Cirkulujúca HPV DNA u pacientok s cervikálnymi prekancerózami a rakovinou krčka maternice

Souhrn

Cíl studie: V našom prehľadovom článku sme sa zamerali na cirkulujúcu HPV DNA a jej potenciálnu úlohu v patogenéze karcinómu krčka maternice a pri odhade prognózy pacientok s daným zhubným ochorením.

Typ studie: Článok predstavuje systematickú prehľadovú štúdiu analyzujúcu dostupné odborné a vedecké publikácie zamerané na cirkulujúcu HPV DNA.

Název a  sídlo pracoviště: Gynekologicko-pôrodnícka klinika, Jesseniova lekárska fakulta v Martine, Univerzita Komenského v Bratislave, Martin, Slovensko. Metodika: V našej štúdii sme prehľadávali medicínsku databázu PubMed s kľúčovými slovami circulating HPV DNA, cervical cancer, cervical precanceroses. Jadro práce tvoria vedecké štúdie uverejnené v  anglickom jazyku od roku 1995.

Výsledky: V medicínskej databáze PubMed sme identifikovali 13 štúdií analyzujúcich úlohu cirkulujúcej HPV DNA v procese cervikálnej karcinogenézy. Z výsledkov dostupných štúdií vyplýva, že cirkulujúca HPV DNA predstavuje významný prognostický marker onkologických ochorení krčka maternice, a  to aj v  skorých štádiách.

Závěr: Výsledky ohľadom cirkulujúcej HPV DNA poukazujú na význam molekulárnej biológie v  stanovení prognózy rakoviny krčka maternice. Daná skutočnosť musí byť ďalej podporená relevantnými štúdiami. Uniformnosť štúdií a využitie najmodernejších metód by mohli napomôcť presne odpovedať na otázku o reálnej úlohe cirkulujúcej HPV DNA v procese cervikálnej karcinogenézy a progresie ochorenia.

Klíčová slova:

rakovina krčka maternice – HPV – cirkulujúca HPV DNA

ÚVOD

V roku 2012 bolo na celom svete identifikovaných 527 624 nových prípadov rakoviny krčka maternice, ktoré predstavujú 29,5 % všetkých malignít spojených s infekčným ochorením. Rakovina krčka maternice je štvrté najčastejšie zhubné ochorenie u žien a druhé najčastejšie zhubné ochorenie u žien vo veku 15–44 rokov [7]. Ukázalo sa, že infekcia vysoko rizikovým typom ľudského papillomavírusu (HPV) je kauzálne spojená s rakovinou krčka maternice v 99,7 % prípadov [25]. V súčasnosti je považovaných za karcinogénne alebo vysoko rizikové HPV vírusy 12 typov (HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58 a HPV59) [2].

HPV infekcia vedúca k  rozvoju cervikálnych prekanceróz postihuje špecifické oblasti prechodných epitelových buniek cervixu (napr. bunky skvamokolumnárnej junkcie) so zložitými regulačnými vzormi, ktoré ich môžu robiť náchylné voči transfomujúcej vírusovej infekcii [10]. Prirodzený prenos kožnej infekcie zahŕňa fyzický kontakt keratinizovanej vrstvy bradavice so zdravou pokožkou s mikroabráziami, ktoré umožňujú prenos exfoliovaných buniek obsahujúcich vírus do rany. Uvoľňovanie vírusov z postihnutých skvamóznych buniek by mohlo byť založené na rozklade keratínových vláken pod vplyvom vírusového proteínu E4 a  mikrobiálnych/hostiteľských proteáz [20]. Slizničné HPV lézie sa vyvíjajú na základe mechanického poškodenia pri pohlavnom styku alebo ako následok vaginálnej a análnej infekcie. Otázkou je, či by virióny mohli dosiahnuť bazálne bunky cez obrátený transport v oblasti epiteliálneho konfliktu (transformačná zóna) [28]. Bunkové experimenty ukázali, že virióny sa môžu viazať na bunkové filopódie a tak byť reverzne transportované ďalej na významné vzdialenosti (prenos z bunky do bunky alebo z bunky do extracelulárnej matrix), čím bola vynechaná klasická dráha poškodenia epitelu [21].

