Vyhledávání genetických variant u trombofilních stavů

Searching for genetic variants associated with thrombophilia

Thrombotic states are inherited or acquired predisposition for thrombosis in the human vascular system. Nowadays Leiden mutation and mutation in prothrombin G20210A contributing to congenital thrombophilia are routinely tested. These mutations have a high prevalence in the population. Congenital deficiencies of protein S, protein C and antithrombin III are rare thrombophilia with lower population frequency, but higher risk of thromboembolic event. The genetic causes are mutations in the genes, which encode these proteins.

The choice of proper molecular genetic testing depends on the difference in the detection of well-known single nucleotide polymorphism or unknown/rare variant. For the detection of causative variant FV Leiden and prothrombin G20210A are mostly used PCR-RFLP, reverse Strip Assay^®, allele-specific PCR, TaqMan real-time PCR and SNaPshot^®. Precise patient selection should precede the genetic testing of rare variants in anticoagulant proteins. It is appropriate to use methodology of massive parallel sequencing supplemented by a methodology for the detection of larger gene rearrangements – MLPA. We are successfully employing this approach in our institute. This methodology is faster with larger analytic capacity compared to commonly used direct sequencing by Sanger method.

Keywords:

thrombophilia – FV Leiden – prothrombin G20210A – protein S deficiency – Protein C deficiency – antithrombin III deficiency – molecular genetic testing

Autoři: Petr Vrtěl ¹; Luděk Slavík ²; Radek Vodička ¹; Martin Procházka ¹; Jana Procházková ²; Radek Vrtěl ¹; Jana Úlehlová ²; Peter Rohoň ¹; Júlia Štellmachová ¹
Působiště autorů: Ústav lékařské genetiky LF UP a FN Olomouc ¹; Hematoonkologická klinika LF UP a FN Olomouc ²
Vyšlo v časopise: Čas. Lék. čes. 2019; 158: 28-32
Kategorie: Přehledový článek

Souhrn

Trombofilní stavy představují vrozenou nebo získanou predispozici vzniku trombózy v cévním řečišti. Mezi rutinně vyšetřované vrozené trombofilie patří v populaci vysoce frekventní leidenská mutace a mutace v genu protrombinu G20210A. Vrozený deficit antikoagulačních proteinů (proteinu S, proteinu C a antitrombinu III) patří mezi vzácné trombofilie s nižší populační frekvencí, ale vyšším relativním rizikem tromboembolické příhody a je způsobený mutacemi v genech kódujících tyto proteiny.

Postup molekulárně genetické analýzy závisí na skutečnosti, zda se jedná o vyhledávání známé, nebo neznámé, případně vzácné varianty. U známých kauzálních variant FV Leiden a protrombinu G20210A využíváme k jejich zachycení běžně metody PCR-RFLP, reverzní Strip Assay^®, alelově-specifickou PCR, TaqMan real-time PCR a SNaPshot^®. Genetickému testování vzácných variant v antikoagulačních proteinech předchází precizní selekce pacientů. Vhodné je využití metodiky masivního paralelního sekvenování doplněné vyhledáváním větších genových přestaveb metodou MLPA. Tento postup je úspěšně aplikován na našem pracovišti a ve srovnání s běžně užívanou Sangerovou sekvenační metodou nabízí rychlejší odezvu a větší analytickou kapacitu.

Klíčová slova:

trombofilie – FV Leiden – protrombin G20210A – deficit proteinu S – deficit proteinu C – deficit antitrombinu III – molekulárně genetické vyšetření

ÚVOD

Podstatou tromboembolického onemocnění je nežádoucí tvorba trombu (krevní sraženiny) v cévním řečišti, kde vzniká obstrukce. Výskyt trombózy je obvykle lokalizován do oblasti hlubokých žil dolních končetin. Závažný problém může nastat, když se uvolněná krevní sraženina – embolus – dostane do arteria pulmonaris nebo jedné z jejích větví, kde obstrukcí způsobí plicní embolii, jež může mít pro pacienta fatální následky.

Trombóza je běžným patologickým stavem, který je základem ischemické choroby srdeční, ischemické cévní mozkové příhody a žilního tromboembolismu. Na následky této skupiny onemocnění zemřelo v roce 2010 na světě 12,9 milionu lidí, což odpovídá každému čtvrtému úmrtí (1).

Nástup tromboembolického stavu má multifaktoriální podstatu, přičemž dědičná komponenta je stanovena až na 60 % (u selektovaných pacientů do 45 let a manifestací tromboembolické nemoci) (2). Trombózu mohou indukovat vnější faktory, mezi něž řadíme operační zákroky, imobilizace, těhotenství, užívání orálních kontraceptiv, věk a nádorová onemocnění.

