Transplantace tenkého střeva v experimentu

Souhrn

Cíl:
Transplantace tenkého střeva je ustálená léčebná metoda pro pacienty se selháním tenkého střeva. Cílem studie bylo zvládnout chirurgickou techniku, optimalizovat imunosupresivní režimy, diagnostikovat akutní celulární rejekci štěpu na základě celulárních a humorálních ukazatelů.

Metody:
Celkem jsme provedli 43 transplantací na praseti. První – chirurgická část experimentu byla zaměřena na zvládnutí dvou základních způsobů cévní anastomózy – napojením štěpu na mezenteriální řečiště (skupina n1 = 18) a napojení štěpu na aortu a dolní dutou žílu (skupina n2 = 25). Druhá část experimentu byla zaměřena na hodnocení rejekčních změn při odlišných způsobech imunosuprese. K hodnocení byla použita pouze zvířata, která nezemřela z důvodu technického selhání nebo interních příčin (n= 24). Zvířata byla rozdělena do čtyř skupin (A (n = 3) – autotransplantace, bez imunosuprese; B (n = 7) a C (n = 8) – allotransplantace s imunosupresí tacrolimem resp. v kombinaci se sirolimem; D (n = 6) – allotransplantace bez imunosuprese.

Diagnostika rejekce byla provedena histologickým vyšetřením z biopsie štěpu. Jako neinvazivní humorální ukazatel poškození štěpu jsme vyšetřovali hladinu plazmatického citrulinu.

Výsledky:
Při hodnocení techniky transplantace došlo v první skupině k technickým komplikacím u 12 (67 %) zvířat, ve druhé pouze u 3 (12 %). Při hodnocení rejekčních změn bylo nejdelší přežívání dosaženo u autotransplantací, nejmenší u allotransplantací bez imunosuprese. V obou léčených skupinách jsme významný rozdíl v délce přežívání nezaznamenali (p < 0,05). Ve skupině C byl nižší počet celulárních rejekcí oproti skupinám B a D.

Závěry:
Experiment umožnil zvládnutí techniky odběru a následné transplantace s menším množstvím chirurgických komplikací v případě vaskulární drenáže do centrálního řečiště. V rámci imunosupresivních režimů jsme nezaznamenali významnější rozdíl při použití monoterapie tacrolimem oproti kombinaci se sirolimem. Histologické hodnocení je zlatým standardem diagnostiky celulární rejekce. Stanovení hladiny plazmatického citrulinu nemá pro bezprostřední hodnocení rejekce význam.

Klíčová slova:
transplantace tenkého střeva – parenterální výživa – akutní celulární rejekce – citrulin – imunosuprese

ÚVOD

Transplantace tenkého střeva (TTS) je v dnešní době ustálená léčebná metoda pro pacienty se selháním střeva. Její počátky se datují do padesátých let minulého století. K jejímu většímu rozvoji došlo až na přelomu tisíciletí v závislosti na rozvoji imunosuprese. V současné době se transplantace provádí v 65 transplantačních centrech. Celkem bylo provedeno přes 1 300 transplantací včetně transplantací multiviscerálních. V zemích bývalé Východní Evropy se transplantace dosud neprovádí.

Při srovnání s transplantací parenchymových orgánů je TTS zatížena vyšším počtem komplikací s celkově horšími výsledky co do délky přežívání pacientů i štěpů. To je způsobeno náročností chirurgické techniky a zároveň složitostí imunitních dějů. Střevo představuje největší imunitní orgán v lidském těle. Nicméně existuje určité procento pacientů, u kterých TTS představuje život zachraňující výkon a je poslední alternativou. Historie transplantace tenkého střeva v České republice se datuje do poloviny minulého století, kdy byly provedeny první experimenty na psech [1]. Od počátku století bylo publikováno několik článků zabývajících se převážně problematikou ischemicko-reperfuzního poškození štěpu v experimentu [2, 3].

