Management metabolických nežádoucích účinků everolimu u pacientů s renálním karcinomem

Souhrn

Everolimus je podáván pacientům s metastatickým renálním karcinomem v dávce 10 mg/den nebo v redukované dávce 5 mg/den při výskytu nežádoucích účinků. Mezi ně patří zejména metabolické nežádoucí účinky, mukozitida, anorexie nebo neinfekční pneumonitida, jež vedou ke zvýšení morbidity a zhoršení kvality života nemocného. Cílem práce bylo zhodnocení podávání fenofibrátu a metforminu při výskytu hypertriglyceridemie a hyperglykemie navozené everolimem.

Literární rešerše byla zaměřena na roli mTOR v lipidovém a glukózovém metabolismu. Bylo provedeno zhodnocení zařazení fenofibrátu a metforminu do doporučených postupů k řešení metabolických nežádoucích účinků spojených s podáváním everolimu u pacientů s metastatickým renálním karcinomem. Fenofibrát, metformin a everolimus se překrývají v některých účincích na intracelulární úrovni. Vzhledem k tomu může být účinek fenofibrátu a metforminu při léčbě metabolických nežádoucích účinků vyvolaných everolimem u pacientů s metastatickým renálním karcinomem omezený. Stav, kdy se projeví metabolické nežádoucí účinky při terapii everolimem, není totožný s metabolickým syndromem nebo diabetem 2. typu u běžné populace.

V managementu hypertriglyceridemie a hyperglykemie navozené everolimem mají své místo kromě monitorování plazmatických hladin everolimu také fenofibrát a metformin, vzhledem k patofyziologii těchto nežádoucích účinků ovšem může být jejich efekt limitovaný.

Klíčová slova:

everolimus – metabolické nežádoucí účinky – fenofibrát – renální karcinom.

ÚVOD

Karcinom ledviny je nejčastějším primárním nádorem ledviny mimo ledvinnou pánvičku. Jeho výskyt v posledních 10 letech ve vyspělých zemích světa roste pomalým, ale stabilním tempem. 5leté přežití u pacientů s metastatickým renálním karcinomem (mRCC) činí pouze 5–15 % (1). Nejčastějším histologickým typem RCC je světlobuněčný karcinom, u 25 % pacientů je diagnostikován histologicky jiný typ.

Everolimus, analog rapamycinu, má antiproliferativní účinek, kterého se využívá nejen v transplantologii ke snížení proliferace lymfocytů, ale také v onkologii k ovlivnění proliferace nádorových buněk. V březnu 2009 americký Úřad pro kontrolu léčiv a potravin (FDA) schválil everolimus pro léčbu mRCC, který progredoval při terapii inhibitorem tyrosinkinázy.

Everolimus stejně jako ostatní inhibitory mTOR (savčího rapamycinového cílového receptoru) vykazuje závažné vedlejší účinky. Ve studiích fáze III hodnotících everolimus u mRCC byla hypercholesterolemie, hypertriglyceridemie a hyperglykemie hlášena významně častěji u skupin léčených everolimem než ve skupinách s placebem (2). Incidence metabolických nežádoucích příhod u pacientů s mRCC zaznamenaných ve studiích fáze III byla následující: hypercholesterolemie 76 %, hypertriglyceridemie 71 %, hyperglykemie 57 % (3–5). Většina těchto nežádoucích příhod byla mírných, tedy stupně závažnosti 1–2 dle klasifikace CTCAE (Common Terminology Criteria for Adverse Events) a může být řešena snížením dávky, případně podpůrnou terapií. Závažnější nežádoucí příhody stupně 3–4 vedou k přerušení či ukončení léčby.

Ovlivnění lipidového a glukózového metabolismu everolimem je velmi komplexní a doporučené postupy k jejich řešení zahrnují také podávání fenofibrátu a metforminu, tedy léčiv primárně určených pro pacienty s metabolickým syndromem a diabetem 2. typu, nikoli s mRCC.

Cílem práce bylo zhodnocení potenciálu fenofibrátu a metforminu v řešení metabolických nežádoucích účinků everolimu u pacientů s mRCC.

