Expresia ligandu receptora programovanej bunkovej smrti 1 v bio psii nemalobunkového karcinómu pľúc a jej asociácia s tumor infi ltrujúcimi lymfocytmi a stupňom dezmoplázie

Souhrn

Východiská: Imunoterapia blokujúca signálnu dráhu PD-1/PD-L1 sa za posledné roky stala dominantnou liečebnou modalitou pacientov s nemalobunkovým karcinómom pľúc (non-small cell lung carcinoma – NSCLC). Imunohistochemicky dôkaz expresie ligandu receptora programovanej bunkovej smrti-1 (programmed death-ligand 1 – PD-L1) na membráne nádorových buniek a/alebo tumor infiltrujúcich lymfocytoch (TIL) je stále jediným klinicky validovaným prediktívnym biomarkerom pre indikáciu imunoterapie, ale má svoje limity. Prítomnosť TIL v nádorovom mikroprostredí bola recentne identifikovaná ako komplementárny prediktívny faktor tejto terapie. V tejto retrospektívnej štúdii sme v súbore 134 chirurgických resekátov NSCLC analyzovali asociáciu medzi expresiou PD-L1, prítomnosťou TIL a stupňom dezmoplázie nádoru.

Materiál a metódy: Expresia PD-L1 na membráne nádorových buniek a v TIL bola dokazovaná imunohistochemicky anti-PD-L1 protilátkou (klon 22C3) a prítomnosť TIL použitím protilátky anti-CD3 (polyklon). Expresia PD-L1 bola hodnotená systémom „nádorového proporčného skóre“ (tumour proportion score – TPS), pričom boli vymedzené kategórie TPS < 1 %, TPS 1–49 % a TPS ≥ 50 %. Semikvantitatívne hodnotenie prítomnosti TIL bolo vykonané metódou „percenta stromálnych TIL“ (PST) a rozlišované boli kategórie PST < 10 %, PST 10–49 % a PST ≥ 50 %. Analyzovaná bola asociácia medzi hodnotou expresie PD-L1 v nádorových bunkách a TIL ku hodnote PST. Štatistická analýza bola vykonaná Cochranovým-Armitageovým testom, pričom hodnota p < 0,05 bola pokladaná za signifikantnú.

Výsledky: Expresia PD-L1 v nádorových bunkách bola signifikantne vyššia v kategóriách PST 10–49 % a PST ≥ 50 % v porovnaní s kategóriou PST < 10 % v grade 1 a grade 2 adenokarcinómoch (p = 0,008), v grade 3 adenokarcinómoch (p = 0,009) aj v skvamocelulárnych karcinómoch (p = 0,028). Expresia PD-L1 v TIL bola asociovaná s hodnotou PST v skvamocelulárnych karcinómoch (p = 0,025), ale nie v prípade adenokarcinómov. Nádory s vysokým stupňom dezmoplázie vykazovali obzvlášť nízku hodnotu TPS aj PST.

Záver: Expresia PD-L1 v NSCLC je asociovaná s prítomnosťou TIL. Dezmoplastické oblasti nádoru predstavujú imunologicky neaktívne nádorové mikroprostredie. Podávanie anti PD-1/P-L1 imunoterapie s látkami blokujúcimi signálnu dráhu TGF-β predstavuje perspektívnu kombinovanú terapiu pre pacientov s NSCLC s dezmopláziou.

Klíčová slova:

ligand receptora programovanej bunkovej smrti-1 – nemalobunkový karcinóm pľúc – tumor infiltrujúce lymfocyty – prediktívny faktor

Východiská

Pľúcny karcinóm patrí celosvetovo medzi najčastejšie príčiny úmrtia na nádorové ochorenie, pričom viac ako 85 % prípadov tvoria nemalobunkové karcinómy pľúc (non-small cell lung carcinoma – NSCLC). Ide o heterogénnu skupinou nádorov s početnými histologickými typmi s odlišnými molekulárnymi charakteristikami a biologickým správaním [1].

Imunoterapia sa za posledné roky stala dominantnou liečebnou modalitou pacientov s rôznymi typmi malignít, vrátane NSCLC [2]. Inhibítory imunitných kontrolných bodov, ktoré blokovaním inhibičnej signálnej dráhy PD-1/PD-L1 (programmed death-1 / programmed death-ligand 1) vedú k reaktivácii potlačeného imunitného systému, výrazne zlepšili prognózu pacientov s lokálne pokročilým a metastazujúcim NSCLC [3,4]. V súčasnosti sú pre klinické používanie v európskych krajinách schválené anti-PD-1 protilátky nivolumab a pembrolizumab a anti-PD-L1 protilátky atezolizumab, avelumab a durvalumab [5,6].

Imunohistochemický dôkaz expresie proteínu PD-L1 na membráne nádorových buniek a/alebo imunitných bunkách je stále jediným klinicky validovaným prediktívnym biomarkerom pre indikáciu tejto terapie [7]. Nejde pritom o dokonalý prediktívny faktor, pretože jeho negatívny výsledok nevylučuje možnosť účinnosti inhibítorov imunitných kontrolných bodov. A naopak, bolo zistené, že viac ako polovica pacientov nereaguje priaznivo na túto liečbu napriek vysokej hodnote expresie PD-L1 [8]. Preto je potrebné nájsť nové, komplementárne prediktívne faktory, ktoré by pomohli identifikovať populáciu pacientov, ktorí s najvyššou pravdepodobnosťou budú priaznivo klinicky odpovedať na podávanie tejto terapie.

