Ovládání (úpravy) genomu na dosah anebo již v našich rukou?

Souhrn

V posledních letech se zřejmě odehrává revoluce v možnostech úprav nejrůznějších genomů, včetně lidského, a jako nejúspěšnější se ukazuje metoda označovaná CRISPR/Cas9. Její použití odhalilo mnoho dříve neznámých způsobů chování informací vyjádřených v nukleových kyselinách, a to nejen v jejich změnách, ale i způsobech jejich šíření. Současně ukázalo i způsoby ovládání těchto procesů, což nabízí nebývalé možnosti jejich využití v lékařství. Pochopitelně upozornilo na případné zneužívání a na nezbytnost vytvoření potřebného etického, ale především právního rámce.

Klíčová slova:
editace genomu, genový drive, genová terapie, CRISPR/Cas9

ROZMACH GENOVÉHO INŽENÝRSTVÍ

V posledních několika letech se genová terapie konečně dočkala slibných výsledků, opět s pomocí výsledků výzkumu bakterií a fágů. Podobně jako před mnoha lety, kdy DNA diagnostika začala používat bakteriální enzymy štěpící cílovou DNA na základě specifických sekvencí spadajících do polymorfismů typu RFLP (restriction fragment length polymorphism), se i současný pokrok opírá o procesy používané bakteriemi v ochraně před fágy. Štěpné fragmenty DNA vznikající působením bakteriálních restriktáz umožnily sledovat přenos vybraných úseků DNA z generace na generaci, a tak došlo k prvnímu široce používanému úspěšnému kroku molekulární DNA diagnostiky. V případě blízkosti takového polymorfismu některé z patogenních mutací bylo možné sledovat i její přenos a použití této metody způsobilo rozvoj a vznik průmyslu vyrábějícího stále nové „restriktázy“. Bohužel ne vždy byla konstelace podmínek pro stanovení diagnózy příznivá (nenašel se vhodný polymorfimus ani odpovídající restriktáza), někdy dokonce proto, že některý z příbuzných se odmítl nechat vyšetřit.

Mnohem úspěšnější v DNA diagnostice byla později polymerázová řetězová reakce (PCR), která ani dnes neztratila svůj význam a účinnost. I ta využívá bakteriální enzymy, tentokrát k syntéze; snad nejznámějším je termostabilní polymeráza izolovaná původně z kmene Thermus aquaticus. V případě PCR je k výběru cílového místa v sekvenci analyzované DNA použit krátký „fragment“, obvykle synteticky připravený, o přibližně 20 nukleotidech, schopný specificky hybridizovat (připojit se) k cílovému úseku DNA a stát se „očkem“ od kterého svou činnost začne příslušná polymeráza.

Metoda CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) opět vychází z nálezů u bakterií a opět využívá analogie s jejich obranným systémem proti fágové infekci. Má také své méně výkonné a pracnější předchůdce TALENs (transcription activator-like effector nucleases) a ZFNs (zinc-finger nucleases) (1). Zatímco nejstarší z uvedených metod ZFNs potřebovala dobu cca 1 roku, aby dosáhla cíle, v případě TALENs to byly týdny až měsíce a metodě CRISPR stačí pár dnů.

Metoda CRISPR je založená na rozštěpení dvojřetězcové molekuly DNA a následné opravě spojením volných konců po vynětí nebo vložení krátkého úseku DNA do vzniklé mezery (obr. 1). Pokud se tak stane v rámci funkční sekvence DNA, dojde k ztrátě funkce. Tento proces může být použit i k výměně příslušného úseku za nový, který se od původního liší třeba jen jedním nukleotidem; pak dojde k analogii přirozené rekombinace. Na cílové místo je tento proces nasměrován guide RNA (gRNA), která je k němu komplementární. Jedinou nevýhodou „klasického“ systému CRISPR/Cas9 je, že vkládá, ztrácí nebo vyměňuje vždy úsek DNA, nikoliv jednotlivé nukleotidy. Tuto nevýhodu se však již podařilo odstranit systémem ABEs (7. generace – ABE7.10) (2). „Klasickou“ metodu CRISPR se stále daří vylepšovat, především její specificitu snížením tzv. off-target (mimocílového) působení (3).