Vrozené trombofilie jsou hyperkoagulační stavy, které jsou geneticky podmíněným sklonem k trombóze. Mezi genetické faktory zvyšující riziko nástupu trombózy jsou řazeny jednonukleotidové polymorfismy (SNP) faktoru V (FV) Leiden a FII protrombin G20210A, které v populaci vykazují vysokou incidenci.

Mezi vrozené trombofilie řadíme také klinicky závažné deficity proteinu S (PSD), proteinu C (PCD) a antitrombinu III (ATD). Tyto deficience mohou mít vrozenou příčinu ve formě vzácných mutací příslušných genů PROS1, PROC a SERPINC1, které tyto proteiny kódují (3–7). Mutace v těchto genech nevykazují takovou prevalenci v populaci jako varianty FV Leiden a FII protrombin, ale predisponují svého nositele ke stejnému či vyššímu riziku vzniku tromboembolické události.

Pro vyhledávání trombofilních mutací se používají techniky určené k vyhledávání známých polymorfismů nebo vzácné varianty s neznámým místem výskytu uvnitř suspektního genu.

Celá problematika je klinicky významná z důvodu včasné profylaxe nositelů trombofilních mutací zejména v rizikových situacích (8, 9). Objasnění molekulárně genetické příčiny onemocnění u probanda může vést ke stanovení vhodné prevence žilní trombózy (VTE) v rodině s výskytem vrozené trombofilie.

ETIOLOGIE A RIZIKOVÉ FAKTORY VROZENÝCH TROMBOFILIÍ

Faktor V Leiden

Rezistence FV proti inaktivaci aktivovaným proteinem C (APC) je hlavní vrozenou příčinou trombózy. Je způsobená bodovou mutací FV Leiden v genu pro FV, která vede k záměně aminokyseliny arginin v pozici 506 za aminokyselinu glutamin (3). Tato změna vede ke ztrátě místa štěpení a snížení citlivosti na APC. Polymorfismus FV Leiden způsobuje nárůst rizika VTE v důsledku zvýšení tvorby trombinu (3, 10).

V případě heterozygozity pro FV Leiden je riziko trombózy 2–8× vyšší oproti běžné populaci. Mutace v homozygotním stavu představuji 80× vyšší riziko vzniku VTE (11, 12). U bílé populace se frekvence varianty FV Leiden pohybuje mezi 2 a 15 % (13, 14).

Protrombin G20210A

Druhou nejčastější příčinou tromboembolické nemoci je mutace genu protrombinu G20210A. Její podstatou je nukleotidová tranzice guanin za adenin na pozici 20210, která se nachází ve 3´ nepřepisované oblasti genu F2, který kóduje protrombin. Mutace nevede ke změně struktury molekuly, ale ke zvýšení hladiny protrombinu v krevní plazmě (3).

Přítomnost varianty protrombinu G20210A znamená pro pacienta až 3,8× vyšší celoživotní riziko nástupu VTE oproti v obecné populaci (12, 15, 16). Prevalence této varianty se u bělošské populace pohybuje mezi 2 a 3 % (14, 17).

Protein S (PS)

Jedná se o vitamin K-dependentní plazmatický protein, který je kódovaný genem PROS1 a nejčastěji je exprimován v játrech a srdci. Nachází se v chromosomové oblasti 3q11.1.

V lidském těle se vyskytuje ze 40 % jako volný (schopný vytvořit aktivní komplex s proteinem C) a ze 60 % vázaný na β-řetězec C4b vazebného proteinu (18). Jeho hlavní biologická funkce je kofaktorová, nejedná se o serinovou proteázu. Působí jako enhancer pro APC při štěpení FV. Protein S má také na APC nezávislou antikoagulační úlohu, kdy přímo inhibuje protrombinázový a pravděpodobně také Xázové komplexy. PS pravděpodobně neváže pouze fosfolipidy s vysokou afinitou, ale také prokoagulační faktory Va, Xa a VIIIa. Limitace těchto vazebných míst na fosfolipidové membráně v úvodu koagulace naznačují, že tyto vazby s PS představují jeho APC nezávislou antikoagulační aktivitu (5).

Vrozený PSD je považován za autosomálně dominantní onemocnění s redukovanou penetrancí a variabilními expresivitou. PSD vykazuje v evropské populaci frekvenci 0,5 % (5). Riziko tromboembolické příhody pro pacienty s PSD je dle různých autorů 5,4–10× vyšší než u běžné populace (5, 12, 19). V současné době je známo 420 kauzálních mutací u vrozeného PSD (viz www.hgmd.cf.ac.uk).

