Sekvenování genů 16S, 18S a ITS regionů: Rozšířené možnosti v diagnostice a výzkumu patologie

16S, 18S gene, and ITS region Sequencing: Expanded Applications in Pathology Diagnostics and Research

Gene sequencing of 16S, 18S, and ITS regions is a crucial tool in molecular diagnostics, especially in microbiology, pathology and forensic medicine. These genes contain conserved and variable regions and are widely used for the taxonomic classification of bacteria and eukaryotes. Sequencing of 16S rDNA helps detect bacterial infections, while sequencing of ITS regions and 18S rDNA is used to identify fungal or parasitic infections, especially when traditional methods are ineffective.

This article focuses on the expanded possibilities of these methods, their application in clinical diagnostics and research, their advantages and disadvantages, and discusses potential future developments in the field of next-generation sequencing (NGS) technology.

Keywords:

Next-generation sequencing – Molecular pathology – 16S sequencing – 18S sequencing – ITS region sequencing – Infection diagnostics

Autoři: Veronika Prousková ¹; Iva Dolinová ¹; Kateřina Štillerová ¹; Tomáš Klinger ²; Tomáš Jirásek ²
Působiště autorů: Oddělení molekulární genetiky a diagnostiky, Centrum PATOS, Krajská nemocnice Liberec, a. s 2 Oddělení patologie, Centrum PATOS, Krajská nemocnice Liberec, a. s. ¹
Vyšlo v časopise: Čes.-slov. Patol., 60, 2024, No. 4, p. 176-180
Kategorie: Přehledový článek

Souhrn

Sekvenování genů 16S, 18S a ITS regionů se stalo jedním z nejdůležitějších nástrojů v molekulární diagnostice, zejména v oblasti mikrobiologie, patologie a soudního lékařství. Výše zmíněné geny, obsahující konzervované i variabilní oblasti, jsou hojně využívány pro taxonomické zařazení bakterií a eukaryot. Sekvenování 16S rDNA umožňuje detekci bakteriálních infekcí, zatímco sekvenace ITS regionů a 18S rDNA je využívána při identifikaci mykotických, případně parazitárních infekcí, a to především v případech, kdy tradiční metody selhávají.

Tento článek se zaměřuje na rozšířené možnosti těchto metod, jejich uplatnění v klinické diagnostice a výzkumu, zkoumá výhody a nevýhody, a diskutuje potenciální budoucí vývoj v oblasti technologie sekvenování nové generace (NGS).

Klíčová slova:

sekvenování nové generace – molekulární patologie – Sekvenování 16S – Sekvenování 18S – Sekvenování ITS – Diagnostika infekcí

Technologie sekvenování genů 16S, 18S a ITS regionů přinesly revoluční změnu v molekulární diagnostice, zejména v oblasti mikrobiologie, patologie a soudního lékařství (1).

Přímé sekvenování genu 16S rDNA je schopno prokázat přítomnost bakteriální nukleové kyseliny a na základě získaných dat je možné dourčení mikroorganismu řádově do rodu, v případě dostatečně dlouhé a čisté sekvence až do druhového pojmenování (2). Gen 16S rDNA kóduje část malé podjednotky prokaryotického ribozomu. Mezidruhově se nachází v různém počtu kopií, ale v rámci jednoho konkrétního bakteriálního druhu je počet kopií stejný. Sekvence genu má přibližně 1500 párů bazí, což znamená, že se jedná o úsek dostatečně dlouhý k identifikaci mikroorganismu, ale přitom optimálně krátký, bylo možno provést Sangerovo sekvenování (3–5). Vyšetření se provádí přímo z klinických vzorků různých materiálů, nejčastěji jsou to punktáty, stěry, biopsie nebo kusy infikovaných tkání (1).

Přímé sekvenování genu 18S rDNA a ITS regionů slouží k detekci eukaryotických mikroorganismů. Jedná se především o identifikaci mykotických infekcí, potencionálně také parazitů.

Po sekvenaci je možné zařazení organismu řádově do rodu. Všeobecně je detekce eukaryotických organismů, zejména parazitické DNA, limitována jak z důvodu nízké specificity získaných sekvencí, tak i díky převaze lidské DNA, jejíž zastoupení ve vzorku dominuje (6). Bohužel v tomto případě nelze použít metody k jejímu odstranění, jako tomu může být u diagnostiky bakteriální 16S rDNA. Lidská DNA obsahuje stejný gen 18S rDNA, jaký nacházíme u parazitů nebo hub. Sekvence genu 18S rDNA činí kolem 840 párů bazí (7).