U člověka, který není vystaven nadměrnému působení mutagenů, se předpokládá spontánní vznik mutací s frekvencí 10⁻⁶ na buňku a generaci. Předpokládaný počet genů kódujících bílkoviny u člověka je zhruba 20 tisíc, ty ale představují jen něco kolem 1,5 % genomu. Z celého zbytku lidského genomu je transkribováno zhruba 75 %, obsahujících téměř 16 tisíc genů pro lncRNA a 7500 pro sncRNA, kódujících většinou regulační RNA.

Při tom je třeba si uvědomit, že prakticky každý mnohobuněčný eukaryot je vysoce chimérický organismus, tj. skládající se z buněk, které mohou obsahovat i mutace, k nimž došlo během jeho individuálního vývoje. Mutace, které se nacházejí v tělních buňkách, nemohou být předány dalším generacím (to samozřejmě platí pouze u organismů, jež nemají schopnost nepohlavního rozmnožování). Nicméně tyto mutace mohou mít pro život jedince zásadní význam. Tomuto problému se věnuje Consortium GTEx (Genotype-Tissue Expression), které porovnávalo genovou expresi ve 44 lidských tkáních v závislosti na genotypu a potvrdilo u většiny testovaných genů zjevnou variabilitu (4).

Směrů výzkumu, jimiž se editace genomu ubírá, je velice mnoho a jejich přehled by se hodil spíše do časopisu s obecně biologickým zaměřením. V tomto sdělení se soustředíme na lékařskou problematiku a můžeme uvést tři hlavní směry (obr. 2).

ODSTRANĚNÍ GAMETICKÝCH PATOGENNÍCH MUTACÍ, LÉČENÍ VZÁCNÝCH DĚDIČNÝCH CHOROB (I JEJICH PREVENCE)

Jednoduše dědičné choroby, např. vrozené omyly metabolismu (5), jsou poměrně vzácné. Jejich výskyt lze významně ovlivnit metodami genového inženýrství, konkrétněji genovou terapií. Na rozdíl od kdysi teoreticky uvažované selekce, bránící přenosu odpovědných genů z mateřské generace na generaci dceřinou (což se vlastně děje přirozenou cestou u mutací letálních), nás výpočty populačních genetiků přesvědčily, že k vymizení patologických mutací by došlo (pokud by nevznikaly žádné nové) až po značně velkém počtu generací – jinými slovy jakákoliv selekce by u člověka byla velmi málo účinná.

Výzkum v rámci genové terapie přinášel až do začátku posledního desetiletí jen nepatrný pokrok a hlavním nástrojem přenosu žádoucích genetických informací byly viry. I to však slavilo své úspěchy. Významného úspěchu bylo dosaženo s použitím virového vektoru u letálního kožního onemocnění – junkční epidermolysis bullosa – vytvořením transgenních kmenových buněk (6). Příjemcem byl nositel homozygotního genotypu sestřihové mutace v intronu genu LAMB3.