METODIKA

Byla provedena literární rešerše zaměřená na roli mTOR v lipidovém a glukózovém metabolismu. Na základě vybraných klíčových slov (mTOR, everolimus, lipid metabolism, glucose metabolism, fenofibrate, metformin, PPAR, adverse event) byly v databázi PubMed vyhledány články vztahující se k dané problematice a prostudovány jejich fulltexty. Zaměřily jsme se na kritické zhodnocení současných doporučených postupů k řešení metabolických nežádoucích účinků everolimu u pacientů s mRCC a na vhodnost použití fenofibrátu a metforminu v těchto případech.

VÝSLEDNÁ ZJIŠTĚNÍ

Místo mTOR v lipidovém metabolismu

Lipidy jsou důležité strukturální molekuly, které tvoří podstatnou část plazmatických membrán a subcelulárních organel, působí jako signalizační molekuly jak v buňce (fosfoinositidy), tak na úrovni celého organismu (např. steroidní hormony), jsou důležitým zdrojem energie hlavně ve formě triglyceridů (TAG) uložených v adipocytech a jsou alternativou glukózy v katabolickém metabolismu. Důležitým rysem metabolismu nádorových buněk je zvýšení syntézy lipidů, které jsou mimo jiné důležité pro dostatečnou tvorbu jejich membrán (6, 7).

mTORC1 (mTOR komplex 1) kontroluje lipidový metabolismus na několika úrovních. Regulovány jsou lipogeneze, adipogeneze, transport lipidů a jejich ukládání do tukové tkáně, dále je jím kontrolována lipolýza, β-oxidace mastných kyselin a ketogeneze (8) (viz obr. 1).

Po jídle dochází v organismu ke zvýšení plazmatických hladin glukózy a inzulinu, který ovlivněním membránových receptorů vede k aktivaci hlavní intracelulární dráhy PI3K/Akt/mTORC1 a následné regulaci dvou klíčových efektorů této dráhy: S6K (ribosomová p70S6 kináza) a eIF4E (eukaryotický iniciační faktor 4E) (6, 7). mTORC1 také reguluje aktivitu fosfatázy lipinu 1 a některých transkripčních faktorů, například PPARα a PPARγ (α a γ receptory aktivované proliferátory peroxisomů) zapojených do lipidového metabolismu; jejich funkce bude podrobněji vysvětlena dále.

Aktivace mTORC1, ke které přechodně dochází po jídle, vede k přesunu glukózy do tukových zásob, základem tohoto procesu je tedy stimulace anabolických pochodů, jakými jsou lipogeneze, adipogeneze, transport lipidů a jejich ukládání do tukové tkáně. Naopak je tlumena lipolýza, β-oxidace mastných kyselin a ketogeneze (obr. 1).

Lipogeneze

Studie ukazují, že aktivace mTORC1 podporuje lipogenezi prostřednictvím regulace transkripčních faktorů – SREBP (proteinu vážícího se na sterol‑regulující element), jež regulují homeostázu lipidů kontrolou exprese genů důležitých pro syntézu cholesterolu, mastných kyselin, triglyceridů a fosfolipidů (9) (obr. 2). SREBP jsou umístěny ve vázané formě v membráně endoplazmatického retikula, jejich uvolnění a štěpení je iniciováno buď nízkou hladinou sterolu v buňce (SREBP-2), nebo inzulinem (SREBP-1c) (6, 7).

Aktivace mTORC1 zvyšuje transkripční aktivitu SREBP indukcí jejich translokace z membrány endoplazmatického retikula do Golgiho aparátu a rozštěpením, po kterém následuje uvolnění a přemístění jejich zralé formy do jádra, kde regulují genovou expresi. Za podmínek nízké mTOR aktivity se v jádře kumuluje fosfatáza lipin 1, která podporuje spojení SREBP s jadernou matrix, a oslabuje tak jejich schopnost vázat se s cílovými geny. Tento efekt je pak blokován aktivací mTORC1, která lipin 1 fosforyluje (6, 7).

Výsledkem aktivace mTORC1 a následného ovlivnění SREBP-1c je exprese enzymů, jež jsou zapojené do lipogeneze – ACC (acetyl-CoA karboxyláza), FAS (syntáza mastných kyselin), SCD (stearoyl-CoA desaturáza) a HMGCR (hydroxymethylglutaryl-CoA reduktáza) (8). Oslabení aktivity mTORC1 rapamycinem blokuje SREBP-1c indukovanou expresi lipogenetických enzymů (2).

