Klinické příznaky a laboratorní data u 75 dětí s neonatální manifestací mitochondriálního onemocnění: návrh diagnostických algoritmů

Souhrn

Mitochondriální poruchy se mohou projevit v kterémkoliv věku, ale vysoké energetické nároky na poporodní adaptaci novorozence predisponují k časné neonatální manifestaci. Cílem práce je snaha analyzovat klinické a laboratorní projevy mitochondriálních onemocnění v novorozeneckém věku. Navržené algoritmy pomohou usnadnit jejich diagnostiku.

Soubor:
Mitochondriální porucha se klinicky manifestovala u 75 dětí v novorozeneckém věku, což představuje 21 % pacientů s mitochondriálním onemocněním, které jsme diagnostikovali na biochemické a/nebo molekulárně genetické úrovni na našem pracovišti.

Výsledky:
Předčasně se narodilo 36 % dětí, intrauterinní růstová retardace byla přítomna u 40 % a časná postnatální hypotonie u 95 % dětí. Dechovou podporu potřebovalo 66 % novorozenců, u ostatních převládalo odmítání pití a letargie. Hypertrofická kardiomyopatie byla zjištěna u 50 %, novorozenecké křeče u 24 % a Leighův syndrom u 11 % novorozenců. Prognóza nebyla příznivá, třetina dětí zemřela v prvních měsících života. Laktátová acidóza byla dokumentována u 93 %, zvýšená hladina kreatinkinázy u 28 % a zvýšené vylučování metabolitů Krebsova cyklu u 75 % novorozenců. Hyperamonémie byla potvrzena u 22 % dětí. Všichni novorozenci s poruchou proteinu Tmem70 měli v moči zvýšené vylučování kyseliny 3-methylglutakonové.

Závěr:
Mitochondriální onemocnění se často manifestují v novorozeneckém věku. Byl připraven diagnostický algoritmus pro kriticky nemocného novorozence s podezřením na mitochondriální onemocnění umožňující indikovat přímou enzymatickou nebo mutační analýzu, v některých případech dokonce bez nutnosti provedení svalové biopsie.

Klíčová slova:
mitochondriální onemocnění, neonatální manifestace, laktátová acidóza, hypertrofická kardiomyopatie, diagnostický algoritmus

Úvod

Se zlepšující se úrovní neonatální medicíny doprovázené poklesem novorozenecké mortality stoupá u nemocných novorozenců podíl geneticky podmíněných onemocnění včetně mitochondriálních poruch energetického metabolismu. Adekvátní biogeneze mitochondriálních funkcí ve fetálním období a rychlá přeměna fetální glykolýzy jako hlavního zdroje energie plodu na oxidativní fosforylaci u novorozence je zásadní pro dobrou poporodní adaptaci [1, 2]. Více než 90 % energetických potřeb dítěte je zajišťováno systémem oxidativní fosforylace (OXPHOS), který funkčně propojuje komplexy dýchacího řetězce (komplexy I–IV) a F₁F_O-ATP-syntázu (ATP-syntáza, ATPáza, komplex V). OXPHOS je jako jediná výjimka v biologii člověka řízen geny v jaderné DNA (nDNA) a mitochondriální DNA (mtDNA).

Mitochondriální onemocnění představují klinicky, biochemicky i geneticky heterogenní skupinu onemocnění s mendelovským i maternálním typem dědičnosti. Charakterizováno již bylo >110 různých mitochondriálních poruch (OMIM; www.ncbi.nlm.nih.gov/omim). Jejich výskyt v populaci je cca 1 : 4000 [3–5], dosud bylo popsáno >250 různých mutací, delecí a duplikací v mtDNA [6] a mutací ve >80 genech v nDNA [7].

První klinické příznaky mitochondriálních onemocnění se mohou projevit v kterémkoliv věku, nejčastěji jsou postiženy tkáně s vysokými energetickými nároky, jako je mozek, sval, srdce a játra [8]. Mitochondriální etiologii onemocnění lze prokázat u 5 % všech případů hluchoty [9], 2–3 % pacientů s diabetes mellitus typ II, 2–3 % pacientů se získanou slepotou nebo u 1 % pacientů s klinickou příhodou, kterou lze označit termínem „mozková mrtvice“.