Genová editace (jako nejúspěšnější se ukázala metoda označovaná CRISPR/Cas9) vyvolala díky počátečním úspěchům ohromné nadšení. To poněkud opadlo, když se zjistilo, že i ona má své slabiny. Současně se věnuje hlavní pozornost jejich odstraňování a hledání dalších způsobů genové editace. Jednou z aplikací důležitých pro současnou medicínu je možnost genové editace při úpravách genomu embryonálních buněk. V tomto směru nejvíce pokročila Velká Británie (7) následovaná Čínou a USA. Ve všech jmenovaných státech již byl povolen výzkum na lidských embryích. Tyto výzkumy jsou užitečné zvláště pro fertilizaci in vitro (IVF), která vyžaduje nejen kvalitní diagnostiku (7, 8), ale i bezpečnou genovou terapii. Zatímco Rada Evropy v Konvenci o lidských právech a biomedicíně zakázala modifikace genomů buněk zárodečné linie, skupina expertů v USA vypracovala a v rámci Národní akademie věd (NAS) (9, 10) vydala řadu požadavků na návrhy projektů zabývajících se genovou editací zárodečných genomů lidských buněk a žádajících o povolení k realizaci. Předpokladem schválení je především chybění rozumné alternativy a dále splnění následujících kritérií:

• Prevence závažné choroby nebo stavu.     
• Editace genů, u nichž bylo přesvědčivě dokázáno, že významně předurčují vznik choroby nebo stavu.
• Přeměna genů do podoby, která je v populaci převládající a o níž je známo, že souvisí s normálním zdravotním stavem a má minimální nebo žádné vedlejší účinky.
• Dostupnost preklinických či klinických dat o rizicích a pravděpodobně vhodném vlivu na zdraví.
• Průběžný a rigorózní dohled nad klinickými studiemi z hlediska vlivu použité techniky na zdraví a bezpečí účastníků výzkumu.
• Srozumitelné plány na dlouhodobé, vícegenerační sledování při nenarušení osobní autonomie.
• Maximální otevřenost při zachování pacientova soukromí.
• Soustavné ověřování zdravotního i sociálního přínosu a rizik včetně současné účasti a příspěvku veřejnosti.
• Hodnověrné (spolehlivé) mechanismy dohledu, které by bránily rozšíření mimo závažné choroby a stavy.

Pokud by navrhovaný výzkum splňoval uvedená kritéria, mohl by být povolen. V některých státech již povolené experimenty na embryonálních buňkách přinesly pozitivní výsledky (7) a systém CRISPR je nabízen komerčně, např. v podobě kompletních souprav k okamžitému použití včetně gRNA pro všechny známé lidské geny.

V tomto směru nabývá výuka lékařské genetiky na dalším významu a přináší zadostiučinění všem našim zakladatelům výuky genetiky na českých (československých) lékařských fakultách – prof. Vladislavu Růžičkovi a na Slovensku prof. Viliamu Izakovičovi (11).

Náprava defektních genů v rámci genové terapie na úrovni zygoty či embrya otvírá dveře pro efektivní léčení dědičných (genetických) chorob, avšak reálné využití této technologie významně závisí na vývoji legislativy, etických pravidel a postojů společnosti. Pozměněná embrya lze zatím zkoumat jen několik dní, následně se experiment musí ukončit bez možnosti dalšího vývinu embrya v děloze matky. Metoda CRISPR/Cas9 však poskytuje též možnosti editace genů a jejich opravy jen v konkrétních tkáních organismu, jež jsou dědičným onemocněním postižené, tj. není potřebné změnit DNA jedince ve všech jeho buňkách.

Zajímavé výsledky byly v tomto směru dosaženy u nemocí, které ovlivňují tkáně vznikající z buněčných linií se zachovanou dělivou schopností. Jde například o kmenové linie včetně indukovaných iPSC (induced pluripotent stem cells) – jejich využití v genové terapii se též intenzívně zkoumá při nádorových chorobách (viz dále). Velmi perspektivní se zdají být možnosti opravy genů v buňkách krvetvorby, například genu pro beta-globin (HBB) v iPSC a produkce „opraveného“ proteinu ve vznikajících erytrocytech (12). Metoda by tak mohla pomoci v léčbě beta-talasemie nebo srpkovité anemie. Ještě dříve existovaly snahy o aplikaci metody CRISPR/Cas9 v souvislosti s metabolickými dědičnými chorobami typu enzymopatií. Lee et al. (5) prokázali možnost opravy genu pro arginázu v iPSC. V podobném experimentu, jen na jiném typu buněk, se podařilo inaktivovat mutovanou alelu, zodpovědnou za vznik Huntingtonovy choroby (13).

