Současné možnosti diagnostiky prekanceróz a karcinomu děložního hrdla

Souhrn

Cíl studie:
Přehled současných metod v diagnostice prekanceróz a karcinomů děložního hrdla.

Typ studie:
Literární přehled.

Název a sídlo pracoviště:
Reprofit International s.r.o., Brno; Gynekologicko-porodnická klinika Fakultní nemocnice a Lékařské fakulty Masarykovy univerzity, Brno; Bioptická laboratoř s.r.o., Plzeň.

Předmět a metoda studie:
V současné době je pro včasnou detekci lézí děložního hrdla k dispozici celá skupina neinvazivních prebioptických metod, která zaznamenala dynamický rozvoj. Zavedení digitalizace kolposkopického obrazu a použití spektroskopických technik umožní vytvoření barevného mapování slizničních změn děložního hrdla. V oblasti onkologické cytologie nastupuje využití biomarkerů (např. p16/Ki-67) a počítačové analýzy obrazu v tekutých cytologiích (Liquid Based Cytology – LBC). Na molekulárně genetické úrovni se používají různé typy testů k detekci deoxy- nebo ribonukleové kyseliny (DNA, RNA) vysoce rizikových typů lidských papilomavirů (High Risk Human Papillomavirus – HR HPV). Zavedení HPV testace do screeningových postupů v ČR dále zvýší citlivost screeningu. Přesnější se k identifikaci lézí vysokého stupně na děložním hrdle jeví detekce onkogenů E6 a E7, resp. jejich mRNA. Dalším upřesněním vývoje cervikální léze u HR HPV pozitivních žen je stanovení metylace tumorsupresorových genů, které normálně brání rozvoji rakovinného bujení, a jsou v případě metylace deaktivovány.

Závěr:
Screeningové programy, adresné zvaní žen k preventivním gynekologickým prohlídkám zdravotními pojišťovnami a také účelné využití prebioptických a bioptických metod by mělo vést k včasnému záchytu prekanceróz děložního hrdla a následně ke snížení incidence karcinomu děložního hrdla.

Klíčová slova:
prekancerózy a karcinomy děložního hrdla, SIL, kolposkopie, LBC, HPV, metylace, mRNA

ÚVOD

Karcinom děložního hrdla, především dlaždicobuněčný (spinocelulární) karcinom, je jedním z nejčastějších zhoubných nádorů u žen v celosvětovém měřítku. V roce 2012 bylo ve světě diagnostikováno více než 527 000 nových případů a přibližně 265 000 žen zemřelo v souvislosti s tímto onemocněním [36]. Podle údajů Systému pro vizualizaci onkologických dat (SVOD) z roku 2010 byla incidence invazivního karcinomu děložního hrdla v České republice (ČR) 18,53 případů na 100 000 žen a mortalita byla v tomto období 7,16 úmrtí na 100 000 žen. To bylo v absolutních počtech 994 nově diagnostikovaných nádorů a 384 žen v roce 2010 na toto onemocnění zemřelo [35]. Prekancerózy a karcinomy děložního hrdla jsou sdruženy s infekcí vysoce rizikovými lidskými papillomaviry (high risk human papilloma virus – HR HPV). Prekancerózy se dělí na dlaždicové (skvamózní) a žlázové (glandulární). Skvamózní intraepite-liální léze (SIL) rozdělujeme na léze nízkého stupně („low grade“ – LG SIL, LSIL, dříve cervikální intraepiteliální neoplazie I = CIN I) a léze vysokého stupně („high grade“ – HG SIL, HSIL, dříve CIN II, III a karcinom in situ = CIS) [22]. Druhou skupinou jsou glandulární intraepiteliální léze zastoupené adenokarcinomem in situ (AIS). Z maligních epitelových nádorů je nejvíce zastoupen dlaždicobuněčný (spinocelulární) karcinom (60 až80 %). Adenokarcinomy tvoří 10–15 %. Ostatní typy karcinomů jsou vzácné.

Metody, které jsou používány k diagnostice prekanceróz a karcinomu děložního hrdla, je možné rozdělit na dvě hlavní skupiny – metody prebioptické a bioptické. Prebioptické metody jsou neinvazivní techniky signalizující možný přednádorový stav. K nim patří kolposkopické vyšetření, spektroskopie, onkologická cytologie a HPV testace. Diagnóza by měla být potvrzena odběrem tkáně – biopsií.