Adipogeneze

Závislost adipogeneze na aktivaci mTOR ukazují obr. 3 a 4 (8). Tento biologický proces vede k tvorbě zralých adipocytů z mezenchymových kmenových buněk, prekurzorů tukových buněk, a je řízen prostřednictvím transkripčních faktorů – C/EBP (CAAT/enhancer vázající protein) a PPARγ. Transkripční faktory C/EBPβ a C/EBPδ ovlivňují klonální expanzi preadipocytů, C/EBPα a PPARγ pak terminální diferenciaci a vznik adipocytů (8). Fosforylace 4EBP (eukaryotického iniciačního faktoru 4E [eIF4E] vázajícího protein), tedy inhibice vazby a následné uvolnění eIF4E, vede ke zvýšení translace C/EBPα a indukci exprese PPARγ (6, 7). Při léčbě rapamycinem dochází v různých modelech buněčných kultur k blokádě adipogeneze (6, 7).

Transport lipidů a jejich ukládání do tukové tkáně

TAG a cholesterol syntetizované v játrech jsou s apoproteiny uvolňovány do oběhu ve formě lipoproteinů o velmi nízké hustotě (VLDL). mTORC1 se podílí na kontrole extracelulární lipoproteinové lipázy (LPL), ve vodě rozpustné lipázy přítomné v plazmě a na povrchu endotelových buněk, a to především ve svalové a tukové tkáni. Inzulin zvyšuje její aktivitu, zatímco rapamycin ji naopak snižuje (2). LPL hydrolyzuje TAG v cirkulujících VLDL a podporuje konverzi na intermediální lipoproteiny (IDL) a lipoproteiny o nízké hustotě (LDL), což usnadňuje vychytávání lipoproteinů v tkáních (8).

Aktivace mTORC1 vede ke zvýšení exprese receptorů pro LDL (LDLR) (2). U pacientů po transplantaci ledviny na terapii sirolimem byl popsán 68% pokles LDL katabolismu (2).

Lipolýza a β-oxidace mastných kyselin

Přestože molekulární mechanismy regulace lipolýzy nejsou plně objasněny, bylo zjištěno, že aktivovaná mTORC1 blokuje v adipocytech a hepatocytech lipolýzu a β-oxidaci mastných kyselin a přispívá k ukládání TAG uvolněných jednak z jater, jednak vyrobených de novo v adipocytech (8). V těchto situacích je blokována aktivita ATGL (adipózní triacylglycerolové lipázy), která v adipocytech katalyzuje lipolýzu triglyceridů na diacylglyceridy (DAG), a také aktivita HSL (hormon-sensitivní lipázy), jež převádí DAG na monoacylglyceroly (8). In vitro studie ukázaly, že inhibice mTOR rapamycinem zvyšuje β-oxidaci mastných kyselin v hepatocytech a kosterních svalech (2). U pacientů po transplantaci ledviny indukuje léčba sirolimem zvýšení volných mastných kyselin o 42 %, což svědčí o jejich uvolňování z tukové tkáně v důsledku snížení inhibice HSL (2).

Ketogeneze

Ketolátky (acetoacetát, β-hydroxybutyrát) jsou při hladovění využívány srdečním a příčně pruhovaným svalem i mozkem jako energetický substrát. Zdá se, že aktivace mTORC1 vede k potlačení exprese enzymů zapojených do procesu ketogeneze regulací nCoR1 (jaderného receptoru korepresoru 1) a PPARα způsobem, který je pravděpodobně závislý na S6K2 (viz obr. 5). Tyto inhibiční účinky na PPARα a jejich transkripční cíle, jako jsou ACOX1 (acyl-CoA oxidáza 1), CPT (karnitinpalmitoyltransferáza), ACADM (gen pro acyl-CoA dehydrogenázu mastných kyselin se středně dlouhým řetězcem) a další, mohou vysvětlit negativní regulaci oxidace mastných kyselin. Represe β-oxidace a ketogeneze pravděpodobně působí společně se stimulací lipogeneze a s podporou toku acetyl-CoA směrem k syntéze a ukládání lipidů (8).