Kultivační techniky buněk získaných z postiženého jedince, jako je změna sekvence DNA v podobě opravy poškozeného genu, jsou ve stadiu technického zvládnutí při mnoha dalších onemocněních. Zatím před námi zůstává další fáze terapie včetně vnášení opravených buněk do organismu a jejich úspěšná implementace s následným „vyléčením“ pacienta. K prvnímu takému kroku se odhodlali v roce 2016 v Číně, těsně následovaní USA (14). Nešlo však o typické monogenní onemocnění, spíš o podporu imunitního systému v boji proti nádorům, o které se zmiňujeme dále.

Další způsob genové terapie s využitím technologie CRISPR/Cas9 nevyužívá izolované buňky pacienta a jejich úpravu v podmínkách in vitro, ale naopak dodává všechny složky na místo určení v těle organismu a realizace vlastní úpravy genů probíhá in vivo v cílové tkáni. Většina takovýchto experimentů se úspěšně uskutečnila na myších. V jedné z prvních úspěšných prací z roku 2014 se tímto způsobem podařilo „opravit“ gen pro fumarylacetoacetát hydrolázu (FAH), důležitý enzym v metabolismu tyrosinu, jehož mutace jsou příčinou metabolického defektu – tyrosinemie typu I. Všechny komponenty CRISPR/Cas9 byly do jater myší dopravené pomocí tzv. hydrodynamické injektáže, a tak se podařilo obnovit produkci enzymu v asi třetině jaterních buněk (15).

Jiné postupy využily k transportu složek CRISPR/Cas9 tzv. adeno-asociované viry, čímž došlo k úpravě genu pro dystrofin s potenciálem využití v genové terapii některých forem svalové dystrofie (16). Zatím posledním úspěchem této metody je úprava geneticky podmíněné ztráty sluchu zaměřená na potlačení mutace genu TMC1. Ten kóduje transmembránový protein potřebný pro funkci buněk ve vnitřním uchu. Gao et al. v tomto případě dopravili komponenty CRISPR/Cas9 do vnitřního ucha myší pomocí lipidových vezikul. Výsledkem bylo zlepšení sluchu myší (hodnocené za měsíc po zákroku) v průměru o 15 decibelů (17).

ODSTRANĚNÍ SOMATICKÝCH MUTACÍ (LÉČBA A PREVENCE NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNÍ, POSÍLENÍ PROTINÁDOROVÉ IMUNITY)

Protože nádorové buňky, nebo alespoň některé z nich, svým způsobem odpovídají kmenovým buňkám, můžeme pomocí metody genové editace lépe poznat jejich genetickou výbavu. Bakhshinyan et al. naznačili způsob využití metody CRISPR pro screening jejich vlastností tak, aby byla využitelná pro cílenou terapii pokrývající co nejširší spektrum cílů důležitých pro jejich růst a množení (18). V konkrétním případě např. Yik et al. (19) vypracovali techniku pro využití genové editace pro pokusy na imortalizovaných buněčných liniích erytroleukemie. Podobně byly vypracovány návody jak vyhledávat v genomu ztrátové mutace a sestaveny strategie jak odhalit genetické závislosti nádorových buněk využitelné v protinádorové léčbě (20).

