Cervikální sekret – důležitý faktor reprodukce

Souhrn

Cíl studie: Děložní hrdlo – cervix uteri – je důležitou součástí dělohy, má specifickou stavbu a funkci. Jeho poruchy mohou být příčinou závažných reprodukčních potíží a těhotenských komplikací. Zajišťuje bariéru mezi prostředím pochvy a endometria. Důležitým faktorem jeho správné funkce je kromě anatomické stavby také cervikální sekret. V průběhu menstruačního cyklu dochází k jeho dynamickým změnám. Rozsáhlý výzkum přináší nové poznatky o celulárních a molekulárních biomarkerech v cervikálním sekretu přítomných, které mohou přispět k diagnostice poruch lidské reprodukce. Cílem práce je prezentovat současné poznatky o funkci děložního hrdla a cervikálního sekretu při diagnostice poruch plodnosti.

Typ studie: Přehledová práce.

Název a sídlo pracoviště: Gynekologicko-porodnická klinika Lékařské fakulty Masarykovy univerzity a FN Brno; Porodnicko-gynekologická klinika FN a LF UP Olomouc; Katedra ošetřovatelství a porodní asistence Lékařské fakulty Masarykovy univerzity a FN Brno.

Metodika: Literární rešerše databáze PubMed publikované do února 2020 s termíny zaměřenými na: „cervical mucus“, „sperm cervical mucus intraction“, „cervical mucus composition“, „cervical biomarkers“.

Výsledky: Literární rešerší byly shrnuty aktuální poznatky o roli děložního hrdla a cervikálního sekretu v oblasti lidské reprodukce. Analýza molekulárních a celulárních biomarkerů v cervikálním sekretu může přispět k diagnostice poruch plodnosti.

Závěr: Specifická analýza buněčného a molekulárního složení cervikálního sekretu přináší důležité poznatky o jeho fyziologické funkci a možných poruchách. Poskytuje informace o aktivitě a receptivitě endometria, průběhu těhotenství a jeho patologiích včetně rizika předčasného porodu.

Klíčová slova:

děložní hrdlo – cervikální hlen – proteom – cervikální biomarkery

ÚVOD

Děložní hrdlo – cervix uteri – představuje vstupní a současně výstupní bránu reprodukčního ústrojí ženy. Má řadu důležitých funkcí – zajišťuje bariéru mezi prostředím pochvy a endometria, umožňuje průnik spermií a odtok nitroděložního sekretu nebo krve při menstruaci, chrání vyvíjející se těhotenství a umožňuje vaginální porod. Těmto funkcím je přizpůsobena jeho stavba. Důležitým faktorem správné funkce je kromě anatomické stavby také cervikální sekret. V průběhu menstruačního cyklu dochází k jeho dynamickým změnám. Poruchy děložního hrdla mohou být příčinou závažných reprodukčních obtíží a těhotenských komplikací. Rozsáhlý výzkum přináší nové poznatky o celulárních a molekulárních biomarkerech v cervikálním sekretu přítomných, které mohou přispět k diagnostice poruch lidské reprodukce.

Výskyt patologií cervikálního sekretu jako příčiny neplodnosti je odhadován na 8 % [2]. Rozvoj a efektivita metod asistované reprodukce vedly k tomu, že vyšetření děložního hrdla kromě screeningu karcinomu je věnována minimální pozornost. Přitom byly publikovány zajímavé práce o buněčných, imunologických a dalších humorálních složkách cervikálního hlenu reflektujících stav nitroděložního prostředí [11, 18].

Cílem práce je prezentovat současné poznatky o funkci děložního hrdla a cervikálního sekretu při diagnostice poruch plodnosti.

ANATOMIE DĚLOŽNÍHO HRDLA

Stroma cervixu je denzní, složené z hladké svaloviny a vaziva, prostoupené cévami, lymfatiky a nervovými vlákny. Vazivová složka je tvořena kolagenními a elastickými vlákny, mezibuněčná hmota je tvořena molekulami glykosaminoglykanu. Velikost hrdla se mění v závislosti na mnoha faktorech – věk, hladiny ovariálních steroidů, těhotenství, porodní poranění, operační výkony na hrdle provedené. Endocervikální kanál je pokryt jednovrstevným sekrečním cylindrickým epitelem, v oblasti skvamo-kolumnární junkce přechází ve vrstevnatý nerohovějící epitel dlaždicový. Podrobný přehled anatomické a histologické stavby byl publikován nedávno [1, 16].

CERVIKÁLNÍ SEKRET

Cervikální sekret je glykoproteinový gel tvořený cervikálními žlázkami. Brání proniknutí patogenních mikrooganismů do dělohy, umožňuje prostup a přežití spermií. V reprodukčním období se jeho složení a vlastnosti výrazně mění v závislosti na fázích menstruačního cyklu.

