Cesta k novým játrům: Decelularizace prasečích jater a jejich znovuosídlení buňkami

Souhrn

Repopulace decelularizované tkáně buňkami je velmi nadějným směrem, kterým by se mohl řešit nedostatek tkání a orgánů pro transplantace, přičemž jaterní tkáňové inženýrství není výjimkou. Decelularizovaný jaterní skelet slouží jako ideální 3D prostředí pro recelularizaci, neboť je v něm zachována tkáňově specifická mikroarchitektura proteinů extracelulární matrix (ECM) s poziční informací jak pro osídlení novými buňkami, tak pro jejich migraci, růst a diferenciaci. Při použití autologních buněk by navíc nově konstruovaný štěp měl postrádat imunogenicitu v hostitelském organismu, bylo by tedy možné se kompletně vyhnout imunosupresi, která je v současnosti nutnou součástí terapie po transplantaci. Tento přehled uvádí příklady dosud provedených decelularizačních a repopulačních experimentů v játrech, přičemž upozorňuje na pokroky a poukazuje na výzvy, které je třeba řešit.

Klíčová slova:

játra – decelularizace – extracelulární matrix – repopulace – transplantace

Úvod

Stále se zvyšující výskyt difuzních i ložiskových onemocnění jater je celosvětovým problémem [1]. Pro mnoho pacientů je jedinou léčebnou možností transplantace jater, kde se ovšem naráží na propastný rozdíl mezi počtem dostupných dárcovských orgánů a počtem lidí, kteří transplantaci potřebují [2]. V případě maligních onemocnění pak je často exkluzivním kritériem lokální rozsah tohoto postižení i přes vyloučení extrahepatálního šíření onemocnění. Intenzivně se proto hledají alternativních řešení, přičemž velké úsilí je soustředěno na vývoj strategií pro tkáňové inženýrství jater s cílem vyrobit funkční tkáň, kterou by bylo možné transplantovat.

Experimentálně byly dosud testovány různé speciální materiálové matrice, a to jak syntetické, tak přírodního původu, které by napodobovaly specifické prostředí jater a jež by bylo možné osídlit buňkami [3]. Pro maturaci a plnou funkčnost jaterní tkáně je však nezbytná kombinace mnoha různých faktorů včetně vytvoření specifické jaterní vaskulatury a žlučovodů. Tato komplexní mikroarchitektura jater přispívá k tomu, že příprava funkčního štěpu jaterní tkáně in vitro stále zůstává velkou výzvou. Tento článek si klade za cíl poukázat na unikátní možnost využití decelularizovaných jater při konstrukci nové tkáně včetně seznámení s nejnovějšími vědeckými poznatky.

Přirozené prostředí decelularizované tkáně

Decelularizovaný jaterní skelet, který má zachovanou strukturní integritu celého orgánu, je velmi dobrým výchozím bodem pro vytvoření nové funkční jaterní tkáně, a tedy i pro případné budoucí klinické aplikace [4]. Extracelulární matrix (ECM) s tkáňově specifickým proteinovým složením a mikroarchitekturou představuje ideální biologický skelet poskytující přirozené podněty důležité pro buněčnou adhezi, migraci, růst a diferenciaci. Recelularizace takového skeletu v ideálním případě buňkami příjemce pak může být elegantním řešením, jak získat vhodnou tkáň pro transplantaci, a zároveň se vyhnout nebo alespoň výrazně eliminovat
imunosupresivní terapii za předpokladu časné přestavby xenogenního skeletu (Obr. 1).

Zásadním faktorem při decelularizaci jater je tedy zachování trojrozměrné struktury ECM, která odráží morfologické znaky jednotlivých jaterních částí. Tyto zahrnují jak intralobulární sinusoidy, prostor pro centrální žílu a niky pro trámce hepatocytů, tak interlobulární vazivo včetně prostoru pro portální žílu, jaterní tepnu a žlučovod, dále pak struktury větších cév. Strukturální proteiny, jako jsou například kolageny (kolagen I, III a IV), laminin a fibronektin, mají ve své přirozené konformaci ve skeletu přístupné specifické vazebné domény jak pro samotné buňky, tak pro různé typy cytokinů a růstových faktorů, které se v extracelulárním prostoru běžně vyskytují a regulují buněčné funkce.

Pokroky v decelularizaci

Během uplynulého desetiletí byla provedena řada studií uvádějících úspěšné protokoly decelularizace pro různé tkáně [5]. V případě jater byly decelularizovány orgány jak z malých zvířat (myš, potkan nebo fretka) [6–8], tak z velkých zvířat (prase, ovce) [9–11]; příklad prasečích jater decelularizovaných na našem pracovišti před decelularizačním procesem a po něm je uveden na Obr. 2.