Se zavedením preventivních programů, především cytologického screeningu (onkologické exfoliativní cytologie), incidence cervikálního karcinomu ve vyspělých zemích klesá. Výsledky onkologické cytologie upřesňuje zavedení HPV testace do screeningových programů [37]. Na začátku roku 2008 zahájilo také Ministerstvo zdravotnictví ČR celorepublikový screeningový program zaměřený na včasný záchyt karcinomu děložního hrdla. Zdravotní pojišťovny v ČR od 1. ledna 2014 zavedly adresné zvaní občanů k preventivním vyšetřením na rakovinu děložního hrdla, prsu, tlustého střeva a konečníku.

S probíhající vakcinací proti lidským papillomavirům (HPV) se očekává další pokles výskytu prekanceróz a karcinomu děložního hrdla [16].

KOLPOSKOPIE

Kolposkopické vyšetření

Dělí se na nativní a rozšířenou kolposkopii. Při nativní kolposkopii je vyšetřovaná oblast pozorována bez podání jakéhokoli roztoku nebo jen po setření tamponem napuštěným ve fyziologickém roztoku. Kolposkopie rozšířená využívá k eliminaci faktorů zhoršujících přehlednost (zejména hlen a krev) aplikaci roztoků, které současně zvýrazní případné změny ve tkáni. Nejčastěji se používá 5% roztok kyseliny octové nebo Lugolův roztok. Kolposkopem jsou patrné povrchové změny sliznice a změny ve tvaru a uspořádání cév. Pro jednotlivé nálezy je zavedeno odborné názvosloví, jehož cílem je popisné vyjádření závažnosti pozorovaných změn [10]. Pro provádění specializovaných kolposkopických vyšetření je nutná funkční licence pro expertní kolposkopii F017. Jejím cílem je definování minimálních standardů pro výkon kolposkopie (např. minimální počet diagnostikovaných HG lézí za rok, požadované technické vybavení apod.).

Cervikografie

Zaznamenání obrazu děložního hrdla fotoaparátem bylo publikováno prof. Štaflem v roce 1981 [29]. Snímky mohla pořídit i školená obsluha, která je předala expertům k vyšetření. Limitací byla nutnost pořízené snímky vyvolávat. Nyní je možné obrazy v reálném čase snímat digitální kamerou, elektronicky distribuovat a archivovat. Studie ukázaly, že senzitivita cervikografie je nižší než senzitivita konvenční onkologické cytologie, specificita je vyšší [29]. Etherington metodu modifikoval na přenos celé pořízené videosekvence [9].

Digitální kolposkopie

Obraz je již při pořízení zpracován a převeden do počítačové podoby stejně jako např. v digitálním fotoaparátu. Kvalitní snímače standardně nabízejí vysoké rozlišení obrazu, které umožní prohlédnout i drobné detaily. Snímky je možné dále zpracovávat (úpravy barev, jasu, kontrastu, digitální korekce obrazu) a zasílat (e-mail, FTP transfer, digitální úložiště, cloudové služby, speciální programy a aplikace) [18]. Telemedicína je elektronický přenos lékařských informací od pacienta k lékaři. Využívá telekomunikačních a informačních technologií. Dálkové datové přenosy se dnes nejčastěji dějí celosvětovou sítí internet s možností šifrování přenosu dat. Pro archivace biomedicínských obrazových informací byl vypracován standard Picture Archiving and Communication System (PACS). Používají ho systémy, které vytváří digitální obrazy (např. ultrazvuky, CT, magnetická rezonance, digitální kolposkopie apod.). Komunikace s těmito archivy informací obvykle probíhá podle protokolu Digital Imaging and Communications in Medicine (DICOM).

SPEKTROSKOPIE

Techniky využívající možností elektromagnetického spektra – infračerveného (700–900 μm), viditelného (400–700 μm) a ultrafialového (315 až 400 μm). Jsou to neinvazivní metody, které pomocí elektromagnetického spektra různých délek studují vlastnosti tkáně [33].

Dynamic Spectral Imaging System (DySIS)

Je to kolposkopické vyšetření s dynamickým spektrálním zobrazením (Dynamic Spectral Imaging = DSI). Zaznamenávají se povrchové změny děložního hrdla po aplikaci kyseliny octové v reálném čase, počítač vytvoří barevné mapování a škála barev vyjadřuje riziko HG léze. Jednotlivé barvy odpovídají rychlosti zbělení po aplikaci kyseliny octové. Podle literárních údajů je senzitivita metody DSI pro detekci HG lézí 79 % a pro konvenční kolsposkopii 55 % [19, 40]. DSI je v detekci HG lézí děložního hrdla citlivější než kolposkopie. Citlivost narůstá, je-li barevné mapování kombinované se standardním kolposkopickým vyšetřením [18, 28] (obr. 1, 2).