Na našem pracovišti jsme v průběhu posledních 18 let potvrdili mitochondriální etiologii onemocnění na biochemické a/nebo molekulární úrovni u více než 350 pacientů. U 75 z nich se onemocnění manifestovalo v novorozeneckém věku. Cílem naší práce je snaha charakterizovat klinické a laboratorní projevy mitochondriálních onemocnění v novorozeneckém věku a navrhnout diagnostické algoritmy umožňující jejich diagnostiku.

Materiál a metody

Soubor tvoří 75 dětí s mitochondriálním onemocněním potvrzeným na biochemické a/nebo molekulárně genetické úrovni, u kterých se první klinické příznaky onemocnění manifestovaly již v novorozeneckém věku. Retrospektivně jsme analyzovali frekvenci klinických příznaků onemocnění a výsledky selektivního screeningu dědičných poruch metabolismu i základních biochemických a cílených enzymatických a molekulárních vyšetření.

Profil organických kyselin v moči byl analyzován pomocí plynové chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií. Svalové mitochondrie získané při biopsii nebo autopsii byly izolovány podle Makinena a Lee bez použití proteázy [10] a uchovány v tekutém dusíku. Aktivity enzymů dýchacího řetězce, NADH-koenzym Q₁₀-oxidoreduktázy (NQR, komplex I), sukcinyl-koenzym Q₁₀-oxidoreduktázy (SQR, komplex II), koenzym Q₁₀-cytochrom c oxidoreduktázy (QCCR, komplex III), cytochrome c oxidázy (COX, komplex IV), dihydrolipoamiddehydrogenázy a citrát syntázy (CS) byly měřeny spektrofotometricky [11, 12]. Aktivita a množství pyruvátdehydrogenázy (PDH) byla měřena radiometricky [13] a Western blotem. Genová DNA byla izolována ze svalu a/nebo krve metodou fenolové extrakce. Přítomnost prevalentních mutací byla analyzována pomocí PCR-RFLP, mitochondriální DNA a vybrané nukleární geny byly studovány metodou přímé sekvenace na analyzátoru ABI 3100 Avant (Applied Biosystems).

Výsledky

První klinické příznaky onemocnění se manifestovaly již v novorozeneckém věku u 75 dětí. V souboru byl vysoký podíl nedonošenosti (36 % dětí) i intrauterinní růstové retardace (40 %). Poporodní adaptace byla nejčastěji komplikována těžkou hypotonií (u 95 % novorozenců), která si u 66 % dětí vyžádala zahájení některé z forem dechové podpory nebo byla doprovázena odmítáním pití a letargií. U pěti dětí byl klinicky diagnostikován ”SMA-like” fenotyp (příznaky podobné spinální svalové atrofii), ale následující molekulární diagnostika SMN1 genu byla negativní. Pouze u 4 novorozenců byla pozorována hypertonie. Hypertrofická kardiomyopatie byla nalezena u 50 % novorozenců, novorozenecké křeče se vyskytly u 24 % dětí. Vyšetření MRI CNS ukázalo u 11 % dětí časný rozvoj Leighova syndromu (oboustranné nekrotické změny v bazálních gangliích a mozkovém kmeni). Prognóza pacientů nebyla příznivá, třetina pacientů zemřela již v prvních třech měsících života. Frekvence jednotlivých příznaků v závislosti na konkrétní mitochondriální diagnóze je uvedena v tabulce 1.

Významná laktátová acidóza byla přítomna u 93 % novorozenců již bezprostředně po narození (tab. 2). Hyperamonémie byla dokumentována u 22 % novorozenců, většinou u dětí s deficitem proteinu Tmem70, u několika dětí s izolovaným deficitem komplexu IV dýchacího řetězce a u jednoho dítěte se syndromem NARP (neurogenní svalová slabost, ataxie, retinitis pigmentosa). Zvýšená hladina kreatinkinázy byla nalezena u 28 % novorozenců. Selektivní metabolický screening ukázal u 62 % dětí zvýšenou koncentraci alaninu v krvi a u 75 % zvýšené vylučování intermediálních metabolitů Krebsova cyklu (malát, fumarát, citrát, sukcinát, akonitát, 2-oxoglutarát) (tab. 2). Všichni novorozenci s poruchou proteinu Tmem70 měli zvýšené vylučování kyseliny 3-methylglutakonové.