Pro molekulárně genetickou analýzu je značnou komplikací přítomnost pseudogenu PROS2, který je netranskribovaným homologem genu PROS1 (4).

Protein C

Tento vitamin K-dependentní plazmatický protein je kódován genem PROC, jeho syntéza probíhá především v játrech a minoritně také v ledvinách. Nalézá se v chromosomové oblasti 2q14.3.

V plazmě se vyskytuje jako inaktivní serinová proteáza, která je aktivována na svém endotelovém receptoru na APC jako odpověď na zvýšenou koncentraci trombinu. Primární úlohou APC je inaktivace koagulačních faktorů Va a VIIIa. Jeho antikoagulační aktivita je zvýšena PS a FV. APC působí prostřednictvím štěpení – inaktivací aktivovaných prokoagulačních faktorů V a VIII (20, 21).

Incidence klinicky významného PCD v populaci je odhadována na 1 : 20 000 (20). Vrozený PCD je považován za autosomálně dominantní onemocnění, které může být doprovázeno závažnými stavy v novorozeneckém období v případě homozygozity či složené heterozygozity (21). Riziko tromboembolické příhody pro pacienty s PCD je dle různých autorů 7–10× vyšší než u běžné populace (12, 19). V současné době je známo 391 kauzálních mutací u vrozeného PCD (viz www.hgmd.cf.ac.uk).

Antitrombin III

Plazmatický protein je kódován genem SERPINC1, který se nachází v chromosomové oblasti 1q25.1. K syntéze proteinu dochází v játrech.

Antitrombin je hlavní inhibitor serinových proteáz, jeho primární úlohou je lýza trombinu a faktoru Xa. Blokuje také další serinové proteázy koagulační kaskády – XIIa, XIa, IXa. Inhibiční schopnost antitrombinu může být značně zvýšená jeho interakcí s heparinem (22).

Vrozené ATD je autosomálně dominantní onemocnění, které predisponuje své nositele kE zvýšenému riziku nástupu VTE. Frekvence ATD v evropské populaci se pohybuje od 0,02 % do 0,2 % (23). Údaje stanovené na základě metaanalytické studie uvádí riziko nástupu VTE u pacientů s vrozeným ATD průměrně 16× vyšší oproti běžné populaci (19). Další autoři uvádí riziko nižší, pouze 10× vyšší oproti běžné populaci (3, 12). V současné době je známo 416 kauzálních mutací u vrozeného ATD (viz www.hgmd.cf.ac.uk).

DETEKCE POLYMORFISMŮ FV LEIDEN A G20210A PROTROMBINU

Genetické vyšetření je indikované u pacientů s epizodou VTE neznámé etiologie, trombózou na neobvyklém místě, výskytem VTE ve věku do 45–50 let, rekurentní VTE, první VTE s pozitivní rodinnou anamnézou či rozvojem VTE během těhotenství, s komplikacemi v průběhu těhotenství (např. opakovaným potratem) nebo při VTE při užívání hormonální antikoncepce (4, 24).

Metody vyšetření známých mutací vycházejí z předpokladu, že hledáme již známé SNP; z toho vyplývají požadavky na molekulární diagnostiku v klinické praxi. Metody by měly být rychlé s nízkými finančními náklady.

Úvodním krokem genetických analýz je zpravidla izolace DNA z primárního biologického materiálu, nejčastěji periferní krve. Pomocí primerů můžeme definované úseky DNA amplifikovat polymerázovou řetězovou reakcí (PCR); z tohoto principu vychází běžně aplikované analýzy: polymorfismus délky restrikčních fragmentů (PCR-RFLP), reverzní hybridizace na stripech (Strip Assay^®), alelově-specifická PCR, TaqMan real-time PCR, SNaPshot^® (25–30). V dnešní době jsou k dispozici metodiky, které umožňují stanovení prezence těchto SNP z plné krve bez potřeby izolačních kroků. Možná je také aplikace kitu pro přímou genotypizaci z periferní krve a analýza TaqMan real-time PCR (31).

PCR-RFLP

Metodou analýzy RFLP poprvé detekovali Leidenskou mutaci Bertina et al. (25). Tato analýza ve své multiplexové verzi umožňuje vyšetření jak varianty FV Leiden, tak genu protrombinu G20210A v jedné zkumavce (32).