Zařazení fibrátů do managementu nežádoucích účinků everolimu

Pacienti užívající inhibitory mTOR mají být monitorováni z důvodu možného výskytu nebo zhoršení hyperlipidemie. Pokud se objeví, doporučují se úprava stravy, cvičení a léčiva snižující hladinu lipidů. Podávání fibrátů je zařazeno do současných doporučených postupů k řešení triglyceridemie, která je spojována s terapií everolimem (viz tab. 1). Zařazení fibrátů do těchto postupů vychází z jejich komplexního a pozitivního ovlivnění lipidového spektra u pacientů s metabolickým syndromem a diabetem 2. typu. Přesný mechanismus účinku fenofibrátu však není dosud plně objasněn.

PPAR jsou specifické receptory v buněčném jádře, mají funkci transkripčních faktorů a regulují expresi některých genů zasahujících do metabolismu lipidů a lipoproteinů.

PPARα jsou aktivovány mastnými kyselinami a fibráty, výsledkem této aktivace je řada metabolických efektů:

1. Útlum syntézy apoproteinu CIII, který je inhibitorem LPL zodpovědné za odbourávání VLDL. Výsledkem je urychlený proces degradace VLDL a snížení koncentrace triglyceridů.
2. Zvýšená syntéza LPL, která je lokalizována v krevních kapilárách hlavně svalové a tukové tkáně. Výsledkem je zrychlené odbourávání VLDL v krvi.
3. Syntéza menších částic VLDL s menším obsahem apoproteinu CIII a triglyceridů.
4. Zahájení procesu zpětného transportu cholesterolu z periferních tkání, exprese apoproteinu AI, základem částic HDL, které na sebe v krvi váží volný cholesterol.
5. Aktivace genu pro zvýšení syntézy transportéru, který zprostředkuje přenos cholesterolu z nitra buněk periferních tkání přes buněčnou membránu a jeho navázání na částice nesoucí apoprotein AI (na částice HDL).
6. Aktivace genu pro receptor, který na povrchu hepatocytů váže částce HDL nesoucího cholesterol z periferních tkání (10, 11).

Všechny tyto účinky fibrátů se velmi dobře uplatní především u nemocných s metabolickým syndromem, pro něž je charakteristická tzv. lipidová triáda – zvýšená hladina triglyceridů, nízká koncentrace HDL a zvýšená tvorba malých aterogenních LDL.

V poslední době se ukázalo, že hladina PPARα a jejich transkripční aktivita je blokována aktivitou mTORC1 (12). V jaterních buňkách byla u myší nalačno pozorována velmi nízká aktivita mTORC1 ve srovnání se stavem po jídle, ale současně byla přítomná vysoká hladina PPARα a vysoká exprese jejich cílových genů (12). Vysoká hladina PPARγ a vysoká exprese jejich cílových genů je naopak spojována s vysokou aktivitou mTORC1 (12). Afinitu k PPARγ mají některé thiazolidindiony (glitazony), především pioglitazon, který ovlivňuje jak PPARγ, tak PPARα. Inhibicí mTORC1 dochází ke zvýšení hladiny PPARα a jejich transkripční aktivity, podobně působí fibráty – výsledkem je aktivace oxidace mastných kyselin a ketogeneze. Aktivace PPARα podněcuje fosforylaci AMPK, její aktivace vede k inhibici mTORC1 (11, 13). Rozdílné ovlivnění PPARα a PPARγ aktivovanou mTORC1 a začlenění fibrátů do tohoto procesu ukazuje obr. 6.

Je popisováno, že aktivace PPARα podněcuje fosforylaci AMP-dependentní proteinkinázy (AMPK), což u myší vede v jádře ke zvýšení hladiny transkripčních faktorů FOXO1 (forkhead box, podskupina „O“) a ke zvýšení exprese ATGL, klíčové lipázy, která hydrolyzuje TAG (13), což je podobný stav jako při terapii inhibitory mTOR.

Místo mTOR v metabolismu glukózy

Vliv mTORC1 na homeostázu glukózy je komplexní. V normálních buňkách je po stimulaci dráhy PI3K/Akt/mTORC1 růstovými faktory podporován anabolický program zahrnující zvýšenou glykolýzu a syntézu mastných kyselin, mezi regulační prvky patří i hypoxií indukovatelný faktor 1 (HIF-1) a SREBP (8) (viz obr. 7).