CIRKULUJÚCA HPV DNA

HPV mRNA a DNA boli detegované v periférnej krvi u  pacientov s  pokročilou rakovinou krčka maternice, zhubným ochorením hlavy a  krku, pričom korelovali so zlou prognózou [3,16,24]. Hypotéza týkajúca sa úlohy HPV DNA v metastatickom procese je však stále nevyriešená. Plazma od pacientov so zhubným ochorením použitá ako kultivačné médium má schopnosť transformácie buniek, preto Wischwendter a  kol. predpokladali, že cirkulujúca HPV DNA (cHPV-DNA) hrá možnú úlohu v tvorbe metastáz [27]. Prítomnosť danej DNA v  krvi je však skôr markerom nádorovej záťaže (tumor load), nie markerom životaschopných nádorových buniek. Presný mechanizmus uvoľnovania HPV DNA do cirkulácie je stále neznámy, hoci vieme, že odráža rozsah nádorového ochorenia, a  preto má dôležitú prognostickú hodnotu. Cirkulujúca DNA je vo všeobecnosti lepší marker ako RNA, keďže je podstatne stabilnejšia [8].

DNA vysokorizikových HPV vírusov sa našla aj na viacerých exotických miestach vrátane prsníkov, pľúc, hrubého čreva a pažeráka. Vírusové nukleové kyseliny boli detegované dokonca aj v spermatických bunkách, placentárnom tkanive alebo PBMCS [5].

Presný mechanizmus, ktorý dáva odpoveď na tak rozšírenú infekciu HPV DNA, zostáva nevyriešený. Prítomnosť HPV DNA v plazme môže byť spôsobená rôznymi faktormi. Prvá možnosť zahŕňa myšlienku vírusových častíc pochádzajúcich priamo z krvi, aj keď sa v obehu priama prítomnosť viriónov nepreukázala [24]. Druhá možnosť zahŕňa nekrózu primárneho nádoru a  jeho rozpad [23]. Tento scenár je tiež otázny z  dôvodu zachytenia plazmatickej HPV DNA aj v skorých štádiách rakoviny krčka maternice a znížených hladín HPV DNA po primárnej liečbe, ktorá by logicky viedla k roztrúseniu DNA do cirkulácie [17]. Tretia možnosť je založená na apoptickom procese straty bunkovej membrány a uvoľnení viriónov do cirkulácie. Táto možnosť je tiež nejasná, vzhľadom na fakt, že apoptotický proces je počas procesu karcinogenézy downregulovaný prostredníctvom inhibície p53 proteínom HPV E6. Ďalšia premenná, ktorá ovplyvňuje metastatický proces, je imunitný systém, ktorý by mohol vysvetlovať rozdiel medzi pozitívnymi hodnotami cirkulujúcej HPV DNA a chýbajúcim dôkazom aktívnej infekcie [3].

MATERIÁL A METODIKA

V našej prehľadovej práci sme sa zamerali na cirkulujúcu HPV DNA a  jej potenciálnu úlohu v  patogenéze karcinómu krčka maternice a  pri odhade prognózy pacientov s  daným zhubným ochorením. V medicínskej databáze PubMed sme identifikovali 13 štúdií analyzujúcich úlohu cirkulujúcej HPV DNA v procese cervikálnej karcinogenézy. Zhrnutie dostupných prác s dôrazom na typy analyzovaných vzoriek, typy cirkulujúcej HPV DNA a percento pozitívnych vzoriek na prítomnosť cirkulujúcej HPV DNA je znázornené v tabuľkách 1 a 2.

HPV DNA NACHÁDZAJÚCA SA V PERIFÉRNYCH MONONUKLEÁRNYCH BUNKÁCH (PBMCS)

HPV DNA je detegovateľná v mononukleárnych bunkách periférnej krvi (PBMC), v plazme alebo v sére pacientov s rakovinou krčka maternice a rakovinou orofaryngu. Aj keď nie je pozorovaná žiadna viremická fáza počas HPV infekcie, je i naďalej potrebné zamerať výskum na mononukleárne bunky (PMBC) ako nosiče HPV DNA. Úspešný prenos bovínneho papilomavírusu typu 2 z periférnej krvi medzi jedincami poukázal na istú pravdepodobnosť hematogénnej cesty šírenia infekcie [22].

HPV DNA detegovaná v  periférnej krvi bola pôvodne chápaná ako dôsledok metastazujúcich buniek a bunkových zvyškov uvoľnených do cirkulácie. Teraz sa naskytá otázka ohľadom možného šírenia ochorenia prostredníctvom PBMCs. PBMC migrujú do miesta zápalu a absorbujú mikroorganizmy z tkanív a krvi. Je možné, že PBMC vykonávajú tento druh obranného mechanizmu známeho pri iných vírusových infekciách aj pri infekcii HPV [1].