Logickým završením experimentální práce byl rozsáhlý experiment transplantace tenkého střeva na velkém laboratorním zvířeti. Cílem bylo zvládnutí odběru štěpu, jeho konzervace a následná transplantace. Bioptický materiál se stal základem pro histologické hodnocení akutní celulární rejekce (ACR). Otázka ideální imunosuprese po TTS není stále vyřešena, proto jsme zvolili dva odlišné imunosupresivní režimy s cílem zjištění optimální léčby. Histologická diagnostika ACR představuje zlatý standard. Jako neinvazivní metodu diagnostiky ACR jsme zkoumali přínos stanovení hladiny plasmatického citrulinu.

V průběhu experimentu se formuloval multidisciplinární tým, který je základem pro zahájení klinického programu TTS v České republice.

MATERIÁL A METODIKY

V experimentu byla použita inbrední linie prasete domácího Sus scrofus domestici (n = 43), hmotnosti 30–35 kg. Prasata jsou standardním modelem velkého zvířete pro transplantaci. Jsou relativně rezistentní k imunologickým inzultům. Gastrointestinální trakt prasete má nevelké anatomické odlišnosti a analogické fyziologické funkce [4].

Práce s laboratorními zvířaty probíhala na základě schváleného projektu pokusu s povolením Ministerstva zdravotnictví České republiky číslo 1/ 2006 podle § 23 odst. 1 písm. a) zákona č. 246/1992 Sb. ve znění vyhlášky č. 207/2004 Sb., o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat. Zvířata byla před zahájením pokusu ustájena ve zvířetníku IKEM po dobu týdenní karantény.

Experiment byl zaměřen dvěma směry. V první – chirurgické části jsme se zabývali problematikou odběru, konzervace a následné transplantace tenkého střeva. V druhé části jsme hodnotili přežívání prasat v závislosti na podávané imunosupresi.

Pro hodnocení chirurgické části experimentu byla zvířata rozdělena na dvě skupiny podle technického provedení výkonu. U první skupiny n1 = 18 zvířat byla transplantace prováděna tak, že jedno zvíře bylo současně dárcem a zároveň příjemcem štěpu od druhého zvířete. Cévní rekonstrukce byla provedena na vlastní portomezenterické řečiště. Ve druhé skupině n2 = 25 se jedno prase stalo dárcem štěpu a druhé příjemcem s tím, že cévní rekonstrukce byla provedena na centrální řečiště – aortu a dolní dutou žílu (Obr. 1). Podrobný chirurgický postup byl popsán jinde [5].

Pro hodnocení výsledků experimentu z hlediska podávané imunosuprese, celulární rejekce a vlivu plazmatické hladiny citrulinu na diagnostiku ACR, jsme zvířata rozdělili na pět experimentálních skupin (Tab. 1). Z hodnocení byla vyřazena zvířata, která zemřela v důsledku technického selhání anastomózy bezprostředně po výkonu a zvířata, která zemřela do 72 hodin po transplantaci z jiných příčin (anafylaktický šok po podání antibiotik, bronchopneumonie se zachovaným cévním zásobením štěpu, perforace střeva) celkem 19 prasat.

Technické chyby (selhání) v experimentální oblasti jsou popisovány v 10–50 % zejména v období „learning curve“ [6, 7].

Operační výkon (odběr, transplantace) byl proveden v celkové inhalační anestezii s řízenou ventilaci (přístroj, Chirana Venar Media) v poloze zvířete na zádech, s neinvazivní monitorací vitálních funkcí (EKG, SO2, kapnometrie, tělesná teplota). Patnáct minut po premedikaci (Azaperon (Stresnil) 4 mg/kg + 10% Ketamin 10 mg/kg + Atropin 0,01mg/kg i. m.) byla zahájena indukce do anestezie (Fentanyl 1 ml/10 kg + Midazolam 1 mg/10 kg + 1% Propofol 3 mg/kg). Po zajištění dýchacích cest orotracheální intubací, byla použitá inhalační směs AIR + O₂ + Isofluran 1 – 2% (df: 15–20/min, I:E 1:2), potencovaná kontinuálně i. v. podávaným Fentanylem v dávce 2ml/10kg/hod., bez nutnosti použití kurarimimetik. Výkon byl proveden v antibiotické cloně (Amoksiklav (Sinulox^®) 30 mg/kg).