Endocervikální žlázky jsou krypty zanořené do stromatu cervixu; přes ústí komunikují přímo s endocervikálním kanálkem. Jsou vystlány cylindrickým epitelem, který produkuje sekret. Podle vzhledu a vnitřní struktury můžeme rozlišit bazální buňky, sekreční cylindrické buňky a cylindrické buňky s řasinkami. Ciliární buňky zajišťují výměnu iontů a hydrataci mucinu. Některé studie předpokládají rozdílnou funkci žlázek podle jejich lokalizace v cervixu – výše uložené žlázky produkují méně viskózní sekret, níže uložené produkují sekret s vyšší viskozitou [14].

BIOCHEMICKÉ SLOŽENÍ CERVIKÁLNÍHO SEKRETU

Biochemické složení cervikálního sekretu je ovlivněno mnoha faktory – věkem, fází cyklu, hormonálními hladinami, poševním prostředím. Cervikální sekret je složen z vody (90–98 %) a četných organických i anorganických látek – mucinů, polysacharidů, oligosacharidů, proteinů, lipidů, organických kyselin a iontů. Viskoelastické vlastnosti sekretu závisí na mucinech – hlavních strukturálních proteinech, což jsou velké glykosylované polymerní molekuly spojené disulfidickými vazbami. Na základě fyzikálních vlastností rozlišujeme muciny sekreční (vytvářejí strukturu sekretu) a membránové (chrání povrchové membrány epiteliálních buněk) [14]. V cervikálním sekretu jsou přítomny především MUC2, MUC5AC, MUC5B a MUC6. Vysoký obsah cysteinu umožňuje disulfidické vazby důležité pro vznik polymerů. Navázané oligosacharidy a polysacharidy ovlivňují biofyzikální vlastnosti sekretu, jeho stabilitu a odolnost proti bakte­riál­ním enzymům.

STRUKTURA CERVIKÁLNÍHO SEKRETU

Nové poznatky o struktuře cervikálního hlenu přinesla vyšetření pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) a mikroskopie atomárních sil AFM (atomic force microscopy). Molekuly mucinu mohou mít tvar filament, která se navzájem spojují do paralelních svazků a sítí nebo mohou vytvářet globulární struktury. Důležitým faktorem je pH prostředí, ve kterém se nacházejí. Při hodnotě nižší, než je izoelektrický bod mucinu, vznikají filamenta a husté sítě, při hodnotě vyšší se vlákna rozvolňují a vznikají globulární struktury. AFM v proliferační fázi cyklu prokázala hustou síť filament s otvory asi 500 nm, což neumožňuje proniknutí spermie. V ovulačním sekretu byla struktura zcela odlišná – mucin vytvářel disperzní agregované globule, což vysvětluje snížení viskozity [6].

Kromě hodnoty pH reologické vlastnosti sekretu a jeho viskozitu ovlivňuje glykosylace mucinů, především řetězce kyseliny sialové (N-acetylneuraminové) a sacharidů se sulfátovými skupinami. Náboje na těchto skupinách stabilizují konfiguraci mucinů a ovlivňují viskozitu sekretu. Podrobná analýza proteomu ovulačního cervikálního sekretu prokázala převahu neutrálních oligosacharidů, mimo ovulaci převažovaly acidické oligosacharidy. To koreluje s poznatkem, že snížení pH zvyšuje viskozitu cervikálního sekretu.

Makromolekuly mucinů jsou štěpeny řadou enzymů – proteáz, sialidáz, glykosidáz a sulfatáz, což mění jejich fyzikální vlastnosti. Tyto enzymy tak mohou měnit nejen viskozitu, ale také interakci se spermiemi nebo bakteriemi. Dekondenzace mucinů zvýšením koncentrace HCO₃ usnadní enzymatické štěpení vzájemné vazby NH₂ a COOH a změnu jejich konformace. Bylo prokázáno, že aktivita sialidázy dosahuje maxima v době ovulace [9].

CYKLICKÉ ZMĚNY STRUKTURY CERVIKÁLNÍHO HLENU

V průběhu menstruačního cyklu se mění množství, fyzikální (reologické) vlastnosti a biochemická struktura v závislosti na hormonálních hladinách. V endocervixu převažují MUC5B a MUC4. Bylo prokázáno, že v období ovulace se množství MUC5B zvyšuje až sedmkrát v porovnání s obdobím mimo ovulaci a dramaticky klesá při vzestupu progesteronu. V průběhu cyklu se kromě zastoupení jednotlivých mucinů v cervikálním sekretu také mění pH, obsah vody, glykosylace a další biofyzikální vlastnosti (tab. 1) [6].