ITS (Internal Transcribed Spacers) regiony se dělí na dva – ITS 1 a ITS 2. Obklopují gen 5.8S a spojují ho s geny 18S (ITS 1) a 26S (ITS 2) (8). Opět se jedná o metodu, kterou dochází k detekování eukaryotické DNA ve vzorku. Délka fragmentu při amplifikaci ITS regionů je variabilní, pohybuje se pod 300 bp/jeden region, v závislosti na použitých primerech a amplifikované oblasti (9). Metoda s použitím ITS regionů má více možností užití od detekce fylogenetických vztahů mezi jednotlivými druhy až po identifikaci vícedruhového zastoupení mikroorganismů ve vzorku (oddělení jednotlivých amplifikovaných fragmentů se poté provádí na agarózovém gelu po gelové elektroforéze), ve výsledku se ale nejedná o primarní metodu pro detekci extrahumánní DNA. Tou stále zůstává sekvenace genů 16S a 18S (10).

Metody sekvenace genů 16S a 18S jsou obzvláště účinné při diagnostice infekcí, které nejsou snadno detekovatelné tradičními metodami, jako je kultivace, mikroskopie nebo PCR (11).

Sekvenování nové generace (NGS) umožňuje analýzu mnoha vzorků naráz s velkou přesnost, což umožňuje rychlou a efektivní detekci infekčních agens, které by jinak zůstaly neodhaleny (11). Aplikace těchto technologií se neustále rozšiřuje, přičemž jejich význam roste nejen v klinické diagnostice, ale také ve výzkumu, epidemiologii a soudním lékařství (4).

Obr. 1. A: Obraz granulomatózně – nekrotizující lamfadenitidy, kde byla následně metodou sevenace 16S identifikována bakterie Francisella tularensis. Barvena hematoxylin eosinem (zvětšení 20x). B: Nukleotidová sekvence Francisella tularensis získaná pomocí Sangerova sekvenování.

ROZŠÍŘENÁ METODOLOGIE SEKVENOVÁNÍ 16S A 18S

Izolace DNA a výzvy při přípravě vzorků

Přesnost sekvenování jednoznačně závisí na kvalitě izolované DNA. Klinické vzorky obsahující malé množství mikrobiální DNA, zejména tělní tekutiny jako jsou krev a mozkomíšní mok, mohou vyžadovat zvláštní kroky zvyšující výtěžek a čistotu DNA. Například v případě izolace vzorku pro následnou sekvenaci genu 16S je možné zvýšit výtěžek získané bakteriální genetické informace užitím kitu pro degradaci lidské DNA (2).

Pro vzorky obsahující vysokou mikrobiální zátěž, jako jsou střevní mikrobiota nebo plicní aspiráty, jsou vhodnejší rutinní metody extrakce s následnou detekci patogena za užití specifické PCR (2).

Nezbytné je zajistit minimální kontaminaci během samotného odběru vzorku a následné manipulaci s ním. Kontaminace je zásadní například ale nejen pro analýzu vzorků odebraných na místě činu v soudním lékařství. Nežádoucí kontaminace může zkreslit výsledky sekvenování a vést k falešně pozitivním nálezům (11).

Sekvenování nové generace (NGS) a jeho pokrok

Technologie NGS (next generation sequencing, masivní paralelní sekvenování), jako je Illumina, Ion Torrent a PacBio, umožňují analýzu tisíců sekvencí během jednoho běhu. Tyto platformy se liší v délce čtení (read lengths) a přesnosti, což umožňuje flexibilní využití pro různé typy vzorků. Dlouhá čtení jsou vhodná pro složitější genomové analýzy, zatímco krátká čtení jsou efektivní pro rychlou detekci známých patogenů (12).

NGS se také uplatňuje při metagenomické analýze vzorků, kde je cílem zjistit kompletní mikrobiální profil vzorku bez potřeby specifické amplifikace genů typických pro jednotlivé patogeny. NGS je obzvláště užitečná pro studium mikrobiomů a při hledání nových nebo dosud neidentifikovaných patogenů (13).

APLIKACE V DIAGNOSTICE A VÝZKUMU

Rozšířená diagnostika bakteriálních infekcí pomocí 16S rDNA Klinické aplikace sekvenování 16S rDNA jsou široké, od rutinní identifikace bakterií, detekce nozokomiálních infekcí nebo diagnostiky u imunokompromitovaných pacientů, po identifikaci bakterií s neobvyklými fenotypovými profily (14). Tato metoda byla využita například při diagnostice infekcí způsobených bakteriemi, které nejsou snadno kultivovatelné (např. Bartonella henselae) nebo snadno identifikovatelné (15). Případně se využívá, pokud může po kultivaci dojít k nesprávné identifikaci mikroorganismu. Konkrétní případ záměny byl zaznamenán v klinické praxi (14), kde došlo opakovaně k nesprávné identifikaci bakterie Francisella tularensis. Nejdříve došlo k záměně za Neisseria meningitidis, poté za Actinobacillus actinomycetemcomitans (obr. 1).