Zásadního pokroku bylo dosaženo u nádorů prostaty, kdy se s pomocí metody CRISPR podařilo najít některé nové mezigenové vztahy důležité zvláště pro rekurenci nádoru (21). Velmi důležitý je výzkum dosud málo známé (a přitom větší) části genomu (22). S nádorovými buňkami bojuje imunitní systém, k jehož podpoře lze genovou editaci také použít (23), např. vyřazení CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) pomocí metody CRISPR a tím pádem potlačení jeho tlumivé funkce na aktivaci T buněk a současně podporu produkce TNF-α a IFN-γ. Podobný cíl měly již zmiňované studie z Číny a USA, kde inaktivovali gen kódující protein PD-1 (programmed cell death 1) – receptor též zapojený do regulace T buněk imunitního systému. V uvedeném experimentu byly pacientům poprvé v historii injekčně podány buňky s geny upravenými pomocí techniky CRISPR/Cas9 v rámci klinické studie, jež by měla být ukončena v roce 2018.

Protinádorové léčbě dosud dominovala a stále dominuje chemoterapie. K jejímu zásadnímu pokroku již také začaly přispívat metody genové editace (24) tím, že kromě jiného umožňují přesněji definovat vztah mezi terapeutikem a jeho místem zásahu.

Poněkud mimo uvedené směry se nachází užití editace genomu v boji s virovými infekcemi typu HIV, které primárně postihují somatické buňky infikované osoby, ale z nemocných matek mohou být přenášeny na jejich děti, a chovat se tak jako vrozené (dědičné) onemocnění. Možnostmi použití metody CRISPR jakožto antivirové léčby se ve velké šířce i s použitím vektorů typu AAV (adeno-associated viral vector) zabývají Soppe a Lebbink (25). Hlavním problémem však zatím zůstává, vzhledem k sekvenční variabilitě, dostupnost adekvátní gRNA (26). Stranou zájmu nezůstaly ani bakterie (27), kde se genová editace uplatňuje ve smyslu otevření nové cesty k potlačování rezistence, se kterou jsme si dosud nevěděli příliš rady.

MOŽNOSTI ODSTRANĚNÍ PŘENAŠEČŮ PARAZITÁRNÍCH NEMOCÍ (GENOVÝ DRIVE)

Metoda CRISPR je z hlediska genetiky výjimečná v tom, že se v jednom směru vymyká pravidlům klasické Mendlovy nauky o dědičnosti, a to v přenosu znaků z generace rodičovské na potomstvo. Název může připomínat genetický drift známý z populační (evoluční) genetiky, který vysvětluje, jak v malých populacích, zvláště takových, jež procházejí fází, kterou připodobňujeme k průchodu hrdlem lahve, může převládnout i méně výhodná alela a vymizet výhodnější (28). Procesem CRISPR lze docílit podobného jevu velice rychle a vlastně bez ohledu na velikost populace, v níž tento proces proběhne.

Genový drive, který byl zpočátku považován za geniální řešení (29), má i svá úskalí, jak se naštěstí včas ukázalo na pokusech s octomilkou (drozofilou). V posledních letech, po počátečním nadšení z možnosti rychle se zbavit přenašečů tak zhoubných chorob, jako je malárie, se objevily rozpaky nad důsledky vyhubení některých druhů hmyzu pro přírodu jako celku, neboť např. pro některé ptáky představují jejich larvy důležitou součást potravy, a hlavně i proto, že po rychlém převládnutí vnesené alely se mohou v postižené populaci objevit rezistentní jedinci (30). Podobné vědomé i nevědomé pokusy totiž lidé provedli už mnohokrát, např. tím že přenášeli některé zvířecí nebo rostlinné druhy z jednoho místa (kontinentu) na druhé a často tak způsobili mnoho původně neočekávaných škod, mezi jiným i vymizení domácích druhů, a kýženého výsledku stejně nedosáhli.

Vedle léčení nabízejí metody upravující lidský genom mnoho dalších způsobů využití např. z estetického hlediska, ale i v dalších oblastech, především ve sportu, u něhož ovšem hrozí tzv. genový doping; nikoliv snad proto, že bychom o něm neuvažovali již dříve, ale pro snadnost, s jakou by dnes bylo možné jej používat. Většina těchto „nemedicínských“ oblastí je vystavena kritice z hlediska etiky, která by neměla být opomíjena ani u využití medicínského, zvláště tam, kde chceme zasahovat do genomu způsobem, jehož následky by byly přenositelné do dalších generací.

