Chronická lymfocytární leukemie – současné využití moderních prognostických a prediktivních faktorů v diagnostice

Souhrn

Poznatků o biologii a patogenezi chronické lymfocytární leukemie (CLL) za posledních 25 let dramaticky přibylo. Výrazně se rovněž změnila terapie této nemoci. Jde o jeden z nejvýraznějších pokroků v rámci celé onkologické hematologie. CLL má různorodý klinický průběh, který závisí na mnoha faktorech. Zjištění prognostických markerů CLL tak má dnes důležitou roli v přístupu k onemocnění u konkrétního pacienta i ve volbě vhodné terapie. Rozhodujícím prognostickým a prediktivním faktorem jsou aberace v genu TP53. Jejich význam roste v současné době nových léčebných možností u CLL. Zavedení zevrubných genomických přístupů do analýzy CLL vedlo k identifikaci dalších genetických abnormalit, které mohou přispět ke zlepšení stratifikace pacientů s CLL a ke sledování tak zvané klonální evoluce u této nemoci.

Klíčová slova:

chronická lymfocytární leukemie – prognostické faktory – prediktivní faktory – cytogenetika – TP53 – IGHV

ÚVOD

Když jsme v polovině 90. let 20. století léčili pacienta s chronickou lymfocytární leukemií (CLL), měli jsme jen omezené léčebné možnosti. Byl k dispozici chlorambucil, někteří nemocní dostávali kortikoidy, případně chemoterapeutické režimy podobně jako pacienti s lymfomy. Prognóza nemoci byla určována v podstatě jen podle systémů Raie či Bineta [1, 2]. Ve druhé polovině 90. let se začal používat fludarabin v monoterapii. Tento lék jsme považovali za malý zázrak. O to větší bylo naše zklamání, když u mnoha nemocných neměl fludarabin žádný léčebný účinek. Dodnes si tyto pacienty, mnohdy mladé, vybavujeme. Proč tomu tak bylo? První odpověď jsme dostali v roce 1997, kdy byl objeven prognostický význam delece krátkého raménka chromozomu 17, del(17p), tedy prognostická role genu TP53 [3]. V roce 2000 byl publikován první genomický model prognózy CLL [4]. A poté se již vršil jeden objev za druhým, což nakonec vedlo k tomu, že pacienti s CLL dnes žijí daleko déle než před 25 lety. Prevalence nemoci se za posledních 25 let více než zdvojnásobila (data České hematologické společnosti).

Dnes ještě lépe, než kdy dříve víme, že CLL má velmi variabilní klinický průběh závislý na celé řadě biologických, biochemických a genetických faktorů. Klasické prognostické faktory jako věk, pohlaví, klinické stadium, hladina β₂-mikroglobulinu, výskyt somatických hypermutací v genu pro variabilní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu (mutační stav IGHV) a chromozomální aberace jsou využívány v diagnostice již od začátku 21. století a dodnes jsou součástí prognostických modelů či skórovacích systémů [5–9]. Prudký rozvoj genomických technologií v posledních letech, převážně masivního paralelního sekvenování DNA neboli sekvenování nové generace (NGS), však umožnil další detailní analýzy genomu leukemických buněk a nalezení nových genetických markerů, které korelují s prognózou onemocnění a mohou predikovat odpověď na léčbu [10–12]. Celogenomové, resp. exomové sekvenování (WGS/WES) pomohlo identifikovat genetické mutace asociované s rozvojem a progresí onemocnění (tzv. „driver“ mutace), jejichž detekce může přispět k lepší stratifikaci pacientů a optimalizaci volby terapie. Nicméně i přes řadu probíhajících studií byl zatím přímý prognostický a/nebo prediktivní význam prokázán jen u několika genetických abnormalit.

PROGNOSTICKÉ A PREDIKTIVNÍ MARKERY DNES

Zatímco mnoho pacientů s CLL nemá po řadu let klinické příznaky onemocnění, jiní potřebují časný terapeutický zásah a taktéž vykazují rozdílnou odpověď na léčbu. Je zřejmé, že se tyto skupiny pacientů liší přítomností pozitivních nebo negativních prognostických a prediktivních faktorů. U CLL bylo popsáno mnoho prognostických faktorů poskytujících informaci o pravděpodobném vývoji onemocnění, přičemž některé z nich mohou sloužit i jako prediktivní faktory předpovídající efekt vybrané léčby. Avšak ne všechny z prognostických a prediktivních faktorů už byly validovány multivariačními analýzami nebo prospektivními klinickými studiemi. Za účelem definování nejvýznamnějších faktorů bylo pro CLL pacienty vytvořeno několik prognostických skórovacích systémů. Mezinárodní tým vedený prof. Hallekem publikoval metaanalýzu zahrnující data z 8 randomizovaných klinických studií, která identifikovala 5 nezávislých prognostických faktorů: delece a/nebo mutace TP53 genu, přítomnost somatických hypermutací IGHV, hladina sérového β₂-mikroglobulinu, klinické stadium a věk [7, 9, 13]. Tento prognostický index (IPI, International Prognostic Index) tak zahrnuje klinické, biochemické i genetické faktory (tab. 1).

