zvýšená exprese PERK, vykazovaly rezistenci k léčivům oxaliplatina, 5-fluorouracil a doxorubicin [40]. Jiná studie popisuje vliv ATF6 a proteinu PDIA5, podílejícího se na jeho aktivaci, na rezistenci leukemických buněk vůči léčivu imatinib. Inhibice PDIA5/ATF6 vedla u zkoumaných buněk k obnovení citlivosti k léčivům [41].

Vzhledem ke všem výše uvedeným zjištěním je UPR předmětem dalšího výzkumu jako potenciální cíl specifických cytostatických léčiv [42]. Zkoumány jsou tak např. inhibitory IRE1a a jeho RNázové aktivity či inhibitory transmembránového proteinu PERK [43]. Inhibitor RNázové aktivity IRE1a – STF-083010 – vykazoval schopnost cytotoxického působení na buňky MM [44]. A-I06, produkt hydrolýzy STF-083010, taktéž inhibuje RNázovou aktivitu IRE1a, což vede ke snížené expresi XBP1 a indukci apoptózy nádorových buněk u chronické lymfocytární leukemie [45]. Na myších modelech triple negativního nádoru prsu byly pozorovány účinky MKC8866, dalšího z inhibitorů RNázové aktivity IRE1a, jehož vlivem došlo k potlačení růstu nádoru [46]. Inhibitor transmembránového proteinu PERK – GSK2606414 – inhiboval u myší růst xenograftu lidského nádoru [47].

UPR u mnohočetného myelomu

MM tvoří cca 1 % ze všech nádorových onemocnění. Je charakterizovaný klonální proliferací maligních plazmatických buněk (PB) v kostní dřeni, která vede k nadprodukci monoklonálních imunoglobulinů; typickými projevy onemocnění jsou osteolytická ložiska, selhání ledvin, anemie a hyperkalcemie. V ČR je medián věku pacientů při diagnóze 68 let u mužů a 70 let u žen [1,48].

Signální dráhy asociované s ER jsou klíčové pro diferenciaci, mezibuněčné interakce i fyziologickou funkci plazmatických buněk. Bylo prokázáno, že ke správnému vývoji B lymfocytů a jejich diferenciaci v plazmatické buňky je potřeba transmembránový protein IRE1a a XBP1 protein [49]. Jiná studie poukázala na dysregulaci XBP1s u pacientů s MM. Byla porovnána hladina XBP1s v normálních PB a PB pacientů s MM. Zatímco u normálních PB byla hladina XBP1s velmi nízká nebo nedetekovatelná, u myelomových PB byla výrazně zvýšená, a to až v 70 % zkoumaných vzorků [50].

V současné době jsou k léčbě MM využívány inhibitory proteazomu. Tyto látky působí inhibici antiapoptotického transkripčního faktoru NF-kB a mimoto brání proteazomu degradovat nesprávně poskládané proteiny, v důsledku čehož se proteiny hromadí, dochází ke vzniku stresu ER, aktivaci terminální UPR a indukci apoptózy myelomových buněk [51,52]. Kromě toho, že působí proti nádorovým buňkám, dokáží inhibitory proteazomu redukovat resorpci a zvýšit novotvorbu kostní tkáně u pacientů s MM. Hlavní roli v tomto mechanizmu má XBP1s, které vzniká jako produkt aktivace IRE1a v odpovědi na stres ER způsobený inhibitory proteazomu. XBP1s reguluje diferenciaci osteoblastů a podporuje osteogenezi [53].