Konečně, jeden neslavně známý příklad pokusu o genový doping pochází z doby před deseti lety, kdy byla medializovaná snaha německého trenéra atletů o získání preparátu Repoxygen. Uvedený preparát byl původně vyvinutý k léčbě anemie. Umožňoval přenos genů pro stimulaci syntézy erytropoetinu pomocí virového vektoru. Přestože tento preparát byl zakázaný, hrozbu genového dopingu si perspektivně uvědomuje i samotná Světová antidopingová agentura (WADA), která v rámci svých pravidel vysloveně zakazuje ovlivňování sportovní výkonnosti pomocí přenosu nukleových kyselin nebo jejich analogů a použití normálních či geneticky modifikovaných buněk (31).

Co se týká patentové ochrany techniky genové editace, pochází největší počet návrhů z Massachusettského technologickému institutu (MIT), na druhém místě je Broad Institute, na třetím Harvardova univerzita a na čtvrtém Kalifornská univerzita (všechny instituce z USA). Na pátém místě je pak Čínská akademie věd (CAS). (Viz též: www.ipstudies.ch/crispr-patent-analytics).

ZÁVĚR

Mnoho odborníků předpokládá, že současný stav je teprve začátkem narůstajícího zájmu o cílené úpravy nejen lidského genomu a že v brzké době se stane jedním z nejrozšířenějších postupů laboratoří zabývajících se molekulární genetikou. Mimo jiné o tom svědčí výše uvedené šetření o počtech patentů (návrhů i uznaných) a licencí uveřejněných na webu IPS. Někteří odborníci dokonce předpovídají, že prakticky každá biologická laboratoř bude tyto metody používat.

Pokud si položíme pro nás zatím jen teoretickou otázku, zda genovou editaci zvládáme a chceme ji v klinické praxi využívat, a odpovíme na ni ANO, pak je s tím spojeno nemalé množství dalších otázek, které bude třeba vyřešit, nejen technických, ale i etických (32). Jestliže se ukáže, že se skutečně lidstvu podařilo vynalézt způsob jak ovlivňovat svou biologickou evoluci, a to nejen zásahy do svého vlastního genomu, ale i genomů ostatních forem života, bude třeba nejvyššího stupně ostražitosti. Zkušenosti s nejrůznějším lidskými vynálezy nás varují, že, byť byly pod kontrolou celosvětově platné dohody, prakticky nikdy se tato pravidla nepodařilo dodržet a zabránit zneužití.

DODATEK

Dodatek, který snad potěší, ale možná vzbudí i závist našich otorinolaryngologů a za který musím poděkovat kolegovi Suchardovi, neboť mne na něj upozornil, se týká úspěšného léčení dominantně dědičné hluchoty, zatím jen v experimentu na myších (33). Snad se podobného úspěchu dočká genová editace u amyotrofické laterální sklerózy (ALS), kde je odpovědným gen SOD1 (34), a stane se použitelnou i v lidské terapii. A jako poslední připojím dva „povzdechy“, které se objevily mezi komentáři v čísle 7697 letošního ročníku Nature. Oba se zabývají problematikou genové editace, a to potřebou diskuse o jejích možnostech a případné regulaci (35, 36). Hlubší vhled do obou článků musím ponechat na čtenářích, které to bude zajímat, protože jinak by se mohl dodatek svým rozsahem stát nejdelší částí tohoto textu.

Adresa pro korespondenci:

prof. RNDr. Radoslav Omelka, Ph.D.

Katedra botaniky a genetiky

Fakulta prírodných vied Univerzity Konštantína Filozofa v Nitre

Trieda A. Hlinku 1

949 74  Nitra, Slovensko

e-mail: romelka@ukf.sk; romelka@pobox.sk