Klinické stadium onemocnění (Rai 0–IV, Binet A-B-C) má přímý vliv na indikaci terapie, avšak neidentifikuje pacienty s vysokým rizikem progrese, a ani nepredikuje odpověď na léčbu. Jako významný prognostický faktor se ukazuje také věk (hranice 65 let), který má významný vliv na celkové přežití pacienta [9]. Z biochemických parametrů se jeví jako nejvýznamnější prognostický faktor sérová koncentrace β₂-mikroglobulinu [14]. Z genetických faktorů je nejdéle využíván tzv. mutační stav IGHV neboli přítomnost somatických hypermutací v genu pro variabilní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu. Mnoho studií jasně prokázalo, že jde o robustní prognostický marker založený na asociaci výskytu nemutovaných/minimálně mutovaných sekvencí IGHV genu s nepříznivou prognózou onemocnění [15, 16]. Mutační stav IGHV ve většině případů není ovlivněn progresí onemocnění, a obvykle je analyzován v počátečních fázích onemocnění – viz aktuální doporučení Evropské CLL organizace (ERIC) [17–20]. Jen vzácně může v průběhu onemocnění dojít ke změně mutačního stavu, obvykle v případě paralelního výskytu více leukemických klonů a v souvislosti s terapií [21, 22]. Zvyšující se prognostický význam má i podrobná imunogenetická charakterizace B-buněčného receptoru (BcR), zejména v souvislosti s terapeutickým využitím inhibitorů BcR dráhy. Analýzou rozsáhlého mezinárodního souboru CLL pacientů bylo zjištěno, že třetina CLL pacientů má tzv. stereotypní B-buněčné receptory [23] seskupené do jednotlivých skupin – tzv. subsetů, které vykazují podobné biologické i klinické vlastnosti – od velmi indolentních subsetů (např. subset 4) až po subsety s velmi agresivním chováním (např. subsety 1 a 2) [24]. Různé subsety stereotypních B-buněčných receptorů také korelují s výskytem různých typů rekurentních genetických mutací [25].

Klíčovou roli při stanovení prognózy CLL má nepochybně také detekce chromozomálních abnormalit pomocí fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Na základě typu genomických aberací bylo definováno pět kategorií: del(17p), del(11q), trizomie 12q, normální karyotyp a samostatná del(13q), přičemž pacienti s del(17p) mají nejkratší medián doby bez terapie [4]. Lokus 17p13 kóduje antionkogen TP53 a jeho delece je často asociována s mutacemi druhé alely genu. TP53 mutace se vyskytují také samostatně, nezávisle na del(17p). Frekvence výskytu dysfunkce TP53 genu se významně liší v závislosti na stadiu onemocnění. Při diagnóze a v počátečních stadiích onemocnění se TP53 defekty vyskytují jen u několika procent nemocných, před první terapií je už TP53 gen inaktivován v 15–20 % případů a u pacientů refrakterních na chemoimunoterapii jsou TP53 abnormality detekovány až u poloviny CLL pacientů [26]. Defekty v genu TP53 jsou v současnosti nejvýznamnějším prognostickým i prediktivním markerem u CLL pacientů. Jsou spojeny s velmi špatnou prognózou a rezistencí na chemoimunoterapii. Mutace v TP53 genu a del(17p) proto musí být testovány vždy před začátkem každé terapie [27, 28], opakované analýzy jsou nezbytné kvůli možné selekci nových mutací v průběhu vývoje onemocnění [27]. Evropská CLL organizace (ERIC) provádí pravidelné certifikace laboratoří provádějících mutační analýzy TP53 genu u CLL, certifikaci už získalo více než 130 laboratoří z 28 zemí včetně ČR. Poslední výzkumy navíc ukazují, že dokonce i minoritní TP53 mutace (přítomné jen v malé frakci – klonu leukemických buněk) detekované pomocí vysoce senzitivní NGS technologie mohou představovat velmi špatnou prognózu [29–31]. O problematice významu minoritních mutací v TP53 genu se v současné době velmi intenzivně diskutuje také v rámci organizace ERIC, která koordinuje prospektivní studii cílenou na objasnění vlivu TP53 mutací přítomných v méně než 10 % leukemických buněk.