LuViva Advanced Cervical Scan

Metoda využívající světlo pro detekci fyzikálních a chemických změn ve tkáních, které mohou být přítomny u cervikálních abnormalit. Systém nevyžaduje vzorek tkáně a nečeká se na laboratorní analýzu [34].

LUMA cervical imaging system

Systém používá vlastností spektroskopie v tkáních in vivo. Účinnost LUMA (MediSpectra, Inc, MA, USA) pro detekce cervikálních lézí, byla prokázána ve dvou prospektivních, randomizovaných studiích. Jeho použití zvýšilo detekci HG lézí o 25 % z cílené biopsie. Americká FDA schválila tento přístroj v březnu 2006 pro zvýšení citlivosti kolposkopických vyšetření u žen s abnormální cervikální cytologií [1, 2, 13].

Optical Coherence Tomography (OCT)

Neinvazivní technika využívající infračerveného světla ke studiu vlastností tkáně (metabolických a strukturálních). Používá se sterilní sonda, která vysílá infračervené světlo a přikládá se na zkoumanou tkáň. Světlo se odráží od mikrostruktur tkání, je zpracováno a vyhodnoceno počítačem. Ten vytvoří dvojrozměrný obraz, analogický jako B-mod ultrazvuků [5, 18].

ONKOLOGICKÁ CYTOLOGIE

Onkologická cytologie zůstává stále základní screeningovou metodou. Cytologické vyšetření je metoda pomocná, nelze z ní určit přesnou diagnózu, pouze ukazuje míru podezření na přednádorové stavy. Může být jak falešně nadhodnocena, tak i podhodnocena. Nynější platná klasifikace k hodnocení onkologické cytologie je The Bethesda systém 2001. Cytolog může navrhnout kontrolu, která by měla být v souladu s aktuálními doporučeními Světové zdravotnické organizace, ale plnou zodpovědnost za další diagnostické či léčebné postupy nese gynekolog [23].

Klasická onkologická cytologie (PAP test, konvenční, exfoliativní cytologie)

Buněčný materiál setřený z děložního hrdla je přenesen na sklo a fixován, označen a spolu s průvodkou je odeslán do cytologické laboratoře k dalšímu zpracování. V laboratoři je stěr dále obarven a následně hodnocen v optickém mikroskopu. První prohlédnutí preparátu provádí cytotechnolog a každý podezřelý nález předá ke zhodnocení lékaři [24, 32].

Cytologie z tekutého média (Liquid Based Cytology – LBC)

LBC je novější technika umožňující odběr vyšetřovaných buněk do tekutého média, které je uvnitř malé nádobky. Preparáty zhotovené metodou LBC jsou přehlednější, s menším počtem artefaktů a buňky jsou na skle rozprostřeny v jedné tenké vrstvě. Díky okamžité a dokonalé fixaci jsou oproti konvenční cytologii lépe zachovány jaderné charakteristiky buněk nezbytné pro exaktní diagnostiku. Největší výhodou je možnost v případě potřeby provést další vyšetření ze stejného vzorku (např. na HPV test, cytoimunohistochemie p16, Ki-67 atd.). Nevýhodou je pak vyšší cena metody. V detekci závažných přednádorových změn je LBC s klasickou cytologií podobná [3, 8, 15].

Počítačová analýza obrazu LBC – ThinPrep Pap test, SurePath Pap

Novinkou v onkologické cytologii je počítačová image analýza LBC stěrů. Počítač naskenuje celé mikroskopické sklo připravené technikou LBC a současně ho hodnotí. U technologie Imaging system (ThinPrep Pap test) jsou označena suspektní zorná pole na sklech (souřadnice x–y) a tato skla jsou dále prohlížena v automatickém mikroskopu cytologem. U metody Focal point processor (SurePath Pap) je použit jiný algoritmus, který vybere skla s negativními nálezy, ostatní jsou předána cytologovi ke klasickému manuálnímu screeningu. Tento systém suspektní buňky na sklech neoznačuje [39].