Zavedení zmíněných léčiv přineslo významné zlepšení v léčbě pacientů s MM, přesto může dojít k relapsu onemocnění spojenému s rezistencí k inhibitorům proteazomu [54,55]. Proto se testují látky, jejichž použití by mohlo účinek stávajících léčiv podpořit. Zkoumány jsou např. GGSI inhibitory geranylgeranyl difosfát syntázy (GGDPS). GGDPS se podílí na regulaci transportu proteinů. Je-li tento mechanizmus pomocí GGSI narušen, dochází k hromadění proteinů uvnitř buňky, indukci stresu ER, aktivaci UPR a apoptóze. V kombinaci s inhibitory proteazomu (bortezomib, karfilzomib) dochází ke zpomalení růstu nádoru [56]. Další studie se zaměřuje na inhibitory histonové deacetylázy. Jedním z nich je selektivní inhibitor TMP269. Ten v kombinaci s karfilzomibem indukoval expresi proapoptotického faktoru CHOP a také expresi ATF4, která vedla ke stresu ER a apoptóze. Tento účinek byl pozorován pouze při využití obou léčiv, TMP269 ani karfilzomib samostatně tuto schopnost neměly [57]. Při léčbě proteazomovým inhibitorem bortezomibem dochází k indukci stresu ER u myelomových buněk. Buňky však mohou využít autofagii, jako alternativní způsob vypořádání se s akumulovanými proteiny. Antibiotikum bafilomycin A1 působí jako inhibitor autofagie a v kombinaci s bortezomibem tak zvyšuje jeho účinnost [58]. Jiný inhibitor histonové deacetylázy, SAHA, zabraňuje degradaci nesprávně poskládaných proteinů, které jsou ve formě agregátů za pomoci histonové deacetylázy degradovány. To vede k jejich hromadění v buňce a SAHA v kombinaci s bortezomibem a klaritromycinem (makrolidovým antibiotikem zabraňujícím autofagii) tak indukuje stres ER a apoptózu [59]. Další studie se zaměřuje na P13K/Akt cestu, která má důležitou roli v patogenezi MM a podporuje růst nádoru. Inhibice Akt pomocí selektivního inhibitoru TAS-117 vede k aktivaci PERK a IRE1a, indukci UPR a apoptóze. V kombinaci s inhibitory proteazomu, bortezomibem a karfilzomibem, zvyšuje jejich toxicitu vůči myelomovým buňkám [60]. Další studovanou látkou je verapamil, který blokuje vápníkové kanály a brání přísunu kalciových iontů do buňky. Indukuje tak produkci reaktivních forem kyslíku, autofagii a přispívá k tvorbě proapoptotických stresových signálů a aktivaci terminální UPR u buněk vystavených bortezomibu [61]. Dále bylo zjištěno, že v důsledku stresu ER způsobeného bortezomibem dochází ke zvýšení exprese DR5 receptoru, a naopak snížení exprese HLA-E na povrchu myelomových buněk. Snížená exprese HLA-E vede k senzitizaci těchto buněk k degradaci NK buňkami, které mají receptor NKG2A. Infuze takovýchto NK buněk, následující po léčbě bortezomibem, by mohla zajistit degradaci i těch buněk, které unikly běžnému mechanizmu působení bortezomibu, což by mohlo vést ke zlepšení účinnosti léčby [55]. Dalším ze způsobů, jak podpořit účinek inhibitorů proteazomu je prostřednictvím mutací genů KRAS, NRAS a BRAF, které se často vyskytují u pacientů s MM a podílejí se na rezistenci myelomových buněk k léčivům. Tyto mutace aktivují dráhu mitogenem aktivované protein kinázy (MAPK) a podporují expresi proteazomových podjednotek a chaperonů podílejících se na proteazomové aktivitě, čímž aktivitu proteazomu podporují. Dále mají vliv na aktivaci UPR, kterou snižují. Využití inhibitorů MAPK kinázy (MEK) vedlo k snížení proteazomové aktivity a senzitizaci myelomových buněk k inhibitorům proteazomu [62]. Podobně Besse et al. popsali masivní změny v metabolizmu buněk MM rezistentních k inhibitorům proteazomu, a identifikovali klíčové molekulární dráhy vč. UPR jako potenciální terapeutické cíle [63]. ER a jeho molekulární signalizace může představovat vhodný cíl i pro terapii komplikací MM, jako je např. AL amyloidóza, pro kterou je typická produkce abnormálních lehkých řetězců, které agregují do amyloidových fibril a deponují v různých orgánech. Cytostatikum melflufen (melphalanflufenamid) je kandidátním léčivem právě pro AL amyloidózu asociovanou s MM. Flanagan et al. identifikovali buněčný cíl pro melflufen, kterým je právě ER a ATF-4 dependentní větev UPR [64].

Závěr

Léčiva cílená na endoplazmatické retikulum plazmatických buněk a s ním související signální dráhy mohou přispět k léčbě pokročilého MM a k pochopení jeho etiopatogeneze a rozvoje chemorezistence.

Podporující agentury

Publikace vznikla díky podpoře AZV NU21-03-00076 a LF MUNI/A/1370/2022.