NGS technologie umožňují detekci vzácných patogenů, které nemusí být rutinně zvažovány v klinické praxi. Sekvenování 16S rDNA genu bylo využito například k odhalení atypické bakteriální infekce u pacienta s febrilní neutropenií, kdy standardní kultivační metody nebyly úspěšné (16).

Diagnostika infekcí pomocí 18S rDNA a ITS regionů

Sekvenování genu 18S rDNA a ITS regionů nachází uplatnění zejména v diagnostice mykotických infekcí. Používá se pro identifikaci kvasinek rodu Candida (obr. 2), Cryptococcus, Trichosporon a Aspergillus (17). Například Aspergillus fumigatus, běžný patogen způsobující plicní aspergilózu, je obtížně diagnostikovatelný pomocí tradiční kultivace, avšak rychle identifikovatelný za pomoci sekvenování ITS regionů a 18S rDNA (18). Dále se tato diagnostika používá při identifikaci původců dermatomykóz a dalších medicínsky významných hub (17). Testování vzorků s podezřením na konkrétní mykotické infekce je v současnosti prováděno spíše pomocí specifického PCR přístupu, cílícího na daný agens. Sekvenace má uplatnění například při podezření na mykózu bez bližšího upřesnění (19).

Sangerovo sekvenování lze velmi úspěšně použít i při detekci tkáňových helmintóz, například při identifikaci echinokokózy (obr. 3).

**Obr. 2. Rod Candida (barveno hematoxylin eozinem, zvětšení 20x). B: Nukleotidová sekvence Candida albicans získaná pomocí Sangerova sekvenování.**

Obr. 3. A: Přítomnost částí těla tasemnice Echinococcus granulosus ve tkáni (barveno hematoxylin eozinem, zvětšení 20x). B: Přítomnost částí těla tasemnice

NGS technologie byly využity také při detekci patogenů způsobujících rychle progredujících onemocnění s vysokou úmrtností. Jednalo se například o rod Mucorales, způsobující onemocnění zvané mukormykóza. Identifikací původce onemocnění mohlo dojít k rychlému nasazení cílené léčby (20).

Význam metagenomiky při diagnostice smíšených infekcí

Metagenomické sekvenování, specificky zaměřené na 16S nebo 18S rDNA, je užitečné při identifikaci smíšených infekcí, které často unikají pozornosti při tradičních diagnostických metodách. U pacientů se zápalem plic způsobeným více než jedním patogenem poskytla tato technologie komplexní přehled o mikrobiálním spektru přítomném v dýchacích cestách. Metagenomika umožňuje zkoumat mikrobiální komunity ve vzorcích, kde různé druhy mohou koexistovat a vzájemně ovlivňovat průběh onemocnění (21).

NGS technologie rovněž odhalily přítomnost dosud neidentifikovaných mikroorganismů v různých klinických scénářích. U pacientů s komplikovanými infekcemi se sekvenování nové generace stalo rozhodujícím nástrojem, který umožnil lékařům přizpůsobit léčbu na základě výsledků metagenomické analýzy (22).

VÝHODY A NEVÝHODY SEKVENOVÁNÍ

Výhody

Sekvenování 16S a 18S rDNA a ITS regionů nabízí oproti klasickým metodám, jako jsou kultivační techniky a mikroskopie, řadu výhod. Mezi nejvýznamnější patří rychlost diagnostiky a schopnost detekovat obtížně kultivovatelné mikroorganismy (23). V případě technologie sekvenování nové generace také vysokou citlivost při detekci mikroorganismů v případech, kdy je přítomno malé množství mikrobiální DNA, dále možnost analyzovat smíšené infekce a také široké spektrum mikroorganismů, které mohou být sekvenovány najednou, což poskytuje komplexní přehled o mikrobiální populaci přítomné ve vzorku (24).

Nevýhody

Na druhé straně má sekvenování své nevýhody, mezi které patří vysoké náklady na vybavení a provoz, náročnost bioinformatické analýzy a nutnost odborného personálu pro interpretaci výsledků. Získaná data z NGS jsou často velmi komplexní a vyžadují specializované softwarové nástroje pro jejich zpracování a analýzu (25).