U skupiny B byla imunosuprese zahájena první dávkou intravenózního tacrolimu s reperfuzí štěpu v dávce 0,3 mg/kg. Od prvního pooperačního dne jsme podávali dávku tacrolimu 0,6 mg/kg/den rozdělenou do dvou dávek po 12 hodinách podaných do zavedené gastrické sondy. Ve skupině B jsme hladinu tacrolimu udržovali v rozmezí 15 ng/ml ± 5 ng/ml podle měřené sérové hodnoty. Ve skupině C jsme od prvního pooperačního dne podávali do sondy tacrolimus v dávce 0,1 mg/kg/den ve dvou dávkách a jednu dávku sirolimu 0,1 mg/kg/den s cílem udržení hladiny tacrolimu 7–10 ng/ml a hladiny sirolimu v rozmezí 5–10 ng/ml.

Ve dnech 0, 3, 5, 7, 10, 14, 20, 28, 30 jsme u všech zvířat odebrali biopsie z pojistné ileostomie a krev k dalšímu hodnocení. Krev byla následně centrifugována a plazma odebrána k laboratornímu zpracování.

Bioptické vzorky byly zpracované parafinovou technikou podle standardního protokolu. Získané 3–4 μm silné řezy byly barvené hematoxylinem-eozinem (H&E) a PASem. Rejekční změny byly hodnoceny podle kritérií používaných v experimentu pro velká zvířata v modifikaci využívající zkušenosti z humánní patologie [8–10].

Morfologické znaky akutní celulární rejekce (ACR) se opírají o diagnostickou trias:

1. přítomnost zánětlivé celulizace v lamina propria sliznice,
2. poškození epitelu,
3. apoptotická tělíska.

Akutní celulární rejekci jsme hodnotili podle čtyř stupňů závažnosti, které zobrazuje tabulka 2.

Analýzu citrulinu v plazmě jsme prováděli metodou ion-exchange chromatografie na přístroji firmy Beckman Amino Acid Analyzer (Beckaman Coulter, Fullerton, CA USA). Aminokyseliny vzorku deproteinované plazmy se dělí na koloně katexu v systému kapalinové chromatografie, po výstupu z kolony reagují s ninhydrinem a barevné produkty jsou detekovány fotometricky. Identifikace a kvantifikace se provádějí metodou vnějšího standardu.

Vyšetření bylo provedeno v laboratoři dědičných a metabolických chrorob Univerzity Karlovy. Referenční hodnoty se pohybují v rozmezí 5–50 μmol/l. Mez detekce je 0,6 μmol/l; mez kvantifikace 2,2 μmol/l. Na základě předchozích studií byla hladina cut off stanovena na 30 μmol/l. U všech zvířat jsme měřili absolutní hodnoty.

K statistickému hodnocení veličin byl použit průměr a střední chyba průměru. K testování veličin byla použita ANOVA a metoda kontrastu, pro ACR skóre byl použit Kruskal-Wallisuv test. Všechny použité testy byly dvoustranné a jako významné považujeme p < 0,05. K výpočtům byl použit statistický software SYSTAT.

VÝSLEDKY

V technické části experimentu převažovaly chyby spojené s konstrukcí cévní anastomózy. Zejména v první skupině skupině n1 (18 zvířat), kde jsme použili techniku, kdy jedno zvíře je dárcem štěpu, a zároveň i příjemcem od zvířete druhého byly komplikace časté (12 z 18 tj. 67 %). Po změně techniky, kdy jsme jedno zvíře použili jako dárce a druhé jako příjemce jsme nezaznamenali ani jednu okluzi anastomózy a k technickému selhání došlo jen u tří zvířat z důvodů krvácení (3 z 25 tj. 12 %).

Pro hodnocení vlivu imunosuprese na ACR a hodnocení vztahu hladiny plazmatického citrulinu k ACR byla zvířata rozdělena na skupiny A–D. Charakteristika souboru a délka přežívání v jednotlivých skupinách je zobrazena v tabulce 3.

Nejdelší délka přežívání byla ve skupině A (autotransplantace) a nejmenší ve skupině D (alotransplantace bez imunosuprese).

Průměrná doba přežívání a střední chyba průměru v jednotlivých skupinách je zobrazena v grafu 1.

