Změny hladiny metalothioneinu u pacientů se zhoubným nádorem prostaty – pilotní studie

Souhrn

Cíl studie: V pilotním experimentu analyzovat metalothioneinu (MT) ve vzorcích moči pacientů se zhoubným nádorem prostaty (CaP).
Metody: Vzorky byly analyzovány elektrochemicky metodou diferenční pulzní voltametrie (DPV) vBrdičkově základním elektrolytu. Získaná data byla vyhodnocena jako plochy pod křivkou (AUC). Koncentrace MT bylyvyhodnoceny metodou kalibrační křivky.
Výsledky: Metallothioneiny jsou proteiny o molekulové hmotnosti kolem 10kDa. Jejich biologická role je především v udržování homeostázy iontů kovů v organismech. Analytické stanovení je komplikované. Mezi nejvhodnější metody patří elektrochemie. Uvedené metodické přístupy jsme aplikovali nasledování změn obsahu MT u pacientů s CaP a zbytnělou prostatou. V pilotním experimentu jsme zjistili, že průměrnáhladina MTu: a) kontrolní skupiny (n = 13) byla 2,9 ± 1,2 µg/mmol kreatininu; b) benigní hyperplazie prostaty 4,7 ± 1,7 μg/mmol kreatininu; c) CaP skupina (n = 9) 6,7 ± 1,5 µg/mmol kreatininu. Rozdíl mezi kontrolní skupinou a skupinouCaP byl statisticky průkazný (p = 0,0099). Mezi benigní hyperplazií prostaty a CaP byl také prokázán rozdíl (p =0,0928). Signály u pacientů s benigní hyperplazií prostaty (BHP) nevykazují statisticky významný rozdíl proti kontrolnískupině (p = 0,7869).
Závěr: Získané prvotní výsledky naznačují, že hladiny MT lze v moči stanovit elektrochemicky. Mezi testovanými skupinami se podařilo prokázat rozdíly. Hladiny MT u pacientů s CaP byly zvýšené, ale musejí být dále detailněji studovány.

Klíčová slova:

oxidační stres – thiolové sloučeniny – metalomika – elektrochemické metody

ÚVOD

Metalothionein (MT) náleží do rodiny metaloproteinů, které jsou široce rozšířeny v živočišné říši, nicméně podobné typy proteinů byly popsány i u bakterií rostlin a hub. Jedná se o nízkomolekulární (6–10 kDa) na cysteiny bohaté proteiny, které neobsahují žádné aromatické aminokyseliny (1). Asi 30 % hmotnosti tvoří aminokyselina cystein, která vytváří charakteristické rysy MT (obr. 1). Právě díky sulfhydrylovým skupinám cysteinu dokáže MT vázat ionty kovů, sedm dvojmocných iontů nebo 12 jednomocných (2). Fyziologických funkcí MT bylo doposud rozpoznáno několik. Předně je to významný přenašeč iontů kovů. Největší afinitu má k Cu2+, ale nejčastěji váže Zn2+, čímž se velmi intenzivně zapojuje do homeostázy těchto iontů v organismu. Následná detoxikace poté proběhne pravděpodobně v ledvinách. MT má také významnou antioxidativní roli (3). Spolu s glutathionem (GSH) vytváří oxidačně redukční dvojici, která reguluje výskytvolných kyslíkových radikálů. Spolu tak vytvářejí redukční prostředí, které pomáhá chránit nukleové kyseliny, fosfolipidové membrány a proteinové aparáty buňky před ionizujícími účinky vysoko energetického záření achemooxidačním působením toxických činidel. V poslední době se také stále více poukazuje na schopnost MT regulovat expresi na kovech závislých genů. MT se schopností vázat atomy zinku dokáže přenášet esenciální kovy na transkripční faktory, a tak je aktivovat (4).

Klinický význam MT

Existuje řada studií vyhodnocující hladinu metalothioneinu u pacientů (5). Klinicky jsou změněné hladiny MT významné u řady onemocnění jako nefrotický syndrom (6), expozici zvýšeným hladinám těžkých kovů, jako je kadmium, zinek (7–9), cisplatina (10), spina bifida, nádory (11), a případně poškození dalších orgánů (12). Výzkumyukázaly zvýšenou hladinu MT (asi 5krát) v krevním séru i u dětských pacientů s nádory (13). Koncentrace proteinuMT je dávána do souvislosti s lokalizací tumoru, stadiem onemocnění, prognostickými vyhlídkami, ale i věkem pacienta, stravovacími návyky a podobně. V této oblasti je potřeba dále provádět intenzivní výzkum, aby se lépe pochopilo fungování nádorové buňky. Zvýšená hladina MT pravděpodobně indikuje změny v proliferaci buněk (14, 15).