Byl rovněž připraven skelet z lidských jater [12]. Převážná většina těchto postupů byla provedena perfuzí přes portální žílu ex vivo, jsou však i práce poukazující na možnosti in vivo decelularizace [13]. Přehled vybraných decelularizačních protokolů pro játra včetně použitých typů roztoků a délky trvání celého procesu je uveden v Tab. 1.

Kvalita decelularizovaného skeletu je posuzována dle několika kritérií, z nichž zásadní je ověření, že materiál neobsahuje žádné buňky ani jejich části, zejména DNA. Nejčastěji se používají histologické techniky, jako jsou například barvení hematoxylinem a eosinem (H&E) (Obr. 3a,b), barvení Massonovým trichromem a/nebo imunohistochemie (IHC) (různé kolageny, laminin, fibronektin nebo elastin), a dále hodnocení celkového množství DNA [10,14–16]. Hodnocení je někdy doplněno snímáním rastrovací elektronovou mikroskopií (SEM) (Obr. 3d), fluorescenčním barvením specifických proteinů (Obr. 3e), hodnocením obsahu glykosaminoglykanů a analýzou proteinového složení Western blotem (WB), případně proteomicky [8,14,16,17]. Dále je možné testovat mechanické vlastnosti skeletu, vizualizuje se kostra cévního systému nebo je kvantifikována retence růstových faktorů, jako jsou vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF) nebo základní fibroblastový růstový faktor (bFGF) [17–19].

To vše představuje obsáhlý soubor testů, které z různých pohledů popisují decelularizovaný materiál. Dosud však nebyla dostatečná pozornost věnována detailní proteinové struktuře skeletu, a proto je nedostatek informací o tom, zda jsou po decelularizaci a vystavení detergentům jednotlivé proteiny stále ve skutečně přirozené konformaci ve smyslu dostupnosti specifických vazebných domén. To je zvláště důležité pro buněčnou adhezi, kterou umožňuje interakce membránových proteinů integrinů právě s vazebnými motivy ECM proteinů, případně pro zachycení různých růstových faktorů, které mohou následně stimulovat například buněčný růst či diferenciaci [20]. Zkoumání složení proteinů ve funkčně odlišných částech skeletu a specifické konformace proteinů, které přitahují různé typy buněk, by vedlo k poznání informací o poloze pro repopulační buňky. To by mohlo vrhnout světlo na mechanismy interakce protein-buňka ECM a mohlo by pomoci objasnit, zda to znamená, že sinusový lumen skeletu může být repopulován přednostně endotelovými buňkami, nebo zda hepatocyty upřednostňují vnější stranu sinusové sítě k jejímu vnitřnímu povrchu.

Ačkoli většina dosud publikovaných protokolů decelularizace umožnila získat acelulární skelet, studie obecně postrádají systematický přístup za použití různých více či méně toxických roztoků detergentů v různých koncentracích. Stejně tak se protokoly velmi liší, co se týká doby, po kterou decelularizace probíhá, a kdy je tedy skelet v přímém kontaktu s detergenty. Publikované procesy trvají v rozmezí od několika hodin po několik dnů, někdy i týdnů [12,14,15]. Prodloužený kontakt proteinů ECM s detergenty je však sporný, protože detergenty mohou modifikovat jemnou strukturu a konformaci přítomných proteinů. Zatím nejrychlejší perfuzní protokol publikovaný pro prasečí játra (velikostí orgánu odpovídající velikosti lidských jater) trval 7 hodin, kdy byl proces prováděn za podmínek oscilujícího tlaku za použití složité aparatury [10].

Naše laboratoř se nedávno začala věnovat decelularizaci prasečích jater se zaměřením na optimalizaci protokolu zejména ve smyslu zkrácení doby, kdy je jaterní skelet vystaven působení detergentů. Zároveň se zabýváme vývojem metodiky posuzování kvality decelularizovaného skeletu včetně vývoje počítačového softwaru, který by umožnil kvantitativně hodnotit, do jaké míry jsou zachovány jednotlivé morfologické struktury klíčové pro následné osídlení buňkami.

Úspěchy a úskalí repopulace

Samotný získaný skelet by postrádal klinické využití, vědci se proto různými způsoby snaží vpravit do něj nové buňky, udržet je naživu a případně přimět je se namnožit. Byly testovány různé způsoby osidlování, přičemž mezi nejjednodušší patří takzvaný „drop seeding“ (aplikace buněk na povrch materiálu), případně injekční vpravení buněk do skeletu. Obr. 4 ukazuje jaterní skelet z prasete s namnoženými buňkami potkaního endotelu a), jakož i s čerstvě přisedlými buňkami linie HepG2 b) z pilotních repopulačních experimentů v naší laboratoři. Oba způsoby osídlení mají neocenitelnou roli například při studiu buněčné adheze ke skeletu. Z pohledu vytváření tkáňové struktury ve 3D se ovšem projeví jejich nevýhody, jako je malý stupeň penetrace buněk do hlubších vrstev skeletu v případě aplikace na povrch, případně poškození jemné struktury skeletu v místě injekční aplikace. Jako nejpraktičtější způsob se tedy nabízí repopulace pomocí perfuze.