Dalším problémem je riziko kontaminace vzorků, které může vést k falešně pozitivním výsledkům (14). Kontaminace může být způsobena i přítomností mikrobiální DNA v laboratorních reagenciích, což vyžaduje přísné protokoly pro prevenci kontaminace při přípravě vzorků (26, 27).

VÝZNAM SEKVENOVÁNÍ V SOUDNÍM LÉKAŘSTVÍ

Sekvenování genů 16S, 18S a ITS regionů hraje klíčovou roli nejen v klinické diagnostice, ale také v soudním lékařství. Technologie umožňuje forenzním odborníkům analyzovat mikrobiální vzorky odebrané z místa činu, což může být klíčové při identifikaci původců smrti, při určování času úmrtí tedy při řešení trestných činů (28–30).

Sekvenování v soudních případech

V soudním lékařství se metagenomické sekvenování uplatnilo při analýze vzorků tkání a biologických stop, jako je krev nebo tělní tekutiny. Příkladem je využití 16S sekvenování v případech, kdy nebylo možné tradičními metodami odhalit příčinu smrti u osob nalezených ve vodě. Metagenomická analýza odhalila přítomnost mikroorganismů charakteristických pro vodní prostředí, což přispělo k určení okolností úmrtí (30).

Dalším příkladem, kdy se uplatnila sekvenace 16S, 18S a ITS regionů je analýza vzorků získaných z hrobů, kdy sekvenování umožnilo detekci mikroorganismů v tkáních a poskytlo důkazy o čase úmrtí na základě změn mikrobiální populace (30).

Identifikace mikrobiálních stop na místě činu

Sekvenování 16S a 18S rDNA může být rovněž použito k analýze mikrobiálních stop na místě činu. DNA mikroorganismů, přítomná na površích nebo biologických vzorcích, může být klíčovým důkazem při určení, kde se daná osoba nacházela nebo jaké události předcházely trestnému činu. Mikrobiální analýza povrchů, jako jsou textilie nebo nástroje, přinesla nové možnosti v řešení složitých forenzních případů (28, 29).

BUDOUCÍ SMĚR TECHNOLOGIE SEKVENOVÁNÍ

Technologie sekvenování se neustále vyvíjejí. Sekvenování třetí generace, jako jsou například platformy pro nanopórové sekvenování (např. Oxford Nanopore), umožňují sekvenovat celé genomy v reálném čase bez potřeby předchozí PCR amplifikace. To zkracuje čas potřebný k analýze vzorků a zároveň zvyšuje přesnost sekvenování, protože je minimalizováno riziko zkreslení výsledků během PCR procesu (31).

Tyto nové technologie mohou rovněž přinést revoluci do oblasti personalizované medicíny, kde bude možné sekvenovat mikrobiom pacientů a přizpůsobit tak léčbu podle přítomnosti specifických patogenů nebo mikrobiálních komunit (32).

PROHLÁŠENÍ

Autor práce prohlašuje, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku není ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou. Toto prohlášení se týká i všech spoluautorů.

Zdroje

Church DL, Cerutti L, Gürtler A, Griener T, Zelazny A, Emler S. Performance and application of 16S rRNA gene cycle sequencing for routine identification of bacteria in the clinical microbiology laboratory. Clinical Microbiology Reviews 2020; 33 (4): 1–74.
Janda, JM, Abbott, SL. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology 2007; 45 (9): 2761–2764.
Mitreva, M. The Microbiome in Infectious Diseases. 2017; 68-74.
Schlaberg, R. Microbiome Diagnostics. Clinical Chemistry 2020; 66(1): 68–76.
Větrovský, T, Baldrian P. The Variability of the 16S rRNA Gene in Bacterial Genomes and Its Consequences for Bacterial Community Analyses. PLoS ONE 2013; 8(2): 1-10.
Patchett, AL, Rigby ML, Wynne JW. Improved 18S rDNA profiling of parasite communities in salmonid tissues using a host blocking primer. Parasitology Research 2024; 123,124(2): 1-11.
Gatei W, Greensill J, Ashford RW, et al. Molecular analysis of the 18S rRNA gene of Cryptosporidium parasites from patients with or without human immunodeficiency virus infections living in Kenya, Malawi, Brazil, the United Kingdom, and Vietnam. Journal of Clinical Microbiology 2003; 41(4): 1458–1462.
Besse, P. (2014). In P. Besse (Ed.). Nuclear Ribosomal RNA Genes: ITS Region, Humana, New York. Molecular Plant Taxonomy: Methods and Protocols 2014: 141–149.
Baldwin BG, Sanderson MJ, Porter JM, Wojciechowski MF, Campbell CS, Donoghue MJ. The its Region of Nuclear Ribosomal DNA: A Valuable Source of Evidence on Angiosperm Phylogeny. Annals of the Missouri Botanical Garden 1995; 82(2): 247–277.
Xu B, Zeng XM, Gao XF, Jin DP, Zhang LB. (2017). ITS non-concerted evolution and rampant hybridization in the legume genus Lespedeza (Fabaceae). Scientific Reports 2017, 7.
Clarridge JE. (2004). Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. In Clinical Microbiology Reviews 2004; 17(4): 840–862.
Park C, Kim SB, Choi SH, Kim S. Comparison of 16S rRNA Gene Based Microbial Profiling Using Five Next-Generation Sequencers and Various Primers. Frontiers in Microbiology 2021, 12.
Maidak BL, Larsen N, Mccaughey M, et al. The Ribosomal Database project. In Nucleic Acids Research 1994; 22 (17).
Woo PCY, Lau SKP, Teng JLL, Tse H, Yuen KY. Then and now: Use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. In Clinical Microbiology and Infection 2008; 14 (10): 908–934.
Maggi RG, Breitschwerdt EB. Potential limitations of the 16S-23S rRNA intergenic region for molecular detection of Bartonella species. Journal of Clinical Microbiology 2005; 43(3): 1171–1176.
Ito Y, Horiba K, Torii Y, et al. Open Forum Infectious Diseases Next-Generation Sequencing to Detect Pathogens in Pediatric Febrile Neutropenia: A Single-Center Retrospective Study of 112 Cases, 2021.