Prvá štúdia hodnotiaca prítomnosť HPV DNA v mononukleárnych krvných bunkách u pacientov s urogenitálnymi infekciami bola publikovaná autormi Pao et al. v roku 1990 [16]. Hoci autori identifikovali iba fragmenty HPV DNA zodpovedajúce fragmentu DNA (ORF E6), je to stále prvá štúdia analyzujúca spojitosť HPV infekcie a PBMC. Bola vyslovená hypotéza, že súčasné pozorovanie HPV DNA v PBMC môže predstavovať interakciu HPVPBMC a  môže hrať úlohu v  imunitnej odpovedi na HPV infekciu [16]. Prítomnosť HPV genómu v PBMC bola takisto analyzovaná u pediatrických pacientov s HIV infekciou. PBMC HPV DNA pozitivita bola diagnostikovaná u 8 pacientov (14 %), ktorí boli infikovaní, v 7 prípadoch krvnou transfúziou. Všetci pacienti boli bez anamnézy pohlavného styku, takže HPV infekcia mohla byť získaná práve prostredníctvom krvných produktov. Tento fakt podporuje myšlienku možného prenosu krvou, hoci pozitivita HPV 16 DNA u týchto pacientov bola len prechodná [1]. Na druhej strane Bodaghi a  kol. neboli schopní dokázať HPV transkripty z HPV pozitívnych PBMC alebo definovať presnú subpopuláciu buniek (monocyty, lymfocyty), čo naznačuje, že PBMC neumožňujú množenie vírusu.

Počas integrácie HPV vírusu dochádza k porušeniu E2 génu, čo umožňuje expresiu proteínov E6 a E7. E2 proteín bol dokázaný vo všetkých prípadoch pozitívnych na HPV, čo dokazuje prítomnosť HPV DNA v PBMC v epizomálnej forme [35].

V  krvi boli doteraz detegované iba slizničné typy HPV bez aktívnej replikácie [4]. Chen a kol. izolovali HPV DNA z  PBMC u  15 zo 180 zdravých mužských darcov krvi (8,3 %), v 3 prípadoch boli zistené vírusy HPV 16 a  HPV 18 (1,7 %). Ostatné HPV vírusy patrili do rodov Alfa (HPV 27, HPV 32, HPV 70, HPV 97 a HPV 102), Beta (HPV 12, HPV 15 a HPV 47) a Gamma (HPV 48, HPV 65, HPV FA31 a HPV FA55). HPV DNA bola dokázaná v krvi iba bez ošetrenia trypsínom. Preto sa zdá, že HPV je pripojený k PBMC ako povrchový proteín [4]. Táto štúdia poskytuje dôkaz, že HPV sa nemusí šíriť iba pohlavným stykom, odreninami kože alebo priamym kontaktom [4].

PROGNOSTICKÁ HODNOTA CIRKULUJÚCEJ HPV DNA

Detekcia cirkulujúcej HPV DNA sa výrazne líši medzi štúdiami v závislosti od metodiky a pohybuje sa medzi 6,9 až 100 %. Dostupné štúdie použili rôzne biologické materiály (sérum/plazma), rôzne DNA extrakčné metódy a techniky detekcie, takže porovnanie hladín HPV DNA je obmedzené. Vyššie koncentrácie genómovej HPV DNA (20krát ) sa našli v sére s tzv. cell-free DNA [15].

V prípade diagnostických metód sa tzv. double droplet PCR (ddPCR) zdá byť najpresnejšou technikou na detekciu cirkulujúcej HPV DNA. V porovnaní s klasikcou PCR bol pozorovaný signifikantný rozdiel v záchyte DNA (83 % vs 60 %). Množstvo HPV DNA záviselo hlavne od štádia ochorenia a veľkosti tumoru [12].

Percento pozitívnych prípadov v prípade HPV 16 rastie so štádiom ochorenia (I:25 % – II: 61,3 % – III: 74,3 % – IV: 100 %). Stredová hodnota tzv. vírusovej nálože (viral load) v  prípadoch cervikálneho karcinómu dosahuje pre HPV 16 174–699 kópií/ml a pre HPV 18 200–2590 kópií/ml [8]. Vírusová DNA pochádza zo samotného nádoru, ktorý je charakterizovaný rovnakým typom HPV vírusu detegovaným v plazme a samotnom nádore [17]. Štúdia Widschwendter detegovala HPV DNA v plazme v 45 % prípadov rakoviny krčka maternice, pričom pri dvoch prípadoch boli zistené odlišné typy vírusov v nádore a plazme (HPV 18-16 a HPV 33-16). Štyri pacientky s  pozitívnou plazmatickou HPV DNA neboli onkologickí pacienti. Bol pozorovaný trend k vyššej miere detekcie séra hlavne v pokročilom štádiu nádoru (52 % a 50 % v štádiu III a IV). Dva prípady s rôznymi typmi HPV v sére a tkanivách môžu byť spôsobené nezistenou dvojitou infekciou. Obe pacientky boli v skorom štádiu rakoviny krčka maternice [27]. Štúdia autorov Sathish a kol. na druhej strane dosiahla 100% zhodu typov HPV v krvi a samotnom nádore [19].