Principem analýzy je amplifikace vybraných úseků DNA pomocí PCR a poté štěpení tohoto specifického produktu příslušnou restrikční endonukleázou. Každá endonukleáza má specifická místa, ve kterých štěpí řetězec DNA na základě cílové sekvence nukleotidů, jež se může změnit v přítomnosti mutace. Změnu pak můžeme zaznamenat separací na agarózovém gelu jako změnu délky a počtu fragmentů DNA.

Alelově specifická PCR

Na výhody využití této metody pro detekci leidenské mutace poukazují již Blasczyk et al. (27). Hlavními výhodami jsou rychlejší odezva a snížené náklady oproti RFLP a případnému přímému sekvenování.

Testování je určeno pro detekci SNP na základě precizního designu primerů. Pokud vyšetřujeme prezenci pouze jednoho SNP, můžeme využít základní variantu této metody, při níž jsou použity dva páry primerů. V každém páru primerů je jeden společný pro obě alely (wild type / mutovanou), ale druhý je pro jednu z alel specifický. Variabilní nukleotid je umístěn v terminální pozici na konci 3´ alelově specifického primeru. Pokud se matrice DNA a variabilní primer liší právě tímto nukleotidem, dojde k neúplnému nasednutí primeru a produkt se nevytvoří.

Pro tuto metodiku je důležité nastavení podmínek PCR tak, aby se maximalizoval rozdíl v úspěšnosti PCR pro správně a nesprávně navázané primery. Reakce probíhá ve dvou zkumavkách pro každý pár primerů zvlášť. Detekce prezence fragmentů pak probíhá na agarózovém gelu. Metoda má četné varianty a může být využita také ve formě multiplexu (33).

Strip Assay

Strip Assay je v dnešní době zřejmě nejpoužívanější metodou; je aplikovatelná také na detekci trombofilních polymorfismů (29). Na trhu je k dispozici velké množství komerčních kitů pro laboratorní diagnostiku.

Metoda je založena na principu reverzní hybridizace. V úvodním kroku je DNA pacienta amplifikována pomocí PCR s využitím primerů značených biotinem pro SNP, které chceme detekovat. Vzniklý produkt DNA je aplikován na strip a poté dochází k hybridizaci za použití oligonukleotidových sond (wild type / mutované), jež jsou imobilizované na stripu ve formě proužků. Takto navázané biotinylované sekvence můžeme detekovat po přidání streptavidin-alkalické fosfatázy a barevných substrátů.

TaqMan real-time PCR

Technika real-time PCR má mnoho aplikací a bývá využívána také na detekci FV Leiden a genu protrombinu G20210A (30). Její hlavní výhodou je rychlost odezvy pro absenci restrikčních kroků v případě RFLP a také absence potřeby elektroforeticky detekovat fragmenty. K dispozici je velké množství komerčních kitů.

Pro analýzu se využívají TaqMan sondy, oligonukleotidy, které nesou na svém konci 5´ kovalentně navázaný fluorofor a na konci 3´ zhášeč. Dokud jsou tyto molekuly vedle sebe, zhášeč potlačuje fluorescenci emitovanou fluoroforem. Sondy jsou specifické pro sekvenci DNA, pro které jsou navrženy primery. Polymeráza při syntéze nového vlákna svou exonukleázovou aktivitou hydrolyzuje sondu, čímž dojde k uvolnění molekuly fluoroforu z blízkosti zhášeče a emisi fluorescence. Detekce probíhá na základě speciálního termocykleru, který zaznamenává množství emitované fluorescence ve vztahu k templátu DNA přítomného ve zkumavce (34).

SNaPshot

V případě SNaPshot se jedná o rychlou metodu, pomocí které v závislosti na užitém kitu můžeme vyšetřit až 10 SNP v jedné reakci. V dnešní době je užívána především jako možnost relativně jednoduchého vyšetření většího množství SNP během jedné analýzy (14).

Funguje na základě extenze nově vznikajícího vlákna DNA, pokud je přítomný vybraný nukleotid. Prvním krokem analýzy je PCR reakce, kde díky adekvátně zvoleným primerům vymezíme fragment s možným výskytem SNP. Po purifikaci vzniklého amplikonu následuje jednonukleotidová extenzní PCR reakce. Detekční sondy jsou opatřeny poly(dT) rozdílné délky a připraveny tak, že nasednou přesně vedle pozice pro SNP. Po přidání směsi fluorescenčních dideoxyribonukleotidů (ddNTP) se sonda prodlouží o jeden příslušný dideoxynukleotid. Po následné purifikaci provedeme detekci na kapilární elektroforéze podle délky a barvy PCR produktů (14).