Při normálním příjmu potravy je aktivace mTORC1 v metabolických tkáních přechodná, ale za podmínek nadměrného příjmu energie u obezity a diabetu 2. typu může být chronicky zvýšená, pravděpodobně v podmínkách hyperglykemie a hyperinzulinemie dochází k rozvoji inzulinové rezistence (8). Předpokládá se, že vztah mezi aktivitou mTORC1 a senzitivitou tkání k inzulinu pravděpodobně sleduje křivku ve tvaru obráceného písmene U, kde příliš malá nebo příliš vysoká aktivita mTORC1 vede k inzulinové rezistenci (2) (viz obr. 8). V játrech vede fosforylace serinu IRS (substrát inzulinového receptoru) zprostředkovaná S6K1 k oslabení metabolické cesty PI3K/Akt, a tím podporuje glukoneogenezi (2). Aktivace mTORC1 v β-buňkách zvyšuje sekreci inzulinu a snižuje hladinu glukózy v krvi, trvalá aktivace mTORC1 v β-buňkách vede v konečném důsledku k vyčerpání jejich kapacity (2).

Zařazení metforminu do managementu nežádoucích účinků everolimu

V roce 2012 Americká diabetologická asociace a Evropská asociace pro studium diabetu poskytly praktické pokyny pro management diabetu 2. typu. Ačkoli tato doporučení nejsou přímo adresována pro diabetes mellitus, který se nově objevil u pacientů léčených inhibitory mTOR z důvodu nádoru nebo transplantace, strategie managementu je podobná pro všechny příčiny cukrovky (5). Jestliže se hyperglykemie vyvine i přes úpravu životosprávy, je jako 1. linie obvykle doporučován metformin (viz tab. 2). Avšak metformin je kontraindikovaný u pacientů s renální insuficiencí (odhadovaná glomerulární filtrace < 60 ml/min), s významným oslabením jaterních funkcí a u stavů, při kterých dochází ke snížení tkáňové perfuze (např. infarkt myokardu či sepse) (5).

Metformin u pacientů s diabetem 2. typu zlepšuje homeostázu glukózy částečně inhibicí mTORC1 (5) a dále ovlivněním (zvýšením) intracelulární hladiny adenosinmonofosfátu (AMP), což vede k aktivaci AMPK a inhibici glukoneogeneze (blíže obr. 9).

DISKUSE

Metabolické nežádoucí účinky everolimu se vyskytují relativně často. Je ovlivněn jak lipidový, tak glukózový metabolismus. Patofyziologie dyslipidemie, hyperglykemie a inzulinové rezistence, jež vznikly v důsledku podávání mTOR inhibitorů, je odlišná od patofyziologie hyperlipidemie a inzulinové rezistence, které jsou důsledkem metabolického syndromu nebo provázejí diabetes 2. typu (2).

Doporučené postupy pracují s mírněním symptomů pomocí režimových opatření, použitím konkomitantní farmakoterapie a úpravou dávky everolimu, ale bez znalosti jeho plazmatických koncentrací dosahovaných u konkrétního pacienta. Dyslipidemie, jež vznikla při terapii everolimem, je důsledkem inhibice mTORC1, a tedy odblokování na ni navazující lipolýzy a β-oxidace mastných kyselin, a zvýšené aktivity PPARα (13). Inhibice mTORC1 vede také k zablokování aktivity transkripčních faktorů SREBP a k negativní regulaci lipogeneze a adipogeneze (6). Současně je výrazně snížená periferní clearance lipidů (2).

V doporučených postupech je u hypertriglyceridemie navozené everolimem léčivem volby fenofibrát (14), který působí jako agonista PPARα. V dalších studiích je třeba odpovědět na otázku, jak se uplatní efekt fenofibrátu a jím navozená aktivace PPARα, pokud již dochází k aktivaci těchto receptorů v důsledku inhibice mTOR everolimem, nebo zda se na ovlivnění hyperlipidemie fenofibrátem podílejí ještě další mechanismy účinku.

U metabolického syndromu a diabetu 2. typu je pozorována inzulinová rezistence, která je důsledkem nadměrné trvalé aktivace mTORC1 (2). Patofyziologie hyperglykemie, jež vzniká při terapii everolimem, je naopak důsledkem inhibice mTORC1, tedy aktivace glukoneogeneze a snížení sekrece inzulinu (2, 9). Metformin také inhibuje mTORC1, ale má další účinky na ní nezávislé – jedním z nich je inhibice glukoneogeneze (15). Z výše uvedeného vyplývá, že – při respektování kontraindikací – metformin patří do doporučených postupů k řešení hyperglykemie navozené everolimem.