Většina pokusů o repopulaci decelularizované tkáně byla provedena na potkaních modelech. Uygun et al. v roce 2010 popisuje repopulaci potkaního skeletu hepatocyty potkana [16]; jaterní skelety potkanů byly také repopulovány myšími hepatocyty, potkaními mezenchymálními kmenovými buňkami (MSC) a lidskými endotelovými buňkami umbilikální žíly (hUVEC) [21–23]. Myší jaterní skelet byl použit jako matrice pro lidské kmenové buňky [24], zatímco potkaní skelet pro prasečí pluripotentní kmenové buňky indukované na hepatocyty (iPSC-Heps) [25]. Jaterní skelet izolovaný z fretek byl rovněž testován na repopulaci lidskýmifetálními jaterními buňkami a hUVEC [8]. Skelet prasečích jater byl použit v několika studiích buď jako celý orgán [26], nebo jako jeden lalok [27]. Většina těchto experimentů využívala jako vstupní bránu pro buněčnou infuzi systém portální žíly, byla ale také testována infuze žlučovými cestami [21,28]. Po aplikaci buněk obvykle následovalo několik dní in vitro kultivace a v několika případech byla repopulovaná tkáň implantována pokusnému zvířeti za účelem monitorování jak osudu implantované tkáně in vivo, tak i reakce hostitele. Reprezentativní přehled repopulačních experimentů je uveden v Tab. 2.

Tyto experimenty jednoznačně představují velký pokrok v tkáňovém inženýrství; poukazují však i na klíčová omezení, která je ještě třeba řešit. Jedním z problémů je právě nerovnoměrná distribuce a/nebo agregace buněk ve skeletu po aplikaci; slibným přístupem k překonání tohoto problému může být vícestupňová aplikace buněk [6,27]. Dalším závažným problémem je, že skelety jsou náchylné k trombóze, když jsou následně po znovuosídlení vystaveny systémovému oběhu; toto poukázalo na důležitost reendotelizace skeletu před opětovným zavedením hepatocytů. Nedávné studie prokázaly, že vysoká trombogenicita může být částečně redukována heparinizací potkaního skeletu [27] a že stabilizované krevní perfuze lze dosáhnout u reendotelizovaného prasečího skeletu in vivo až po dobu 24 hodin [26]. Nicméně i přes veškerou snahu zůstává hlavní překážkou dlouhodobá perfuze. Jako maximální dosažená doba bezproblémové perfuze je uváděno 72 hodin [15,29], což je s ohledem na budoucí použití tkáně pro transplantaci stále příliš málo. Výzkum však pokračuje vývojem speciálních bioreaktorů, které by dlouhodobou kultivaci in vitro umožňovaly.

Závěr

Na základě literárního přehledu a našich vlastních výsledků je jasné, že je nutné detailně zkoumat strukturu samotného decelularizovaného skeletu a jeho interakce s jednotlivými buněčnými typy, aby bylo možné dosáhnout optimalizace protokolu znovuosídlení tohoto přírodního materiálu. Vícestupňové řešení definovaných problémů konstrukce recelularizovaných jater předpokládá postupný vznik parciálních orgánových perfuzních soustav, které budou schopny eliminovat trombogenicitu a dále zajistit recelularizaci v optimální buněčné hustotě. Zde předpokládáme i nutnost využití in vitro kultivace buněk – progenitorů v bioreaktorech a následné využití extrakorporální perfuze orgánu k optimalizaci lokace osidlujících buněk, jejich proliferace a diferenciace v cílové efektorové buňky. In vivo testování těchto nově osídlených štěpů ve smyslu sledování jaterních funkcí a vhojení je dalším nezbytným krokem na cestě k vytvoření jaterní tkáně, která bude finálně použitelná v klinické praxi.

Poděkování

Autoři děkují prof. Utě Dahmen z Univerzitní kliniky v Jeně za laskavé poskytnutí potkaních endotelových buněk a dr. Sandorovi Nietzschemu z Centra elektronové mikroskopie v Jeně za umožnění SEM analýzy. Práce je finančně podporována projekty MŠMT „Aplikace moderních technologií v medicíně a průmyslu“ (AMTMI, CZ.02.1.01/0.0/0.0/17_048/0007280) a Národní program udržitelnosti NPU I č. LO1503, a rovněž projektem Univerzity Karlovy UNCE/MED006 „Centrum klinické a experimentální jaterní chirurgie“.

Konflikt zájmů

Autoři článku prohlašují, že nejsou v souvislosti se vznikem tohoto článku ve střetu zájmů a že tento článek nebyl publikován v žádném jiném časopise.

doc. MUDr. Václav Liška, PhD

Chirurgická klinika a Biomedicínské centrum,

LF UK v Plzni

Alej Svobody 1655/76

e-mail: liskav@fnplzen.cz