Z hlediska celkového přežívání jsme prokázali statisticky významný rozdíl mezi přežíváním skupin A, B a C oproti skupině D, která neměla podávanou imunosupresi, a proto u ní rychle docházelo k rozvoji a progresi akutní celulární rejekce s následnou bakterielní translokací a vznikem sepse. Přežívání ve skupinách A, B a C oproti skupině D se lišilo na hladině významnosti p (A, B, C: D) < 0,01; 0,05; resp. 0,01.

Hodnocení akutní celulární rejekce v histopatologii

Celkem bylo vyšetřeno 153 bioptických vzorků sliznice střevních štěpů. Výsledky jsou shrnuty v grafu 2.

Ve skupině C (kombinovaná IS) byl nižší počet rejekčních epizod, které byly mírnějšího stupně než ve skupinách B (tacrolimus) a D (bez IS). Statisticky významného rozdílu bylo dosaženo 3., 5. a 7. pooperační den na hladině významnosti p < 0,05. Žádné ze zvířat ve skupině A (autotransplantace) nemělo morfologické známky rejekce. Všechna zvířata ve skupině D (bez IS) měla od 3. dne morfologické znaky rejekce, které rychle progredovaly do těžkých forem s následným rozvojem sepse a uhynutím zvířat. Třetí stupeň ACR představoval nejzávažnější poškození, které bylo dobře patrné na slizničním povrchu a na seróze (Obr. 2, 3).

Hodnocení hladiny citrulinu

Průměrné předoperační hladiny citrulinu se pohybovaly kolem 40 ± 10 μmol/l. Třicet minut po reperfuzi se již projevovaly I/R změny sliznice s její dysfunkcí. To se odrazilo v poklesu hladiny citrulinu ve všech sledovaných skupinách. U skupiny autotransplantovaných zvířat, kde nedocházlo k rozvoji ACR jsme po odeznění I/R poškození sliznice pozorovali její postupnou regeneraci. Tento nález dobře koreloval s naměřenými hladinami plazmatického citrulinu, které se rychle vracely k normálním hodnotám, na kterých se udržely až do konce experimentu. U zvířat po allotransplantaci s podávanou imunosupresí docházelo od třetího dne k mírnému vzestupu hladiny citrulinu, která dosahovala kolem pátého až sedmého dne hladin blízkých normě. U skupiny D (allotransplantace bez imunosuprese) však vlivem rozvoje rejekčních změn docházelo k plynulému poklesu hladiny citrulinu, který přímo souvisel s postupnou ztrátou enterocytů. Tento pokles byl v porovnání s kontrolní autotransplantovanou skupinou prokazatelný již od třetího dne na hladině významnosti p < 0,05. Ve skupině B byl v porovnání se skupinou D patrný statisticky významný rozdíl (p < 0,05) pátý a sedmý den. Ve skupině C oproti skupině D byl desátý pooperační den patrný významný statistický rozdíl na hladině p < 0,05.

Dynamiku hladiny plasmatického citrulinu (PCL plasma citrulline level) v průběhu pooperačních dnů zobrazuje graf 3.

Závislost hladiny citrulinu na ACR

Při hodnocení ACR skóre společně pro všechny vyšetřované skupiny s výjimkou kontrolní skupiny A (autotransplantace, bez ACR), jsme pozorovali lineární trend poklesu průměrné hladiny citrulinu ve vztahu k progresi histologických rejekčních změn na hladině významnosti p < 0,009. S významnou progresí ACR úměrně klesala hodnota naměřené hladiny citrulinu pro všechny skupiny společně (Graf 4).

DISKUSE

Odběr štěpu tenkého střeva, jeho konzervace a následná transplantace je složitý výkon, který má za následek rozvoj mnoha komplexních dějů, které spolu vzájemně souvisí a navzájem se ovlivňují. Ačkoliv většina pozornosti je soustředěna na problematiku imunologickou, chirurgická technika představuje vysoce náročný výkon, který významně ovlivňuje další osud štěpu a v konečném důsledku i celkový průběh transplantace. Chirurgická problematika je soustředěna do několika fází, kterými jsou odběr štěpu, jeho konzervace a vlastní transplantace.