Delece 11q22-23 zahrnující gen ATM (ataxia-telangiectasia mutated) má taktéž negativní dopad na prognózu onemocnění, zvláště u starších pacientů. CLL pacienti s bialelickou delecí ATM mají zkrácené období do progrese (PFS) i celkové přežití (OS) [32].

V poslední době se ukazuje, že velmi významným prognostickým a prediktivním faktorem je rovněž přítomnost komplexního karyotypu. Komplexní karyotyp je možné určit pomocí klasického cytogenetického vyšetření, které se provádí kultivací buněk kostní dřeně, ale mnohem častěji kultivací buněk periferní krve. Z důvodů nízké proliferační aktivity nádorových B lymfocytů in vitro se B lymfocyty kultivují po dobu 72 hodin v médiu se stimulačními látkami, jako jsou CpG oligonukleotidy DSP30 a interleukin 2 (IL-2) [33, 34]. Komplexní karyotyp je obecně definován nálezem ≥ 3 nebo ≥ 5 chromozomových změn ve dvou a více metafázích [35–36]. Nepříznivý prognostický význam komplexního karyotypu nálezem 3 a více změn byl u nemocných s CLL opakovaně potvrzen [34–36]. U nemocných léčených ibrutinibem zkracuje například PFS i OS [37]. V poslední době se diskutuje o větším prognostickém významu komplexního karyotypu s nálezem 5 a více změn, a to zejména v kombinaci s defekty TP53 genu. Jaglowski et al. potvrdili, že tento nález nepříznivě ovlivňuje průběh onemocnění u CLL nemocných po alogenní transplantaci [38], Baliakas et al. pozorovali, že nález 5 a více změn nepříznivě ovlivňuje čas do první léčby (TTFT) [39]. Detekce komplexního karyotypu se proto stává součástí rutinní diagnostiky, zejména v souvislosti s možnou aplikací BcR inhibitorů.

Kromě uvedených nejčastěji používaných prognostických a prediktivních faktorů se začínají uplatňovat i další geny, jejichž prognostický význam byl identifikován celoexomovými a celogenomovými NGS analýzami [10, 11, 40]. Bylo prokázáno, že mutace v genech NOTCH1 a SF3B1 korelují s kratším celkovým přežitím CLL pacientů v klinických studiích [41, 42]. Mutace v NOTCH1 genu navíc asociují s kratším intervalem do první terapie (TFS) a vyšším rizikem Richterovy transformace [43]. Defekty v NOTCH1 and SF3B1 společně s mutacemi v dalších genech (BIRC3 nebo MYD88) byly zahrnuty do nových genetických prognostických modelů CLL [44, 45].

Prognostický nebo prediktivní význam dalších faktorů, jako jsou například exprese znaků CD38 a ZAP70, periferní lymfocytóza, infiltrace kostní dřeně nebo solubilní antigen CD23, už v současné době ustupuje do pozadí [8]. Lze naopak předpokládat, že u CLL poroste význam analýzy minimální zbytkové nemoci v průběhu terapie [46, 47]. V posledních letech je také přikládán stále větší význam roli metylací v rozvoji a průběhu onemocnění. Změny v metylačních profilech CLL pacientů byly jasně prokázány už v raných fázích onemocnění a metylační stav některých míst v genomu je také spojen s agresivnějším průběhem nemoci [48].

ZÁVĚR

Heterogenní klinický průběh CLL lze vysvětlit četnými rozdíly v imuno-, cyto- a molekulárněgenetických faktorech. Analýza těchto molekulárních faktorů při stanovení diagnózy a/nebo při progresi onemocnění (před první terapií) a/nebo při relapsu (před následnou terapií) je dnes jednoznačně doporučována (blíže tab. 2).

Využití moderních genomických technologií, především cíleného amplikonového NGS s vysokou citlivostí umožňuje rozkrýt podstatu nádorové heterogenity a klonální evoluce CLL [49] a stále více se stává součástí rutinní diagnostiky onemocnění. Zvyšující se dostupnost celogenomového sekvenování usnadňuje personalizovaný přístup k pacientům a optimalizaci volby terapie [50, 51].

Podíl autorů na přípravě rukopisu

ŠP, MJ, MD – příprava rukopisu

ŠP, MD – závěrečná kontrola rukopisu

Čestné prohlášení

Autoři práce prohlašují, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku nejsou ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou.

Poděkování

Práce byla podpořena grantovými projekty AZV MZ ČR 15-31834A-4/2015, AZV MZ ČR 15-30015A-4/2015 a EATRIS-CZ, reg.č. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001818 financovaného z EFRR.

Doručeno do redakce dne 8. 10. 2018.

Přijato po recenzi dne 13. 11. 2018.

prof. MUDr. Michael Doubek, Ph.D.

Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno

Jihlavská 20

625 00 Brno

e-mail: doubek.michael@fnbrno.cz