Vyšetření neznámých a vzácných variant asociovaných s trombofilními stavy

Pro molekulárně genetické testování jsou indikovaní pouze pacienti s důvodným podezřením na hereditární formu trombofilie za současného vyloučení exogenních příčin. Genetické vyšetření je doporučeno těm pacientům, u kterých došlo k epizodě VTE neznámé etiologie, výskytu trombózy na neobvyklém místě, výskytu VTE ve věku do 45–50 let, výskytu rekurentní VTE, výskytu první manifestace VTE s pozitivní rodinnou anamnézou nebo rozvoji VTE během těhotenství, komplikaci během těhotenství (např. opakovanému potratu), případně výskytu VTE při užívání hormonální antikoncepce (4, 24).

Pro indikaci genetického testování genů zodpovědných za deficienci antikoagulačních proteinů je důležitá detekce opakovaně nízkých hodnot funkčních testů stanovujících aktivitu těchto proteinů za předpokladu, že jsou vyloučeny exogenní vlivy. Korelací mezi aktivitou proteinu a nalezenými variantami lze empiricky odhadnout vhodné cut-off hladiny proteinů pro molekulárně genetické testování (7).

Sangerovo sekvenování

Sangerovo sekvenování je v dnešní době stále nejčastěji využívanou metodou pro detekci neznámých genetických variant v genech PROS1, PROC a SERPINC1 (4, 5, 7, 24). Jeho pomocí můžeme číst pořadí jednotlivých nukleotidů v řetězci DNA. Metoda je velmi časově náročná, jak po stránce vlastní přípravy reakcí pro jednotlivé fragmenty, tak pro samotné hodnocení takto nalezených variant.

Sangerova sekvenační metoda sestává z templátu DNA, specifických primerů, stavebních deoxyribonukleotidů (dNTP), fluorescenčně značených ddNTP a polymerázy. Prvním krokem je amplifikace úseku, který chceme sekvenovat pomocí specifických primerů metodou PCR. Klíčovým krokem pro detekci pořadí nukleotidů v polynukleotidovém řetězci je sekvenační PCR. Jeho podstatou je přidání 4 odlišně fluorescenčně značených ddNTP do reakční směsi, které v důsledku absence hydroxylové skupiny vždy po svém zařazení do nově vznikajícího řetězce celou syntézu ukončí. Do reakční směsi jich přidáváme pouze malé množství, protože dNTP „soutěží“ s ddNTP o pozici k začlenění do nově vznikajícího řetězce. Pořadí nukleotidů v takto vzniklém řetězci můžeme díky fluorescenci určovat kapilární elektroforézou v genetickém analyzátoru.

Vlastní hodnocení odhalených genových variant probíhá srovnáním získané a referenční sekvence pomoci programů BLAST^®, prohlížením variant na genomových prohlížečích a jejich hodnocení dle dostupných databází variant.

Masivní paralelní sekvenování

Vhodné využití technik masivního paralelního testování (MPS) je cestou jak zefektivnit vyhledávání vzácných a neznámých variant, které se mohou v genech vyskytovat. Mohou pomoci zvýšit testovací kapacitu a vyšetřit větší množství pacientů s deficiencemi antikoagulačních proteinů, protože prevalence PSD, PSC a ATD je nízká a zřejmě podhodnocená z důvodu nedostatečné testovací kapacity (35). Tato metodika se již využívá pro detekci velkých panelů trombofilních mutací (36, 37).

MPS, také označované jako sekvenování nové generace (NGS), umožňuje přečíst velké úseky DNA zahrnující geny, celé exomy a také genomy. Podstatou MPS je čtení velkého množství sekvencí DNA. Analýza vyžaduje přípravu genových knihoven pomocí fragmentace DNA, ligace adapterů, hybridizace s lokusově specifickými sondami, amplifikace fragmentů nebo přímé multiplexové amplifikace cílových sekvencí. Na vlastní sekvenaci takto připravených knihoven se dá využít více sekvenačních platforem, které se liší především využívaným detekčním systémem.

V současné době se nejčastěji využívá metoda MPS založená na snímání fluorescenčního signálu, který vzniká při syntéze komplementárního řetězce DNA k matrici, která je vázána na povrch sekvenační destičky pomocí adaptéru. Metody detekce využívají například platformy Illumina^®. Druhým nejčastějším systémem je metoda MPS využívající detekci změny pH při uvolnění vodíkového kationtu v průběhu zařazení nukleotidu během syntézy nového vlákna DNA. Této metody detekce využívají platformy Ion Torrent^®.