Mitochondriální etiologie onemocnění byla potvrzena u všech 75 dětí. U 5 dětí byla nalezena porucha komplexu I dýchacího řetězce, u 40 dětí porucha komplexu IV dýchacího řetězce, u 26 dětí porucha ATP-syntázy, u dvou dětí porucha pyruvátdehydrogenázy (PDH) a u 2 dětí kombinovaný deficit více komplexů. Mutační analýzy u dětí s deficitem ATP-syntázy ukázaly u 18 dětí přítomnost mutací v genu TMEM70, u 7 dětí mtDNA mutaci 8993T>G svědčící pro syndrom NARP a u jednoho dítěte byl potvrzen Barthův syndrom. Ve skupině dětí s poruchou komplexu IV jsme u 5 pacientů nalezli poruchu na úrovni proteinu Sco2 (4x) nebo Sco1 (1x), které se podílejí se na biogenezi komplexu IV. Ve skupině dětí s kombinovaným deficitem byl u dvou dětí prokázán Pearsonův syndrom a Alpersův syndrom. Mutace v genu DLD pro E3 podjednotku PDH komplexu byla nalezena u dvou dětí.

Na základě zkušeností s diagnostikou mitochondriálních onemocnění jsme připravili diagnostické algoritmy pro rozvahu nad kriticky nemocným novorozencem s podezřením na dědičnou poruchu metabolismu (schéma 1) a diagnostický algoritmus u novorozence s podezřením na mitochondriální onemocnění (schéma 2).

Diskuse

Vysoké energetické nároky na poporodní adaptaci a následný růst a vývoj predisponují novorozence s těžkou poruchou mitochondriálního energetického metabolismu k časné manifestaci klinických projevů. Mezi první klinické příznaky poruch OXPHOS v novorozeneckém věku patří svalová hypotonie, dechové obtíže, letargie, odmítání pití, zvracení, nedostatečné váhové přírůstky, poruchy vědomí i novorozenecké křeče [14]. Nedostatečná produkce ATP ve fetálním období se může projevit nejen intrauterinní růstovou retardací, ale i vývojovými vadami, jak například dokumentovala studie autorů von Kleist-Retzow et al. [15].

Na rozdíl od starších dětí a dospělých pacientů, u kterých se mitochondriální onemocnění projevuje často tkáňově specifickými příznaky, mezi které patří progredující myopatie, ptóza, zevní oftalmoplegie či Leighův syndrom, jsou klinické příznaky onemocnění u novorozence nespecifické, což významně komplikuje diagnostiku. Navíc rychlý a ve vysokém procentu i fatální průběh onemocnění prakticky neumožňuje rozsáhlé diagnostické kroky. Postižené rodiny tak zůstávají bez možnosti genetického poradenství a prenatální diagnostiky.

Mitochondriální onemocnění se může manifestovat v kterémkoliv věku. V našem souboru více než 350 pacientů, u kterých jsme na biochemické a/nebo molekulárně genetické úrovni prokázali poruchu mitochondriálního energetického metabolismu, se mitochondriální onemocnění manifestovalo v novorozeneckém věku u 21 % pacientů. Je to v souladu s dalšími studiemi, které uvádějí „neonatal onset“ u 15–29 % pacientů s mitochondriálním onemocněním [16–18].

U většiny našich novorozenců s mitochondriálním onemocněním byla přítomna významná svalová hypotonie, poruchy dýchání, odmítání pití a letargie. Oběhová nestabilita a tachykardie vedly k indikaci echokardiografického vyšetření, které ukázalo již v prvních hodinách života hypertrofickou kardiomyopatii u 50 % dětí. Prematurita a/nebo intrauterinní růstová retardace byly přítomny u více než jedné třetiny našich pacientů. Křeče v novorozeneckém věku se vyskytly u 24 % dětí z našeho souboru. Z biochemických vyšetření byla laktátová acidóza nalezena u 93 % novorozenců, zvýšená hladina kreatinkinázy u 28 % a hyperamonémie u 22 %.

Diferenciální diagnostika mitochondriálních onemocnění v novorozeneckém věku

Mezi specifické poruchy mitochondriálního energetického metabolismu s neonatální manifestací patří:

A)

Porucha funkce pyruvátdehydrogenázového komplexu (PDHC) s autozomálně a gonozomálně recesivním typem dědičnosti, která patří mezi nejčastější příčiny primární laktátové acidózy u kojenců a malých dětí [19–21]. Klinicky se tato enzymatická porucha manifestuje nejčastěji již u novorozence [22] a laktátová acidóza se objevuje většinou v průběhu prvních hodin života často doprovázena významnou svalovou hypotonií, letargií, odmítáním kojení, dechovými obtížemi až po poruchu vědomí s kómatem.