Biomarkery v onkologické cytologii

K dalšímu zpřesnění prediktivní hodnoty onkologické cytologie se používá detekce biomarkerů pomocí imunocytochemických technik. Využití biomarkerů usnadňuje detekci abnormálních buněk ve stěru. Abnormální buňky jsou zvýrazněny na pozadí normálních, reaktivních nebo jiných nemaligních buněk, prostřednictvím imunocytochemického barvení. Používané biomarkery jsou [7]:

Ki-67 - jaderný marker, detekuje zvýšenou proliferaci buněk, která nastává i při HPV infekci.

p16 INK4a – antionkogen, regulátor buněčného cyklu, jeho hladina výrazně narůstá v HR HPV infikovaných buňkách. Je vysoce senzitivní a specifický marker dysplastických buněk hrdla děložního.

HPV L1 kapsidový protein – je detekovatelný v LG lézích a mizí v HG lézích.

BD ProEx C – je vysoce citlivé a specifické činidlo pro detekci HPV transformovaných buněk, obsahuje protilátky proti jaderným proteinům – minichromosome maintenance protein 2 (MCM 2) a topoisomerase II alpha (TOP2A).

Duální p16/Ki-67 imunocytochemický test je v současnosti k dispozici jako přídatný test ve screeningu karcinomu děložního hrdla (např. CINtec Plus) [7].

HPV TESTACE

Molekulárně genetická detekce lidských papilomavirů identifikuje virovou deoxynukleovou nebo ribonukleovou kyselinu (DNA, RNA). Sleduje se přítomnost 13–14 nejčastějších karcinogenních HR HPV typů (high risk – HR) karcinogenních typů HPV (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68) [27, 31]. Odběr vzorku pro HPV test se provádí pomocí speciálního odběrového setu nebo je možno použít již odebraný materiál z LBC. Zajímavou novinkou je set pro samovyšetření HPV (self test) umožňující jednoduchý odběr vzorku samotnou ženou [14]. Ten je následně zaslán do laboratoře ke stanovení DNA HPV.

HPV testace ve screeningu karcinomu děložního hrdla

K preventivním programům se používají screeningové sety s odpovídající klinickou citlivostí, jejichž charakteristiky byly ověřeny dostatečným počtem studií [21]. V současné době lze využít několik testů – Hybrid Capture 2, Cobas 4800 HPV test, Aptima HPV Assay, EIA kit HPV CP HR, Cervista HPV HR Test, Abbott Real Time High Risk HPV. Liší se použitou metodikou a také částečnou genotypizací nejrizikovějších typů.

Detekce mRNA

Detekce aktivně přepisovaných onkogenů E6 a E7, resp. jejich mRNA má eliminovat přítomnost přechodné, netransformující HPV infekce, kterou často zachytí DNA HPV test [25, 30].

Genotypizace HPV

Je přesné stanovení jednotlivých HPV typů ve vyšetřovaném vzorku. Liší se použitou technologií a spektrem HPV, jež detekují. Velmi často je používána metoda amplifikace Polymerase chain reaction (PCR) – např. LinearArray HPV Genotyping Test, Inno LiPA HPV Genotyping Extra. Další testy používají technologii mikroarray čipů – např. PapilloCheck HPV-Screening Test. Používají se v epidemiologických studiích, v patologických laboratořích u fixovaných i čerstvých bioptických vzorků a k detekci HPV typů nezastoupených ve screeningovém testu.

Metylace tumorsupresorových genů

Dalším upřesněním u HR HPV pozitivních žen se jeví stanovení metylace tumorsupresorových genů [12]. Tyto geny, které normálně brání rozvoji rakovinného bujení, jsou v případě metylace deaktivovány a jejich funkce je potlačena [6, 11]. Identifikuje pacientky s vysokým rizikem dalšího rozvoje prekanceróz a karcinomu děložního hrdla.

BIOPSIE

Vzorek klíšťkové biopsie děložního hrdla by měl být odebírán vždy cíleně pod kolposkopickou kontrolou. U nálezů lokalizovaných endocervikálně je adekvátní metodou odběru k histologické verifikaci diagnostická konizace. Zlatým standardem histologie pak nadále zůstává hematoxylin-eozinový preparát. Použití imunohistochemických technik umožňuje patologům upřesnit a potvrdit diagnózu. Často je diferenciálně diagnosticky rozhodující použití imunohistochemie (např. protein p16, karcinom embryonální antigen (CEA), estrogenové a progesteronové receptory) a molekulárních metod (např. PCR, in situ hybridizace apod.) [21] (obr. 3).