Nádorová onemocnění a metalothioneiny

Vztah MT k nádorovému onemocnění nebyl doposud uspokojivě vysvětlen, nicméně protein hraje roli v kancerogenezi (4, 5, 16, 17). Pokusy na geneticky modifikovaných myších bez genu pro MT ukázaly, že jsou citlivější ke vzniku nádorového onemocnění způsobeným těžkým kovem. Také se ukázalo, že proliferující buňky obsahují více MT, čímž se přímo nabízí spojitost s nádorovým bujením. Antioxidační aktivita metallothioneinu je využita při zhášení kyslíkových radikálů vzniklých při zvýšené aktivitě mitochondrií dělících se buněk.

Elektrochemická detekce a metalothioneiny

Pro analytické stanovení MT lze využít celou řadu analytických metod (2, 18). Metallothioneiny jsou proteiny bohaté na – SH skupiny. Z těchto důvodů lze pro detekci MT použít elektrochemických metod založených na katalytických reakcích (19, 20). Těchto metod bylo využito pro stanovení MT v kulturách buněk, v tkáních měkkýšů (21) nebo i v krevním séru(13, 22). Optimalizací postupu a celkových podmínek přípravy vzorku se podařilo dosáhnout velmi nízkých limitů detekce u různých analytických metod (tab. 1).

Cílem práce bylo navrhnout metodu pro elektrochemickou analýzu MT ze vzorků moči a aplikovat ji na pilotním vzorku pacientů s nádorem prostaty.

MATERIÁL A METODY

Použité chemikálie

MT byl zakoupen od společnosti Sigma-Aldrich (USA) a ostatní chemikálie použité pro analýzu byly zakoupeny odspolečnosti Merck (Darmstadt, Německo) v čistotě

p.a. Pro chemicko-biochemickou analýzu byly využity pracovní roztoky od společnosti Siemens (USA).

Biologické vzorky

Kontrolní skupina byla moč zdravých dobrovolníků (n = 13, věk 16–48 let). Skupinu tvořili pacienti s primárními záchytyCaP (n = 14, věk 50–60 let). Další skupinou byli pacienti s benigní hyperplazií prostaty (n = 9, věk 50–60 let). Individuálnívzorky (n = 5) byly smíchány do sterilní nádoby (objem minimálně 500 ml). Vzorky moči byly denaturovány 99 °C natermomixeru po dobu 15 min při teplotě 4 oC. Denaturované vzorky byly centrifugovány při 4 oC, 15 000 g po dobu 30 min.

Elektrochemická analýza

Elektrochemická analýza byla provedena na AUTOLAB Analyser (Metrohm, Herisau, Switzerland) ve spojení s VA-Stand 663 (Metrohm, Herisau, Switzerland). Vzorky byly měřeny diferenční pulzní voltametrií (DPV). DPV parametry byly následující: počáteční potenciál –0,6 V akonečný potenciál byl –1,95 V, modulační čas 0,057 s, interval 0,2 s, step potenciál byl 1 mV/s, modulační amplituda250 mV a akumulační čas 240 s. Základní elektrolyt (Brdičkův roztok) 1 mmol/l Co(NH3)6Cl3, 1 mol/l NH3(aq) a 1mol/l NH₄Cl, pH 9,6. Další podrobnosti k metodě jsou popsány v dalších pracích (22–24).

Statistické a matematické vyhodnocení

Veškerá analyzovaná data byla převedena do laboratorní databáze QINSLAB a statisticky vyhodnocena. Všechny elektrochemické analýzy byly provedeny minimálně v pěti opakováních. Analytické parametry LOD a LOQ byly vypočítány podle práce Hubauxe a Vose (25).

VÝSLEDKY A DISKUZE

Dlouhodobě je pro kvantitativní stanovení MT je využíváno Brdičkovy reakce (19, 26, 27). Skotákem modifikovaný bioanalytický postup využíval pro analýzu MT v moči (23, 28). Elektrochemická analýza MT byla námi popsána v různých experimentálních pracích (20, 29). Studované vzorky močí byly nejdříve tepelně denaturovány po dobu 30 min a následně 30 min centrifugovány pro odstranění vzniklého precipitátu. Připravený vzorek byl následně analyzován za využití Brdičkovy reakce (obr. 2). Pro vyhodnocení získaných voltametrických křivek bylo využito určení ploch pod křivkou AUC. U získaných voltamogramů byla vyhodnocena AUC pod grafem ve čtyřech zónách (první zóna od –0,6 V do –1,0 V, druhá od –1,01 V do –1,3 V, třetí od –1,31 V do –1,6 V a čtvrtá zóna od –1,61 Vdo –1,95 V). Získané AUC pro jednotlivé zóny ukázaly nejlepší závislost na koncentraci MT pro zónu dvě a tři.Zaznamenané AUC odezvy jednotlivých zón narůstaly v závislosti na množství aplikovaného vzorku. Dalšímetodické podrobnosti k analýze MT jsou publikované v naší nejnovější práci (24). V dostupných studiích byly stanoveny hladiny MT v běžné populaci, v mírně industriálně zatížené se pohybují kolem 20 až 40 µg/mmol kreatininu (30). Většinou mezi pohlavím a věkem nejsou pozorovány význačné rozdíly, ale lze očekávat, že navelkém souboru dat budou tyto závislosti prokázány (12, 30).