Na základě provedené analýzy můžeme konstatovat, že oba použité způsoby rekonstrukce cévní anastomózy (na vlastní portomezenteriální řečiště resp. na centrální řečiště- aortu a dolní dutou žílu) jsou v experimentálním modelu možné, ale první z nich byl spojen s vysokým výskytem komplikací. Malý průměr cévní spojky našité na vlastní mezenteriální řečiště měl za následek její okluzi. Mnohem častější komplikací ale bylo její úplné uzavření v důsledku torze celého štěpu.

Anastomóza na trávicím ústrojí byla provedena u všech zvířat standardní technikou pomocí pokračujícího jednovrstevného seromuskulárního stehu vstřebatelným materiálem. Ani v jednom případě jsme nezaznamenali žádnou komplikaci s hojením digestivních spojek, ačkoliv zejména u zvířat skupiny D docházelo velmi časně k těžkému rejekčnímu poškození celé stěny střeva. Tento způsob šití anastomózy se ukázal jako velmi bezpečný [11].

V části experimentu, který byl zaměřen na hodnocení akutní celulární rejekce jsme porovnávali dvě skupiny zvířat s rozdílnou imunosupresí: s monoterapií tacrolimem (skupina B) a kombinovanou IS tacrolimus, sirolimus (skupina C). Kontrolními skupinami byla zvířata, u kterých byla provedena autotransplantace (skupina A) a skupina allotransplantovaných zvířat bez podávané imunosuprese (skupina D).

I když se počet a stupeň rejekčních epizod lišil mezi skupinami B a C ve prospěch skupiny C, nebylo dosaženo statistické významnosti. Podobně v průměrné délce přežití bylo u skupiny s kombinovanou IS dosaženo příznivějšího výsledku 25 dní versus 20 dní u skupiny s monoterapií. Ani zde nebylo dosaženo statistické významnosti. V krátkodobém experimentu jsme neprokázali statisticky významný rozdíl mezi podávanou imunosupresí v monoterapii tacrolimem oproti kombinované léčbě tacrolimem a sirolimem.

Jak v experimentu, tak v klinice je pro osud pacienta rozhodující včasné odhalení ACR a její agresivní léčba. Rejekční změny ve štěpu se histologicky projevují kombinací znaků (porucha architektury sliznice, poškození epitelu, apoptotická tělíska a zánětlivá celulizace v lamina propria). Ve většině případů, se zvyšujícím se stupněm rejekce, tyto změny narůstají v kvantitě a mění se v kvalitě (charakter zánětlivé celulizace). Klíčovým znakem je rozpoznání tzv. blastického/rejekčního typu zánětlivé celulizace, která je obvykle smíšená s převahou lymfoidních elementů a s příměsí polynukleárů. Pokud jsou polynukleáry v převaze a doprovází je průnik do epitelu (tzv. kryptitida), je třeba na prvním místě pátrat po infekci. Kryptitida je nespecifickým znakem, který může být morfologickou součástí projevů různých střevních zánětů a jako izolovaný znak nemůže být použit jako kritérium rejekce. Eozinifily jsou běžně identifikovány ve sliznici střeva, ale jejich vyšší výskyt spolu s aktivovanými lymfocyty je vysoce suspektní z rejekce a vede k cílenému pátrání po dalších rejekčních znacích zvláště po apoptotických tělíscích. Také zánětlivá celulizace postihující venuly s perivenulárně akcentovanou zánětlivou celulizací je znakem, který podporuje diagnózu ACR. V morfologii je situace po TTS od jiných transplantací solidních orgánů odlišná v několika ohledech. Jedním z nich je velmi rychlá progrese rejekce do těžkých nevratných stupňů s ulceracemi a úplnou destrukcí střevní stěny. V našem experimentu u několika zvířat ve skupině D došlo ke změně z ACR 1. stupně do ACR 3. stupně během 48 hodin. Druhým faktorem je fakt, že v biopsiích štěpů střeva prakticky neexistuje normální nález. Téměř vždy je přítomná smíšená zánětlivá celulizace s minimálním poškozením epitelu, což odráží imunitní aktivaci po TTS. Časně po TTS může být problémem odlišení I/R poškození od počínajících mírných rejekčních změn. I když I/R poškození postihuje převážně horní vrstvy sliznice a také se liší v kvalitě zánětlivé celulizace, bylo jeho odlišení od minimálních rejekčních nálezů problematické a v procesu diferenciální diagnózy byl určující klinický údaj, tj. znalost časového intervalu od TTS.

