Abstrakta

ACC haplotyp protaminových genů PRM 1 a PRM2 je asociován s vyšším počtem spermií

P. Křenková, F. Tüttelmann, S. Römer, A. R. Nestorovic, M. Ljujic, A. Štambergová, M. Macek jr., E. Nieschlag, J. Gromoll, M. Simoni, M. Macek, sr.

Univerzita Karlova v Praze, 2. lékařská fakulta, Ústav biologie a lékařské genetiky FN Motol, Praha

Během spermatogeneze jsou histony v hlavičkách spermií nahrazovány protaminy, které umožňují kondenzaci chromatinu nezbytnou pro stabilitu DNA a neporušené vyzrávání spermií. Haploinsuficience těchto genů vede u myší k neplodnosti způsobené abnormální morfologií spermií a jejich sníženou pohyblivostí. Publikované studie zabývající se rolí PRM1/2 variant v mužské neplodnosti jsou však nejednoznačné. Cílem naší studie bylo stanovit frekvenci těchto variant a objasnit jejich vztah k poruchám spermiogeneze.

V mezinárodní retrospektivní studii případů a kontrol byla provedena sekvenační analýza protaminových genů u tří skupin německých mužů – u neplodných pacientů s idiopatickou teratozoospermií a normálním (N = 88) nebo sníženým množstvím spermií (N = 83) a u kontrolní skupiny normozoospermických mužů s normálním počtem spermií (N = 77).

V genu PRM1 byly detekovány dvě vzácné varianty (c.54G>A, c.102G>T) a jedna častá (c.230A>C), v genu PRM2 pakšest vzácných variant a dvě časté (c.298G>C a c.373C>A).

Ve frekvenci nalezených variant nebyl nalezen žádný signifikantní rozdíl mezi testovanými skupinami. Mutace jsou v protaminových genech vzácné a nejsou přímou příčinou poruch spermiogeneze.

Analýza haplotypů třech nejčastějších polymorfismů PRM1 230A>C a PRM2 298G>C/373C>A prokázala u společně testovaných 248 mužů vztah k počtu spermií. Homozygotní nosiči haplotypu ACC mají dvojnásobně vyšší počet spermií než muži bez tohoto haplotypu. Signifikantní odchylka analýzy Hardy-Weinbergovy rovnováhy těchto polymorfismů prokazuje selekční výhodu alely ACC, která podporuje vyšší spermiogenezi a tudíž lepší fertilitu. Uvedené nálezy jsou prioritní.

Podpořeno VZ FNM 00064203 a NR 9448-3/2007.

Monozygotní dvojčata v asistované reprodukci

^1,2E. Oráčová, ¹G. Tauwinklová, ¹P. Trávník, 1K. Veselá, ¹J. Veselý, ¹L. Hromadová, ¹E. Pagáčová

¹Sanatorium REPROMEDA s.r.o., Brno

²Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i., Brno

Úvod. Monozygotní dvojčata (MZD) vznikají rozdělením jednoho embrya. U spontánních těhotenství se MZD vyskytují v 0,4 %. Incidence MZD po metodách asistované reprodukce se pohybuje od 0,2 % do 12,5 %. Příčina vzniku není doposud jasná. Mezi vnitřní faktory související s MZD je řazen vyšší věk, odlišná inaktivace X chromozomu a vrozené defekty proteinů zona pellucida (genetické faktory). Jako vnější faktory související s MZD jsou uváděny ovariální stimulace, mikromanipulační metody narušující zonu pellucidu, transfer blastocyst a kultivační podmínky.

Materiál a metody. Retrospektivní studie monozygotních dvojčat zjištěných od ledna 2000 do srpna 2009 z čerstvých cyklů v programu IVF s použitím metod ICSI, PGD i darování oocytů.

Výsledky. Z 1255 gravidit bylo zjištěno 25 (1,99 %) monozygotních dvojčat. Ve všech případech se jednalo o transfer embryí po pětidenní kultivaci. Mezi transferovanými embryi převažovaly expandované a hatchující blastocysty. Z porozených plodů bylo 16 ženského a 10 mužského pohlaví. Oproti celému souboru pacientek byl v této skupině zjištěn nižší věk pacientek (29,36 vs. 32,39) a vyšší počet získaných oocytů (16,8 vs. 14,94). Během posledních tří let byla zaznamenána vzrůstající tendence v počtu zjištěných MZD na graviditu; a to 2,80 % (rok 2007), 3,33 % (rok 2008) a 4,24 % (část roku 2009).

Závěr. Nenašli jsme souvislost výskytu monozygotních dvojčat s vyšším maternálním věkem, typem ovariální stimulace ani použitými mikromanipulačními technikami AR (ICSI, PGD). Skutečnými příčinami jejich vzniku se budeme dále zabývat.

Poprvé v České republice bylo prezentováno ve spolupráci s Národním centrem pro výzkum biomolekul zobrazení spermií metodou AFM (Atomic Force Microscopy). Tato metoda umožňuje rozlišení až na úrovni jednotlivých molekul.

Práce byla oceněna odbornou veřejností, vyvolala i mimořádný zájem medií na celostátní úrovni.

Zobrazení spermií metodou AFM (Atomic Force Microscope) s vysokým rozlišením

¹J. Přibyl, ¹P. Skládal, ²I. Crha, ²J. Žáková

¹Masarykova univerzita Brno, Přírodovědecká fakulta, Národní centrum pro výzkum biomolekul

²Masarykova univerzita Brno, Lékařská fakulta, Gynekologicko-porodnická klinika FN

Úvod. Vyšetření spermatu je základním andrologickým vyšetřením. Informuje lékaře o morfologii a dalších vlastnostech spermií. Morfologie spermie je stěžejním faktorem ovlivňujícím průběh oplození a následný vývoj embrya. Standardním postupem je vyšetření barveného nátěru spermií fixovaných na podložním sklíčku pod optickým mikroskopem s imerzí (zvětšení 100×). Cílem práce bylo vypracovat metodu přípravy vzorku a nastavení přístroje pro optimální zobrazení spermií metodou AFM.

Materiál a metody. Mikroskop atomárních sil AFM je velmi citlivé zobrazovací zařízení, pracující typicky s rozlišením pod 1 nm. Principem zobrazování je kontakt velmi ostrého hrotu s povrchem vzorku, na němž je vhodně fixován vizualizovaný objekt. Nad tímto povrchem je hrot posouván, jeho výchylka je zaznamenávána laserovým paprskem a pomocí počítače převáděna do podoby trojrozměrného obrazu. Byla provedena pilotní studie použití mikroskopu AFM pro zobrazování spermií připravených standardní cestou na podložních sklech. Byly použity vzorky spermatu mužů s normospermií vyšetřovaných v andrologické laboratoři Centra asistované reprodukce FN Brno. Pro vyšetření byly vybrány spermie bez výrazných morfologických změn.

Výsledky. Pro dosažení kvalitního obrazu bylo nutné vypracovat techniku přípravy nátěru s odstraněním složek, které nejsou optickým mikroskopem pozorovatelné – stopy seminální plazmy, krystaly solí po zaschnutí fyziologického roztoku na preparátu. Nastavení přístroje vyžadovalo optimalizaci několika parametrů. Byly získány obrazy spermií s vysokým rozlišením umožňujícím hodnocení detailní morfologie povrchu.

Závěr. Studie potvrdila schopnost AFM mikroskopie zobrazit morfologii spermií až s molekulárním rozlišením.

Podpořeno grantem GA AV KJB401630701 a IGA MZ ČR NS/9661-4.