Zjistili jsme, že průměrná hladina MT u kontrolní skupiny (n = 13) byla 2,9 ± 1,2 µg/mmol kreatininu, u benigníhyperplazie prostaty 4,7 ± 1,7 μg/mmol kreatininu a ve skupině s CaP (n = 9) 6,7 ± 1,5 µg/mmol kreatininu. Rozdíl mezi kontrolní skupinou a skupinou CaP byl statisticky průkazný (p = 0,0099). Mezi benigní hyperplazií prostaty a CaP nebyl prokázán významný rozdíl (p = 0,0928). Signály u pacientů s benigní hyperplazií prostaty nevykazují statisticky významný rozdíl proti kontrolní skupině (p = 0,7869). S ohledem na pilotní studii byl analyzován malý vzorek pacientů, v získaných datech jsme nepozorovali žádné závislosti koncentrace MT na věku.

Výzkum, který se zabýval MT v moči dětí se spina bifida, ukázal rovněž jeho zvýšenou hladinu u skupiny pacientů, zhruba 2krát (31). Nejvíce byla hladina MT zkoumána u populací žijících v prostředí se zvýšenou koncentrací těžkýchkovů. MT v moči je úzce spojen s množstvím těžkých kovů přítomných v moči. U skupiny mužů vystavených pracovníexpozici kadmiem byly hladiny MT kolem 150 µg/mmol kreatininu. U žen žijících v Japonsku v oblasti zamořené kadmiem trpících tzv. nemocí „itai-itai“ byla v moči naměřena hladina MT kolem 750 µg/mmol kreatininu (32). Při podobné studii provedené na populaci obývající zamořenou oblast ve Španělsku bylo u žen naměřeno kolem 4 µg MT/mmol kreatininu a u mužů 3 µg MT/mmol kreatininu (30). Při trvalé expozici kadmiu se hladiny MT v moči postupně zvyšovaly s délkou expozice. O uvolnění MT do krve amoči nejsou dostupné informace, protože MT je cytoplazmatický protein. Pravděpodobně dochází k poškození epitelu tubulů v důsledku apoptózy a/nebo nekrózy (12). U neexponovaných jedinců však mechanismus není zřejmý a může souviset se změnami v endocytóze v nefronu: uvolnění z buněk tubulů v důsledku vyšší permeability způsobené reaktivními formami kyslíku (ROS), uvolnění z buněk tubulů, které prošly řízenou apopózou, změnami na membráně, v průběhu sekrece proteinů exozomy, membránovými bublinami (12). MT má množství biologických funkcí, mezi nejvýznamnější patří homeostáza iontů kovů (27, 33). Tato oblast stále není podrobně probádána a je nutné ji v budoucnu věnovat pozornost. Hladina MT může být ovlivněna mnoha různými fyzikálními a biologickými faktory (34).

ZÁVĚRY PRO KLINICKOU PRAXI

Metallothioneiny jsou stanovovány v řadě různých matricí, především ve vzorcích orgánů. V poslední době jsme věnovali pozornost detekci MT v krvi a séru. Další matricí, ve které je MT možné analyzovat, je moč. Byla provedena pilotní studie elektrochemické analýzy MT v moči. Uvedené metodické přístupy jsme aplikovali na sledování změn obsahu MT u pacientů s CaP a zbytnělou prostatou. Mezi testovanými skupinami se podařilo prokázat rozdíly, hodnoty u pacientů s CaP byly zvýšené, ale musí být dále detailněji studovány.

Poděkování

Práce na tomto projektu byla financována Ligou proti rakovině Praha 2019. Děkujeme společnosti Metrohm CZ za dlouhodobou podporu, a především Vítu Skotákovi za realizaci experimentů. Naše velké poděkování patří panu RNDr. Josefu Růžičkovi za vytváření laboratorní databáze a algoritmů pro vyhodnocování experimentálních dat.

Seznam zkratek

AUC      plocha pod křivkou

BHP      benigní hyperplazie prostaty CaP     karcinom prostaty

DPV      diferenční pulzní voltametrie GSH    glutathion

MT        metalothionein

Konflikt zájmů: žádný.