MECHANISMUS A ŘÍZENÍ SEKRECE CERVIKÁLNÍHO SEKRETU

Biosyntéza mucinů probíhá v endoplazmatickém retikulu a Golgiho aparátu. Molekuly mucinů jsou komprimované a uložené ve velkých sekrečních granulích, které tvoří podstatnou část mukózních buněk a nacházejí se také v jejich okolí jako vezikuly. Po uvolnění z granulí nebo vezikul se kondenzované molekuly mucinů rozvíjejí. Při tom se uplatňují jednak náboje ionizovaných řetězců, jednak hydratace. V granulích převažuje koncentrace kalciových kationtů, které kompenzují negativní náboje na mucinu. Při sekreci přes otevřené kanály ve stěně jsou ionty Ca²⁺ nahrazovány Na⁺. Zvyšuje se tak osmotický tlak, což vede ke vstupu molekul vody a bobtnání mucinů. Tento proces urychluje sekrece HCO^3- a štěpení intramolekulárních vazeb enzymy.

Množství a vlastnosti mucinů cervikálního sekretu závisí na hladinách ovariálních steroidů. Mechanismy jejich působení můžeme rozdělit na pomalé (v řádech hodin) a rychlé (v řádech sekund). K pomalým patří exprese genů pro muciny, jejich syntéza, glykosylace a sekrece. K rychlým patří regulace pohybu iontů a vody při transformaci a hydrataci makromolekul mucinů.

OCHRANNÁ FUNKCE CERVIKÁLNÍHO SEKRETU PROTI INFEKCÍM

Na ochraně proti průniku patogenů se podílí kromě fyzikálně-chemických vlastností sekretu také imunitní systém, jehož buňky jsou uloženy ve sliznici cervixu a patří k vrozené i adaptivní imunitě. Reagují na hormonální změny a uvolňují mediátory, které řídí migraci imunitních buněk. V časných fázích infekce imunitní buňky cervixu produkují velké množství cytokinů působících proti pronikajícím patogenům. K nejčastěji studovaným patří interleukiny (IL-1b, IL-1a, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, macrophage inflammatory protein (MIP-1a), granulocyte colony-stimulation factor a tumor necrosis factor. Nejvyšší koncentrace měly IL-1, IL-6 a IL-8. V cervixu jsou přítomny četné plazmatické buňky vytvářející IgA, IgG, IgM a některé složky komplementu. V průběhu ovulace se koncentrace imunoglobulinů v cervikálním sekretu snižuje [19].

INTERAKCE CERVIKÁLNÍHO HLENU SE SPERMIEMI

Průnik spermií cervikálním sekretem je umožněn adekvátní biochemickou a fyzikální strukturou a tolerancí imunitního systému děložního hrdla. Imunitní systém musí současně bránit průniku patogenů a tolerovat alogenní spermie, což vyžaduje jeho přesné nastavení. Při diagnostice poruch plodnosti byly provedeny podrobné studie jednotlivých faktorů imunitního systému, které mohou spermie poškozovat. Antispermatozoidální protilátky (ASA = anti-sperm antibodies) mohou být IgA nebo IgG. Je možné je diagnostikovat různými metodami – MAR test (= mixed anti-globulin reaction), mikroaglutinace spermií, imobilizace spermií, imunofluorescence. Přímou interakci spermií s cervikálním hlenem hodnotí postkoitální test, Kremerův test (sperm-cervical mucus penetration test) a sperm-cervical mucus contact test. ASA mohou poškodit kapacitaci spermií, akrozomální reakci, fertilizaci oocytů nebo preimplantační embryo. Byly vyšetřovány také protilátky proti lamininu-1. Lamininy jsou multifunkční glykoproteiny, které se podílejí na důležitých biologických aktivitách membrán – adhezi, stabilizaci a tvarových změnách. Nebyly však prokázány významné souvislosti s reprodukčními potížemi [18]. Kromě protilátek se mohou v cervixu uplatňovat také NK (natural killers) buňky [20].

FUNKCE DĚLOŽNÍHO HRDLA PO CHIRURGICKÝCH VÝKONECH

Chirurgické výkony na děložním hrdle vedoucí k destrukci nebo odstranění tkáně postihují také žlázky endocervixu. Nejčastějším výkonem je metoda LLETZ (large loop excision of the transformation zone) aplikovaná v souvislosti s diagnostikou a léčbou prekanceróz, méně časté jsou plastické úpravy závažných poporodních dilacerací. Funkci cervixu může poškodit stenóza, sekundární infekce nebo změny biofyzikálních vlastností cervikálního sekretu. Výsledný efekt závisí na rozsahu odstraněné tkáně, hloubce defektu, použité operační technice a průběhu hojení. Průnik spermií může ztížit nedostatečné množství a abnormní složení cervikálního sekretu, zajizvení cervikálního kanálku může bránit správnému zavedení soupravy při transferu embrya. Redukovaná tkáň cervixu může být příčinou předčasného porodu, fibrotizace může ztížit dilataci při porodu a vést k rupturám hrdla [17].