B)

Poruchy komplexu I dýchacího řetězce, které v celkovém souhrnu všech mitochondriálních onemocnění patří mezi nejčastější [23–25]. Podle klinických příznaků a věku manifestace rozlišujeme tři skupiny poruch: fatální neonatální typ, myopatický typ s projevy intolerance fyzické zátěže a svalové slabosti a typ encefalomyopatický s příznaky mozečkové dysfunkce, oftalmoplegie, křečí a demence. Fatální neonatální typ se projeví multiorgánovým postižením již v průběhu prvních dnů života s příznaky svalové hypotonie, odmítání pití, apatie, nakupení apnoických pauz, hepatomegalie při srdečním selhání v rámci přítomné hypertrofické kardiomyopatie [17, 26–29].

C)

Poruchy komplexu dýchacího řetězce IV (COX; cytochrom c oxidáza) s mutacemi v genu SCO1, SCO2, COX10 a COX15. Mutace v genu SCO1 vedoucí k izolovanému deficitu komplexu IV byla nalezena u chlapce s rozvojem brzkého jaterního selhání, kritické laktátové acidózy a encefalopatie s exitem ve věku 2 měsíců [30] a u dívky s neonatální manifestací a projevy hypertrofické kardiomyopatie, encefalopatie, hypotonie a hepatopatie, popsané naší skupinou [31]. Mutace v genu SCO2 je častější příčinou fatální infantilní kardioencefalomyopatie než poruchy Sco1 proteinu [32–35]. Mutace v genu COX10 byla prokázána u dvou novorozenců s časným rozvojem anémie, hypotonie a laktátové acidózy. U jednoho chlapce se již v průběhu prvního měsíce života rozvinul na MRI CNS obraz Leighova syndromu, u druhého pacienta porucha sluchu a hypertrofická kardiomyopatie [36]. Antonicka et al. prokázali, že i mutace v genu COX15 [37] může být spolu s mutacemi v genu SCO2 příčinou rozvoje neonatální kardiomyopatie s izolovaným deficitem komplexu IV dýchacího řetězce.

D)

Porucha ATP-syntázy s maternálním typem dědičnosti je způsobena převážně mutacemi v genu MTATP6 pro podjednotku 6 ATP-syntázy [38] a vzácně v genu MTATP8 pro podjednotku 8 ATP-syntázy [39], které jsou kódované mitochondriální DNA. Podle hladiny heteroplazmie se onemocnění projeví buď jako syndrom NARP, nebo jako Leighův syndrom. I když se syndrom NARP převážně manifestuje v kojeneckém věku, časná neonatální prezentace (neprospívání, hypotonie, hypertrofická kardiomyopatie a encefalopatie) onemocnění byla již popsána [17, 40]. Nově byla neonatální manifestace prokázána i u dvou sourozenců s poruchou na úrovni asemblačního genu ATP12 [41].

E)

Onemocnění s kombinovanou poruchou OXPHOS. Izolované velké delece mitochondriální DNA jsou asociovány se syndromem Kearns-Sayre (KSS), chronickou progresivní oftalmoplegií (CPO) a Pearsonovým syndromem [42–44]. Pearsonův syndrom se projevuje refrakterní sideroblastickou anémií, laktátovou acidózou a insuficiencí zevně sekretorické funkce pankreatu s časnou manifestací v kojeneckém věku a ojediněle již u novorozenců [45].

Ze syndromů spojených s deplecí mtDNA byla neonatální manifestace popsána u pacientů s mutacemi v podjednotce A mitochondriální polymerázy γγPOLG1 (Alpersův syndrom) a deoxyguanosinekináza DGUOK [46]. Deficit mitochondriálního proteinu tafazzinu s gonozomálně recesivním typem dědičnosti a s mutacemi v genu TAZ při Barthově syndromu se typicky manifestuje již záhy po porodu rozvinutou dilatační nebo hypertrofickou kardiomyopatií, kritickou laktátovou acidózou a hyperamonémií [47–49].

Mezi vzácná onemocnění s neonatální manifestací (encefalomyopatie, hypertrofická kardiomyopatie, hepatocerebrální forma) dále patří defekt na úrovni mitochondriálního membránového transportního proteinu pro fosfáty (PiC; gen SLC25A3) [50], porucha syntézy koenzymu Q10 (ubiquinone) [51, 52] a mutace v genech kódovaných nukleární DNA, které se účastní translace mtDNA [53–57].