Je třeba mít na paměti dvě skutečnosti: Zaprvé se everolimus s fenofibrátem a metforminem alespoň částečně překrývají ve svých farmakodynamických účincích, v inhibici mTORC1, proto může být jejich efekt u dyslipidemie a hyperglykemie způsobené everolimem limitovaný a může mít jiný dopad než u metabolického syndromu nebo diabetu 2. typu. Zadruhé pacienti s mRCC mohou, ale také nemusejí současně trpět metabolickým syndromem nebo diabetem 2. typu, a tudíž mohou, ale také nemusejí chronicky užívat metformin a/nebo fenofibrát. Everolimus pak může mít u těchto populací odlišný dopad na lipidový a glukózový metabolismus.

Monitorování koncentrací everolimu se rutinně používá ke zlepšení účinnosti a bezpečnosti terapie v transplantologii a je třeba říci, že podobný přístup by byl žádoucí i v onkologii (16).

Měření plazmatických koncentrací everolimu u pacientů s mRCC by mohlo být vhodné jako součást správného managementu nežádoucích účinků.

Podání metforminu a fenofibrátu při výskytu hyperglykemie a hypertriglyceridemie – při respektování jejich kontraindikací – je možné, jen mohou mít vzhledem k částečně společnému farmakodynamickému účinku s everolimem limitovaný efekt.

Prohlášení o střetu zájmů

Prohlašujeme, že nám nejsou známy žádné střety zájmů spojené s touto publikací a že nedošlo k žádné finanční podpoře, která by mohla ovlivnit její výsledek.

Seznam použitých zkratek

• 4EBP   eukaryotický iniciační faktor 4E (eIF4E) vázající protein
• ACADM  gen pro acyl-CoA dehydrogenázu mastných kyselin se středně dlouhým řetězcem
• ACC    acetyl-CoA karboxyláza
• ACOX1   acyl-CoA oxidáza 1
• AHA   American Heart Association
• AKT    proteinkináza B
• AMP   adenosinmonofosfát
• AMPK AMP-dependentní proteinkináza
• ATGL adipózní triacylglycerolová lipáza
• ATP    adenosintrifosfát
• C/EBP CAAT/enhancer vázající protein
• CPT     karnitinpalmitoyltransferáza
• CTCAE  Common Terminology Criteria for Adverse Events
• DAG   diacylglyceridy
• eIF4E  eukaryotický iniciační faktor 4E
• FAS     syntáza mastných kyselin
• FDA    Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (Food and Drug Administration)
• FOXO forkhead box, podskupina „O“
• HIF-1  hypoxií indukovatelný faktor 1
• HMG   hydroxymethylglutaryl
• HMGCR hydroxymethylglutaryl-CoA reduktáza
• HMGCS hydroxymethylglutaryl-CoA syntáza
• HSL     hormon-senzitivní lipáza
• CH      cholesterol
• IDL     intermediální lipoproteiny
• IRS      substrát inzulinového receptoru
• LDL    lipoproteiny o nízké hustotě
• LDLR  receptor pro LDL
• LPL     lipoproteinová lipáza
• mRCC metastatický renální karcinom
• mTOR savčí rapamycinový cílový receptor (mammalian target of rapamycin)
• mTORC komplex mTOR
• nCoR1 jaderný receptor korepresor 1
• PI3K    fosfatidylinositol-3-kináza
• PPAR  receptor aktivovaný proliferátory peroxisomů
• Raptor regulační protein asociovaný s mTOR
• Rheb   obohacený homolog Ras v mozku
• S6K     ribosomová p70S6 kináza
• SCD    stearoyl-CoA desaturáza
• SREBP protein vážící se na sterol-regulující element (sterol regulatory element binding protein)
• TAG    triglyceridy
• TSC     komplex tuberózní sklerózy
• VLDL  lipoproteiny o velmi nízké hustotě

Adresa pro korespondenci:

PharmDr. Jana Gregorová

Oddělení klinické farmacie

Nemocnice Na Bulovce

Budínova 67/2, 180 81  Praha

Tel.: 266 084 104

e-mail: jana.gregorova@bulovka.cz