Pro posouzení funkčního stavu různých orgánů existují standardizované laboratorní testy (jaterní testy u jater, hladina kreatininu u ledvin). Zcela odlišná je situace v oblasti hodnocení funkce střeva, kde objektivizovat funkci laboratorními metodami je dosud nemožné. V několika posledních letech se jako jeden z perspektivních markerů, který by se pravděpodobně dal využít pro identifikaci poškození enterocytů, zdá být citrulin. Citrulin je nebílkovinná aminokyselina, které vzniká v enterocytech konverzí z glutaminu a odtud se dále vyplavuje do krevního oběhu. Jeho podrobnější význam pro definitivní diagnostiku selhání střeva jsme publikovali jinde [12]. Zdá se tedy, že koncentrace citrulinu v plasmě může být ukazatelem množství fungujících buněk epitelu střeva, a tak by mohlo měření koncentrace citrulinu přispět k diagnostice rejekce [13]. V tomto experimentu by plazmatické hladiny citrulinu nemohly být využity jako ukazatel poškození sliznice u mírných forem rejekce. Hlavním důvodem je to, že rejekcí je nejprve postižena dolní části sliznice, kde zpočátku narůstá mononukleární zánětlivá celulizace a vlastní poškození enterocytů je fokální a mírné. Proto se zdá logické, že mírné fokální poškození enterocytů, navíc v dolní časti sliznice, kde je syntéza citrulinu malá, nebude mít významnou odezvu v sérové hladině uvolňovaného citrulinu. Navíc v období časně po TTS, kdy tento experiment probíhal, do hry vstupuje i I/R poškození, které naopak postihuje epitel v horních částech střevní sliznice. To se odráží v přechodném poklesu hladiny citrulinu v prvních dnech po TTS. Také náš experiment ukázal, že během prvního dne po TTS došlo k poklesu hladiny citrulinu u všech operovaných zvířat, jako součást reakce na I/R poškození.[14]. Poté u kontrolní skupiny s autotransplantací (A) i u obou skupin léčených imunosupresí (B a C) docházelo k pozvolnému vzestupu plazmatických hladin citrulinu. Naopak skupina bez imunosuprese (D) vykazovala trvalý pokles hladiny až k velmi nízkým hodnotám (pod 10 Ķmol/l). Byl prokázán linearní trend poklesu průměrné hladiny citrulinu, p = 0,009 vázaný na progresi rozsahu ACR (0 až 3).

Ve dnech 5. a 7. se statisticky odlišovala skupina B od D p < 0,05 a pro den 10 skupina C od D kdy p < 0,05.

Přestože se zdá, že krátce po transplantaci je interpretace mírného poklesu hladiny citrulinu v plazmě obtížně diagnosticky interpretovatelná, v pozdějším období by stanovení hladiny citrulinu mohlo představovat významný diagnostický přínos. Časně po transplantaci je střevo dobře přístupné endoskopickým kontrolám z chirurgicky vytvořené stomie a provedení biopsie s následnou histologickou diagnózou nepředstavuje velkou zátěž pro pacienta. Jiná je situace v pozdějším období po TTS, kdy je stomie zanořená a jakýkoli neinvazivní marker, který by přispěl k diferenciálně diagnostické rozvaze o příčinách dysfunkce, by tak významně přispěl k včasné diagnóze.

ZÁVĚR

Z chirurgického hlediska byl experiment významným přínosem pro zvládnutí odběru tenkého střeva, jeho konzervace a techniky cévních anastomóz. Z morfologického hlediska umožnil získat zkušenosti s histologickou diagnostikou rejekčních změn. Hladina plazmatického citrulinu se neukázala jako významný neinvazivní marker pro časnou diagnostiku rejekce po transplantaci. Dominantní roli zde hraje diagnostika morfologická. Spolupráce na rozsáhlém experimentu umožnila vytvořit tým odborníků připravených zahájit klinický program transplantace tenkého střeva v České republice.

MUDr. M. Oliverius

Klinika transplantační chirurgie IKEM

Vídeňská 1958/9

140 21 Praha 4