Mitochondriální onemocnění s neonatální manifestací u dětí diagnostikovaných v České republice

Naše nálezy jsou v souladu s výše uvedeným literárním přehledem. Neonatální manifestace byla prokázána u pacientů s diagnózou syndromů Alpers, Barth, NARP, Pearson, s deficitem proteinu Sco1, Sco2 a s deficitem pyruvátdehydrogenázy a komplexu I dýchacího řetězce. U 35 dětí byl zjištěn deficit komplexu IV dýchacího řetězce, zatím bez stanovení diagnózy na molekulárně genetické úrovni (vyloučen byl na základě zjištění deficit proteinu Sco1 a Sco2).

Deficit ATP-syntázy způsobený mutací v genu TMEM70, prokázaný u 18 dětí s neonatální encefalokardiomyopatií a popsaný poprvé naší skupinou [58, 59], rozšířil skupinu mitochondriálních onemocnění s neonatální manifestací.

Návrh diagnostických algoritmů

Zlatým standardem v diagnostice poruch mitochondriálního energetického metabolismu s nástupem v kterémkoliv věku je svalová biopsie. Rychlý a fatální neonatální průběh mitochondriálních onemocnění většinou neumožňuje provést svalovou biopsii. Pokud není k dispozici ani autoptický materiál, ve většině případů není diagnostika mitochondriálního onemocnění možná [60].

Pokusili jsme se proto sestavit základní algoritmy, které by mohly zjednodušit diagnostický proces a umožnit tak na základě klinických příznaků a výsledků biochemických a metabolických vyšetření indikovat přímou enzymatickou a/nebo mutační analýzu, v některých případech dokonce i bez nutnosti provedení svalové biopsie. Příkladem může být nález hypertrofické kardiomyopatie, svalové hypotonie, těžké metabolické laktátové acidózy, hyperamonémie a 3-methylglutakonové acidurie u kriticky nemocného novorozence s indikací přímé mutační analýzy genu TAZ (Barthův syndrom) a TMEM70. Je-li přítomna u chlapců hypospadie, preferujeme vyšetření genu TMEM70. U pacientů romského etnika jako první indikujeme mutační analýzu prevalentní mutace (c.317-2A>G) v genu TMEM70. Při stejné klinické symptomatologii, ale bez nálezu 3-methylglutakonové acidurie indikujeme genetické vyšetření prevalentní mutace v mtDNA pro syndrom NARP (8993T>G,C; gen MTATP6). Tuto mutační analýzu bychom provedli i v případě nálezu časně rozvinutého obrazu Leighova syndromu. Bude-li přítomna kardiomyopatie a laktátová acidóza u kriticky nemocného novorozence, avšak bez hyperamonémie a 3-methylglutakonové acidurie, budeme na prvním místě indikovat sekvenaci genů SCO2 a SCO1. Zhoršená tolerance glukózy s akcentací laktátové acidózy spolu se zvýšenou hladinou rozvětvených aminokyselin v krvi u kriticky nemocného dítěte s hypotonií a dechovými obtížemi vede k podezření na poruchu na úrovni PDHC. Makrocytární anémie s laktátovou acidózou na druhou stranu vede k podezření na Pearsonův syndrom.

Závěr

Mitochondriální onemocnění se často manifestují v novorozeneckém věku. Byl připraven diagnostický algoritmus pro kriticky nemocného novorozence s podezřením na mitochondriální onemocnění umožňující indikovat přímou enzymatickou nebo mutační analýzu, v některých případech dokonce bez nutnosti provedení svalové biopsie. Ale u nejasných případů pouze odběr jaterní a svalové tkáně bezprostředně po úmrtí dítěte umožní odhalit případnou etiologii mitochondriálního onemocnění (bližší informace o postupu odběru tkání jsou uvedeny na webových stránkách naší laboratoře – http://mitolab.lf1.cuni.cz).

Podpořeno projekty IGA NS 9782-4/2008 a IGA NS 9759-4/2008.

Prof. MUDr. Jiří Zeman, DrSc.
Klinika dětského a dorostového lékařství
UK 1. LF a VFN
Ke Karlovu 2
128 08 Praha 2
e-mail: jzem@lf1.cuni.cz