DISKUSE

Kolposkopické vyšetření je jedna z prebioptických technik a používá se pro došetření nálezu při abnormálním výsledku onkologické cytologie. Panel odborníků definoval doporučené postupy pro řešení abnormálních nálezů v ČR ve screeningu cervikálních karcinomů na 12. Bauerově dni v roce 2008 [10]. Kolposkopie není využitelná jako screeningová metoda. Pro provádění specializovaných kolposkopických vyšetření je potřebná funkční licence F017 pro expertní kolposkopii. V zahraničí jsou kolposkopická vyšetření považována za expertní. Digitální kolposkopie má srovnatelné výsledky jako optické kolposkopické vyšetření [13, 26]. Výhodou digitálních snímků uložených v databázi je dostupnost minulých nálezů a možnost tak porovnávat a hodnotit vývoj změn na děložním hrdle v čase. Rozšíření nových spektroskopických technik ve vyspělých zemích bude závislé na cenové dostupnosti jiných, specifičtějších metod (HPV mRNA, metylace, biomarkery). Trend směřuje spíše k využití diagnostiky na molekulární urovni. Naopak v rozvojových zemích, kde jsou možnosti „západního“ screeningu velkým problémem, mohou tyto metody zlepšit jeho dostupnost a snížit incidenci karcinomu děložního hrdla.

Senzitivita klasické cytologie pro diagnostiku HG lézí a karcinomů je v rozmezí 60–90 % v nejlépe organizovaných laboratořích [38]. V detekci závažných přednádorových změn jsou si ale LBC s klasickou cytologií podobné [3, 8, 15]. Při použití LBC je možné doplnit další vyšetření ze stejného vzorku (např. HPV test, cytoimunohistochemie p16, ostatní biomarkery apod.). Nevýhodou je pak vyšší cena metody. Novinkou v cytologii je počítačová analýza obrazu LBC (Imaging system u ThinPrep Pap testu a Focal point processor u SurePath Pap). Podle některých studií mají vyšší senzitivitu v detekci HG lézí než klasická nebo LBC cytologie [20]. Nevýhodou je opět vysoká cena celého systému.

Zavedení HPV testace do screeningových postupů v ČR dále zvýší citlivost screeningu a umožní prodloužit interval kontrol u HR HPV negativních žen s negativní cytologií na minimálně 3 roky. Ve vyspělých zemích je HPV testace již nyní součástí doporučených postupů ve screeningu karcinomu děložního hrdla (Anglie, Finsko, Norsko, USA a jiné). Senzitivita u žen nad 30 let ve spojení s HPV testací stoupá nad 95 % [23, 37].

Specifita detekce mRNA HPV je signifikantně vyšší ve srovnání s DNA HPV testy, např. Aptima HPV Assay má pro identifikaci lézí vysokého stupně u žen s abnormálním cytologickým nálezem citlivost 35,3 % a specifitu 28,8 % [25, 30]. Citlivost genotypizačních testů je vysoká, proto nejsou doporučovány pro preventivní programy [17]. Stanovení metylace tumorsupresorových genů u HR HPV pozitivních žen predikuje reálné riziko rozvoje neoplastických změn, a tím může omezit nadbytečné invazivní výkony u pacientek s perzistentní infekcí [12].

ZÁVĚR

Incidence invazivního karcinomu děložního hrdla v ČR v porovnání s ostatními vyspělými zeměmi EU je nadále vysoká. Velkým pokrokem v posledních letech bylo zavedení screeningových programů, akreditace cytologických laboratoří a od roku 2014 i dlouho očekávané adresné zvaní žen k preventivním gynekologickým prohlídkám zdravotními pojišťovnami. Další možností, jak snižovat výskyt těchto chorob, je plošná profylaktická vakcinace dívek proti HPV. Z možností jak dále zvýšit senzitivitu screeningu je zavedení HR HPV testace nebo duální p16/Ki-67 imunocytochemický test v onkologické cytologii. Účelné využití prebioptických a bioptických metod by mělo vést k včasnému záchytu prekanceróz děložního hrdla a následně i ke snížení incidence karcinomu děložního hrdla.

MUDr. Leopold Rotter

Reprofit International s.r.o.

Hlinky 122/48

602 00 Brno

e-mail.: leopold.rotter@reprofit.cz