Velmi komplikovanou fází MPS je vlastní zpracování dat. Data je potřeba softwarově zpracovat, odstranit nekvalitní signály, dále sekvence seřadit a přiřadit k referenčním sekvencím vyšetřovaných oblastí. Posledním krokem je vyhodnocování a anotace nalezených variant na základě databází a predikčních programů (38).

MLPA

U některých pacientů, u nichž sekvenační metody neodhalily genetickou příčinu proteinového deficitu, byla odhalena variabilita v počtu DNA kopií. Aplikace metody MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification neboli mnohonásobné amplifikace závislé na ligaci sond) je vhodná pro pacienty, u nichž není popsána bodová patogenní mutace (39–41). Umožňuje detekovat velké delece či duplikace exonů, případně celého genu, které bychom sekvenací neodhalili. Principem metody je hybridizace speciální MLPA sondy s cílovou sekvencí ve vyšetřovaném genu, při využití pouze jednoho páru univerzálních primerů. Srovnání amplifikátu referenčních sond a signálu u sond targetových nám umožní stanovit počet kopií vyšetřovaných oblastí genu (nejčastěji exonů).

MLPA sonda se skládá ze dvou částí, rozdílných oligonukleotidových sekvencí, na jejichž konci je sekvence komplementární k primerům, které budou přidány do reakce. Jedna část této sondy je opatřena tzv. stufferem, což je pro různé sondy určující sekvence nukleotidů rozdílné délky. Právě stuffer, který je pro každou sondu charakteristický, umožní rozpoznat jednotlivé sondy na kapilární elektroforéze dle jejich definované délky. Abychom mohli sondu detekovat, musejí obě oligonukleotidové součásti sondy hybridizovat na cílovou genovou sekvenci vedle sebe. Jedná se o nezbytnou podmínku pro jejich spojení enzymem ligázou. Pro úspěšnou amplifikaci vyšetřované sondy je nezbytné navázání obou oligonukleotidových součástí na cílovou sekvenci a jejich spojení ligázou. Pouze tak může proběhnout polymerázová reakce, při níž nasedají univerzální primery na specifické sekvence navázané na obou částech zligovaných sond. Takto dochází k vytvoření fragmentu DNA, který detekujeme na kapilární elektroforéze.

ZÁVĚR

Cílem práce bylo podat odborné veřejnosti souhrnný přehled běžně využívaných molekulárně genetických vyšetření pro vyhledávání trombofilních mutací. Kromě běžně vyšetřovaných fenotypově významných SNP je třeba vyvinout efektivní metodiku pro stanovení vzácných variant s nízkou frekvencí, ale závažným fenotypovým efektem.

Na našem pracovišti se od roku 2016 zabýváme vyhledáváním vzácných genetických variant u trombofilních stavů pomocí MPS na platformě Ion Torrent PGM, pro možnost rychlé analýzy flexibilního počtu pacientů. K dispozici máme panel genů kódujících protein C, S a antitrombin. Výsledky naznačují, že díky vhodně zvoleným indikačním kritériím a MPS s plným pokrytím exonů a možných sestřihových míst vybraných genů lze tyto varianty efektivně vyhledávat. Tato metodika může výrazně zkrátit odezvu genetického testování probandů.

Odhalení kauzální genetické příčiny může mít příznivý vliv jak na probanda samotného, tak na preventivní režim pro rodinné příslušníky s potvrzenou trombofilní variantou.

Čestné prohlášení

Autor práce prohlašuje, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku není ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou. Toto prohlášení se týká i všech spoluautorů.

Poděkování

Podpořeno MZ ČR – RVO (FNOL, 00098892).

Seznam použitých zkratek

APC aktivovaný protein C

ATD deficit antitrombinu

dNTP deoxyribonukleotid

ddNTP dideoxyribonukleotid

FV faktor V

MLPA multiplex ligation-dependent probe amplification

NGS sekvenování nové generace

PCR polymerázová řetězová reakce

PCD deficit proteinu C

PSD deficit proteinu S

PS protein S

SNP jednonukleotidový polymorfismus

VTE žilní trombóza

Adresa pro korespondenci:

doc. Mgr. Radek Vodička, Ph.D.