Prípady bez dokázanej cirkulujúcej HPV DNA neboli v čase trvania štúdie Ho et al. spojené s rekurenciou ochorenia. Na druhej strane pacientky s vysokou vírusovou záťažou HPV52 DNA mali veľmi zlú prognózu a zomreli do 8 mesiacov [11]. Podobne bola pozorovaná aj asociácia cirkulujúcej HPV DNA a vzdialených metastáz. Polovica pacientov s  cirkulujúcou HPV DNA sa prezentovalo s  metastatickým rozsevom s  relatívnym rizikom (RR) 15.67. Detegovaná vírusová DNA pochádza zo samotného tumoru, čo dokazuje aj rovnaký typ HPV DNA prítomnej v  plazme [17]. Identifikovateľná plazmatická HPV DNA na konci chemoterapie predbiehala klinickú diagnózu metastatického rozsevu a  bola spojená s  horším prežívaním. Cirkulujúca HPV DNA je dokonca presnejšia v diagnostike reziduálneho ochorenia ako FDG-PET [9]. Autorský kolektív Kang et al. ďalej publikoval, že cirkulujúca HPV DNA môže byť použitá pri T-bunkovej imunoterapii a môže slúžiť ako marker efektivity v liečbe cervikálneho karcinómu počas follow-up.

Prognostická hodnota cirkulujúcej HPV DNA môže hrať významnú úlohu aj v prípade skorých štádií rakoviny krčka [19]. Kay et al. dokázali cirkulujúcu HPV DNA u 24,4 % prípadov karcinómu, pričom prekancerózne lézie neboli spojené s HPV DNA ani v jednom z pozorovaných prípadov. Miera detekcie cirkulujúcej HPV DNA v štádiu I a II bola relatívne vysoká a dosahovala 52,9 % [26]. c-HPV DNA bola dokázaná aj v prípadoch s minimalistickými rozmermi nádoru; konkrétne išlo o nádory s priemerom iba 1 mm [12]. Cirkulujúca HPV DNA bola zachytená aj v jednom prípade karcinómu in situ a jednej zdravej kontrole [5]. Príčinou mohla byť aj kontaminácia vzorky alebo skrytá malignita v tele pacientky.

Iba niekoľko štúdií analyzovalo cirkulujúcu HPV DNA v  plazme pacientok s  prekancerózami krčka maternice. Cocuzza a  kol. dokázali 38,9% pozitivitu cHPV DNA v léziách HSIL a 15,4% v iných prípadoch zmenenej cytológie. Najbežnejšími typmi vírusov boli HPV 45 (46,3 %), HPV 51 (29,6 %) a  HPV 16 (18,5 %). Najvyššia hodnota vírusovej nálože v plazme bola pozorovaná pri víruse HPV 16 (1099 kópií na ml). Zhoda v detekcii danej HPV DNA medzi vzorkami plazmy a krčka maternice bola iba 44 % [5]. Mohlo by to byť dôsledkom vírusového clearance a  prítomnosti HPV vírusovej infekcie mimo genitálu [1, 12, 18].

ZÁVER

Náš prehľadový článok dostupných publikácií v  medicínskych databázach poukázal na možnú prognostickú úlohu cirkulujúcej HPV-DNA nielen v prípadoch pokročilých štádií rakoviny krčka maternice, ale aj v lokalizovaných léziách. Táto skutočnosť vyvoláva otázku, či cHPV-DNA môže slúžiť ako nepriaznivý prediktor prežívania pacientok s potrebou radikálnejšej liečby. Podobne môže byť cHPV-DNA použitá v budúcnosti aj na sledovanie po chirurgickom výkone a  adjuvantnej terapii. Pozitivita cHPV-DNA v prípadoch prekanceróz ostáva diskutovaným výsledkom s možným využitím ako triage testu. Daná skutočnosť musí byť ďalej podporená relevantnými štúdiami. Uniformnosť štúdií a využitie najmodernejších metód molekulovej biológie by mohli napomôcť presne odpovedať na otázku o  reálnej úlohe cHPV-DNA v  procese cervikálnej karcinogenézy a progresie ochorenia.

Táto publikácia je podporená projektom: Molekulárna diagnostika rakoviny krčka maternice, ITMS: 26220220113.

MUDr. Štefan Krivuš, CSc.

Gynekologicko-pôrodnícka klinika JLF UK

Kollárova 2

036 01 Martin

Slovenská republika

e-mail: stefan.krivus@uniba.sk