PROTEOM CERVIKÁLNÍHO SEKRETU – ZDROJ INFORMACÍ O INTRAUTERINNÍM PROSTŘEDÍ

Do cervikálního sekretu se dostávají látky produkované ve vyšších etážích reprodukčního ústrojí, především endometriem nebo těhotenstvím. Pro neinvazivní detekci intraamniální infekce a riziko předčasného porodu je možné využít stanovení dominantní bakterie v cervikální tekutině [12]. V současné době nové možnosti diagnostiky reprodukčních patologií přináší vyšetření proteomu cervikálního sekretu.

Proteom je definován jako soubor všech proteinů produkovaných buňkami určité tkáně za určitých podmínek. Proteomika studuje přítomnost a množství proteinů, jejich interakci, modifikaci, funkci a místo vzniku. Stala se rychle se rozvíjející oblastí uplatňující se ve všech oblastech vědy. Dokáže stanovit sekvenci aminokyselin, molekulovou hmotnost, strukturu specifických vazeb a interakci s jinými látkami. Umožňuje tak lépe pochopit fyziologické i patologické procesy, které v tkáních probíhají.

Analýza vzorků má několik fází – separace proteinů (nejčastěji gelovou separací), ionizace (např. MALDI = matrix assisted laser desorption/ionization), analýza iontů metodou hmotnostní spektrometrie (MS = mass spektrometry) a zpracování výsledků metodami bioinformatiky. Využití velkých biologických databází – např. STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins) umožní získat informace o funkci jednotlivých proteinů v signálních drahách, metabolismu a organelách buňky. Velmi slibné jsou proteomické analýzy cervikálního sekretu v souvislosti s možností neinvazivní diagnostiky endometriózy a receptivity endometria.

PROTEOM ENDOMETRIÓZY V CERVIKÁLNÍM SEKRETU

Symptomy endometriózy mohou být vyvolány různými mechanismy – chronickým zánětem, alterací imunitního systému, abnormální produkcí prostaglandinů nebo mechanickým poškozením tkání [15]. Podrobná analýza proteomu cervikálního sekretu u žen s endometriózou prokázala zvýšenou expresi šesti proteinů v porovnání s ženami bez endometriózy. Z nich čtyři proteiny jsou zapojeny do zánětlivých reakcí – pIgR (polymeric immunoglobulin receptor), alpha-1-kyselý glykoprotein 2, „metalloproteinase inhibitor 1“ a „neutrophil gelatinase-associated lipocalin“ [10].

PROTEOM RECEPTIVNÍHO ENDOMETRIA V CERVIKÁLNÍM SEKRETU

Receptivní endometrium je výsledkem dynamických změn probíhajících v epiteliálních buňkách [4, 5, 13] včetně aktivity mikrobiomu [3, 4, 5]. Optimalizace přípravy endometria patří k aktuálním tématům asistované reprodukce [21, 22]. Odhalení molekulární podstaty těchto změn mohou přinést proteomické studie. V recentních pracích [7, 8] byly prokázány signifikantní rozdíly v proteomu endometriálních buněk fertilních a infertilních žen – tzv. epiteliální receptom. Bylo identifikováno celkem 2048 různých proteinů, z nich bylo 137 charakteristických pro receptivní endometrium a 134 pro nereceptivní endometrium. V receptivním endometriu byly dle biodatabáze STRING proteiny podílející se na adhezi buněk, tvorbě mezibuněčných junkcí a receptoru pro vaskulární endoteliální faktor. V nereceptivním endometriu byly charakteristické proteiny podílející se na permeabilitě membrány, metabolismu lipidů a respiraci mitochondrií (tab. 2).

ZÁVĚR

Specifická analýza buněčného a molekulárního složení cervikálního sekretu přináší důležité poznatky o jeho fyziologické funkci a možných poruchách. Poskytuje informace o aktivitě a receptivitě endometria, průběhu těhotenství a jeho patologiích včetně rizika předčasného porodu.

MUDr. Karel Crha

Gynekologicko-porodnická klinika

LF MU a FN

Obilní trh 11

643 00 Brno

e-mail: crha.karel@fnbrno.cz