Ústav lékařské genetiky LF UP a FN Olomouc

I. P. Pavlova 6, 779 00 Olomouc

Tel.: 588 444 636

e-mail: vodickar@fnol.cz

Zdroje

Lozano R, Naghavi M, Foreman K et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet 2012; 380: 2095–2128.
Souto JC, Almassy L, Borell M et al. Genetic susceptibility to thrombosis and its relationship to physiological risk factors: the GAIT study. Genetic Analysis of Idiopathic Thrombophilia. Am J Hum Genet 2000; 67(6): 1452–1459.
Dahlbäck B. Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders. Blood 2008; 112: 19–27.
Bereczky Z, Gindele, R, Speker M et al. Deficiencies of the natural anticoagulants–novel clinical laboratory aspects of thrombophilia testing. Ejifcc 2016; 27(2): 130–146.
García de Frutos P, Fuentes-Prior P, Hurtado B et al. Molecular basis of protein S deficiency. Thromb Haemost 2007; 98(3): 543–556.
Mateo J, Oliver A, Borell M et al. Laboratory Evaluation and Clinical Characteristics of 2,132 Consecutive Unselected Patients with Venous Thromboembolism–Results of the Spanish Multicentric Study on Thrombophilia (EMET*-Study). Thromb Haemost 1997; 77(3): 444–451.
Caspers M, Pavlova A, Driesen J et al. Deficiencies of antithrombin, protein C and protein S – Practical experience in genetic analysis of a large patient cohort. Thromb Haemost 2012; 108(2): 247–257.
Artoni A, Passamonti SM, Edefonti A et al. Antithrombotic prophylaxis in a patient with nephrotic syndrome and congenital protein S deficiency. Ital J Pediat 2016; 42(1): 22.
Cisneros GS, Khatib Z. Rivaroxaban prophylaxis in severe congenital protein C deficiency. Blood 2016; 128: 4945.
Ekim M, Yrlmaz YK. The prevalence of Factor V Leiden, prothrombin G20210A, MTHFR C677T and MTHFR A1298C mutations in healthy Turkish population. Hippokratia 2015; 19(4): 309–313.
Rosendaal FR, Koster T. Vanderbroucke JP et al. High risk of thrombosis in patients homozygous for factor V Leiden (activated protein C resistance). Blood 1995; 85(6): 1504–1508.
Kessler P. Trombofilní stavy. Interní medicína pro praxi, 2007; 8(9): 374–379.
Rees DC, Cox M, Clegg MB. World distribution of factor V Leiden. The Lancet 1995; 346: 1133-1134.
Madjukova S, Volk M, Peterlin B et al. Detection of thrombophilic mutations related to spontaneous abortions by a multiplex SNaPshot method. Genet Test Mol Biomarkers 2012; 16(4): 259–264.
Leroyer C, Mercier B, Oger E et al. Prevalence of 20210 A allele of the prothrombin gene in venous thromboembolism patients. Thromb Haemost 1998; 80(1): 49–51.
Hillarp A, Zöller B, Svensson PJ et al. The 20210 A allele of the prothrombin gene is a common risk factor among Swedish outpatients with verified deep venous thrombosis. Thromb Haemost 1997; 78(1): 990–992.
Rosendaal FR, Doggen CJM, Zivelin A et al. Geographic distribution of the 20210 G to A prothrombin variant. Thromb Haemost 1998; 79(4): 706–708.
Dahlbäck B. Protein S and C4b-binding protein: components involved in the regulation of the protein C anticoagulant system. Thromb Haemost 1991; 66(1): 49–61.
Di Minno MND, Ambrosino P, Ageno W et al. Natural anticoagulants deficiency and the risk of venous thromboembolism: a meta-analysis of observational studies. Thromb Res 2015; 135(5): 923–932.
Dahlbäck B. The protein C anticoagulant system: inherited defects as basis for venous thrombosis. Thromb Res 1995; 77(1): 1–43
Goldenber NA, Manco-Johnson MJ. Protein C deficiency. Haemophilia 2008; 14(6): 1214–1221.
Lu Z, Wang F, Liang M. SerpinC1/Antithrombin III in kidney-related diseases. Clin Sci 2017; 131(9): 823–831.
Wypasek E, Corral J, Alhenc-Gelas et al. Genetic characterization of antithrombin, protein C, and protein S deficiencies in Polish patients. Pol Arch Intern Med 2017; 127(7-8): 512–523.
Wypasek E, Undas A. Protein C and protein S deficiency-practical diagnostic issues. Adv Clin Exp Med 2013; 22(4): 459–467.
Bertina RM, Koelman BP, Koster T et al. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. Nature 1994; 369: 64–67.