Reller LB, Weinstein MP, Petti CA. Detection and Identification of Microorganisms by Gene Amplification and Sequencing. MEDICAL MICROBIOLOGY 2007; 44.
Herrera ML, Vallor AC, Gelfond JA, Patterson TF, Wickes BL. Strain-dependent variation in 18S ribosomal DNA copy numbers in aspergillus fumigatus. Journal of Clinical Microbiology 2009; 47: 1325–1332.
Pham D, Sivalingam V, Tang HM, Montgomery JM, Chen SC-A, Halliday CL. Molecular Diagnostics for Invasive Fungal Diseases: Current and Future Approaches. Journal of Fungi 2024; 10(7): 447.
Zacharias M, Thüringer A, Krause R, Kashofer K, Gorkiewicz G. The mutual value of histopathology and ITS sequencing in the diagnosis of mucormycosis. Histopathology 2024; 84(4): 702–706.
Ghannoum M A, Jurevic RJ, Mukherjee PK, et al. Characterization of the oral fungal microbiome (mycobiome) in healthy indivi- duals. PLoS Pathogens 2010; 6(1).
Lozupone CA, Stombaugh JI, Gordon JI, Jansson JK, Knight R. Diversity, stability and resilience of the human gut microbiota. Nature 2012; 489(7415): 220–230.
Dethlefsen L, McFall-Ngai M, Relman DA. An ecological and evolutionary perspective on humang-microbe mutualism and disease. Nature 2007; 449(7164): 811–818.
Hugenholtz P, Goebel BM, Pace NR. Impact of Culture-Independent Studies on the Emerging Phylogenetic View of Bacterial Diversity. JOURNAL OF BACTERIOLOGY 1998; 180(18).
Relman DA. The Identification of Uncultured Microbial Pathogens. Source: The Journal of Infectious Diseases 1993; 168(1): 1–8.
Mchugh, J,Saleh OA. Updates in Culture- -Negative Endocarditis. Pathogens 2023; 12:1027.
Handelsman J. Metagenomics: Application of Genomics to Uncultured Microorganisms. Microbiology and Molecular Biology Reviews 2005; 69(1): 195.
Schmedes SE, Woerner AE, Budowle B. Forensic Human Identification Using Skin Microbiomes. Appl Environ Microbiol 2017; 83:1672- 1717.
Schmedes SE, Woerner AE, Novroski NMM, et al. Targeted sequencing of clade-specific markers from skin microbiomes for forensic human identification. Forensic Science International: Genetics 2018; 32: 50–61.
Metcalf JL, Xu ZZ, Weiss S, et al. Microbial community assembly and metabolic function during mammalian corpse decomposition. Science 2016; 351(6269): 158–162.
Loman N, Quick J, Simpson J. A complete bacterial genome assembled de novo using only nanopore sequencing data. Nat Methods 2015; 12: 733–735.
Gilchrist CA, Turner SD, Riley MF, Petri WA, Hewlett EL. Whole-genome sequencing in outbreak analysis. Clinical Microbiology Reviews 2015; 28(3): 541–563.