Ekim M, Ekim H, Yrlmaz YK. The prevalence of Factor V Leiden, prothrombin G20210A, MTHFR C677T and MTHFR A1298C mutations in healthy Turkish population. Hippokratia 2015; 19(4): 309–313.
Blasczyk R, Ritter M, Thiede M et al. Simple and rapid detection of factor V Leiden by allele-specific PCR amplification. Thromb Haemost 1996; 75(5): 757–759.
Yousefian E, Kardi MT, Allahveisi A. Methylenetetrahydrofolate reductase C677T and A1298C polymorphism in Iranian women with idiopathic recurrent pregnancy losses. Iran Red Crescent Med J 2014; 16(7).
Awad NS, Almaki TA, Sabry AM et al. Screening of factor V G1691A (Leiden) and factor II/prothrombin G20210A polymorphisms among apparently healthy Taif-Saudi Arabia population using a reverse hybridization strip assay approach. World J Med Sci 2013; 9(4): 202–207.
van den Bergh FA, van Oeveren-Dybicz AM, Bon MAM. Rapid single-tube genotyping of the factor V Leiden and prothrombin mutations by real-time PCR using dual-color detection. Clin Chem 2000; 46(8): 1191–1195.
Geiger K, Leiherer A, Brandtner EM et al. Direct blood PCR: TaqMan-probe based detection of the venous thromboembolism associated mutations factor V Leiden and prothrombin c. 20210G> A without DNA extraction. Clin Chim Acta 2019; 488: 221–225.
Baris I, Koksal V, Etlik O. Multiplex PCR-RFLP assay for detection of factor V Leiden and prothrombin G20210A. Gen Test 2004; 8(4): 381–383.
Kofiadi IA, Rebrikov DV. Methods for detecting single nucleotide polymorphisms: Allele-specific PCR and hybridization with oligonucleotide probe. Genetika 2006, 42(1): 22–32.
Heid CA, Stevens J, Livak K. J et al. Real Time Quantitative PCR. Genome Res 1996; 6(10): 986–994.
Fidalgo T, Ribeiro ML. Added value of next-generation sequencing for haemostasis diagnosis. Thromb Haemost Res 2017; 1(2): 1007.
Lotta LA, Wang M, Yu J et al. Identification of genetic risk variants for deep vein thrombosis by multiplexed next-generation sequencing of 186 hemostatic/pro-inflammatory genes. BMC Med Genomics 2012; 5(1): 7.
de Haan HG, van Hylckama Vlieg A, Lotta LA et al. Targeted sequencing to identify novel genetic risk factors for deep vein thrombosis: a study of 734 genes. J Thromb Haemost 2018; 16(12): 2432–2441.
Vodička R, Vrtěl R, Menšíková K, Kaňovský P et al. Next Generation Sequencing Data Analysis Evaluation in Patients with Parkinsonism from a Genetically Isolated Population. Genomics And Computational Biology 2017; 3(3): e44.
Lind-Halldén C, Dahlín A, Hillarp A et al. Small and large PROS1 deletions but no other types of rearrangements detected in patients with protein S deficiency. Thromb Haemost 2012; 108(1): 94–100.
Pintao MC, Garcia AA, Borgel D et al. Gross deletions/duplications in PROS1 are relatively common in point mutation-negative hereditary protein S deficiency. Hum Genet 2009; 126(3): 449–456.
Picard V, Chen JM, Tardy B et al. Detection and characterisation of large SERPINC1 deletions in type I inherited antithrombin deficiency. Hum Genet 2010; 127(1): 45–53.

Štítky

Adiktologie Alergologie a imunologie Angiologie Audiologie a foniatrie Biochemie Dermatologie Dětská gastroenterologie Dětská chirurgie Dětská kardiologie Dětská neurologie Dětská otorinolaryngologie Dětská psychiatrie Dětská revmatologie Diabetologie Farmacie Chirurgie cévní Algeziologie Dentální hygienistka

Článek Dědičné nádorové syndromy, jejich testování a prevence

Článek Přednáškové večery spolku českých lékařů v Praze (DUBEN 2019)

Článek Význam cytogenetické a molekulárně cytogenetické analýzy v diagnostice hematologických malignit v době nových sekvenačních technik

Článek Úvodem

Článek Klinická genetika ve 21. století

Článek Editorial

Článek Vrozené vady u narozených dětí v České republice v období 1994–2015

Článek Vzácná onemocnění a jejich domácí a mezinárodní kontext v roce 2019

Článek Specifika informovaného souhlasu v klinické genetice a genetickém poradenství

Článek Problematika výjimečné úhrady podle § 16 zákona o veřejném zdravotním pojištění

Článek vyšel v časopise