V posledných rokoch sa ukazuje, že expresia PD-L1 je pravdepodobne len jedným z mnohých determinantov, ktoré predpovedajú účinnosť inhibítorov imunitných kontrolných bodov. Pozornosť sa okrem iného upriamila na charakteristiky nádorového mikroprostredia, predovšetkým na prítomnosť imunitných buniek v nádorovej stróme, ktorá svedčí pre prítomnú protinádorovú imunitnú odozvu a na úlohu „s nádorom asociovaných fibroblastov“, ktoré prispievajú ku imunitnej dysregulácii. Viaceré štúdie poukazujú na to, že tzv. tumor infiltrujúce lymfocyty (TIL) prítomné v nádorovej stróme sú asociované s klinickou účinnosťou inhibítorov imunitných kontrolných bodov [9–11].

Mnoho aspektov nádorového mikroprostredia nie je dodnes plne objasnených. Cieľom našej štúdie bolo analyzovať možnú asociáciu medzi expresiou PD-L1 v tkanive rôznych typov NSCLC s charakteristikami nádorového mikroprostredia, ako je prítomnosť lymfocytov v nádorovej stróme a stupeň desmoplázie. Tieto výsledky by mohli mať potenciálne uplatnenie v klinickej terapeutickej praxi.

Materiál a metódy

Charakteristika vyšetrovaného súboru

Súbor zahrňoval 134 chirurgických resekátov pľúcnych karcinómov, ktoré boli retrospektívne analyzované za účelom stanovenia expresie PD-L1 a prítomnosti TIL. Štúdia bola schválená etickou komisiou Jesseniovej lekárskej fakulty Univerzity Komenského v Martine (EK 136/2018).

Jednotlivé typy a podtypy NSCLC boli kategorizované v súlade s WHO (World Health Organization) klasifikáciou pľúcnych nádorov z roku 2015 [1]. Dva základné typy NSCLC predstavovali adenokarcinómy a skvamocelulárne karcinómy. V prípade adenokarcinómov sa na základe predominantného rastového vzoru rozlišovalo päť podtypov: predominantne lepidické adenokarcinómy, ktoré predstavujú dobre diferencované (grade 1) nádory, predominantne acinárne a predominantne papilárne adenokarcinómy, ktoré predstavujú menej diferencované (grade 2) formy, a predominantne solídne a predominantne mikropapilárne adenokarcinómy, ktoré predstavujú nízko diferencované (grade 3) podtypy.

V súbore boli vyčlenené tri základné skupiny NSCLC, ktoré boli analyzované separátne: skupina grade 1 a grade 2 adenokarcinómov, skupina grade 3 adenokarcinómov a skupina skvamocelulárnych karcinómov. Oblasti karcinómov z troch základných skupín, ktoré sa vyznačovali vysokým stupňom dezmoplázie, boli hodnotené ešte osobitne, pričom dezmoplázia bola definovaná ako pomer nádorovej strómy ku štruktúram tvoreným nádorovými bunkami väčší ako jedna.

Imunohistochemické vyšetrenia

Na imunohistochemickú analýzu expresie proteínu PD-L1 boli použité parafínové rezy bioptického materiálu a na revitalizáciu Pre-treatment Link a roztok „low pH“ (pH 6) pri 96 °C po dobu 20 min. Imunohistochemická reakcia prebiehala v automate Autostainer Link 48 s použitím kitu PD-L1 IHC 22C3 PharmDx (RTU) s monoklonálnou protilátkou anti-PD-L1 (klon 22C3) v riedení 1: 50 s inkubáciou cez noc. Detekcia reakcie prebehla pomocou detekčného kitu EnVision Flex. Všetky uvedené reagencie a platformy boli zakúpené od spoločnosti Dako/Agilent, Dánsko. Každý beh v staineri prebiehal súčasne s použitím pozitívnej bunkovej kultúry (súčasť kitu), ako aj pozitívnej a negatívnej kontroly vlastného predtým verifikovaného a validovaného prípadu z nášho registra.

Prítomnosť lymfocytov v nádorovej stróme bola detegovaná imunohistochemickým dôkazom expresie antigénu CD3. Na revitalizáciu bol použitý Pre-treatment Link a roztok „high pH“ (pH 9) a imunohistochemická reakcia prebiehala v automate Autostainer Link 48 s monoklonálnou protilátkou anti-CD3 (polyklon). Detekcia reakcie prebehla pomocou detekčného kitu EnVision Flex, high pH (Link) K8000.Všetky uvedené reagencie a platformy boli zakúpené od spoločnosti Dako/Agilent, Dánsko.

Hodnotenie expresie PD-L1 v nádorových bunkách a TILs

Výsledok expresie PD-L1 bol vyjadrený kvalitatívne (pozitívny vs. negatívny výsledok) s použitím systému „nádorového proporčného skóre“ (tumour proportion score – TPS) [12], ktorý predstavuje percentuálny podiel PD-L1 exprimujúcich nádorových buniek z celkovému počtu non-nekrotických nádorových buniek. Ako „PD-L1 pozitívna“ sa označovala nádorová bunka, ktorá vykazovala čiastočné alebo úplné membránové farbenie PD-L1, cytoplazmatická pozitivita do výsledku započítaná nebola. Výsledok bol považovaný za negatívny, ak menej ako 1 % nádorových buniek vykazovalo pozitivitu PD-L1 proteínu. Pozitívne výsledky boli na základe hodnoty TPS rozdelené do kategórie „1–49 %“ a kategórie „50 % a viac“. Analogickým spôsobom bola hodnotená expresia PD-L1 aj v imunitných bunkách prítomných v nádorovej stróme. Pri hodnotení dezmoplastických oblastí boli vymedzené osobitné kategórie TPS „1–9 %“ a „10–49 %“.

Hodnotenie množstva TILs

Hodnotené boli výlučne lymfocyty. Iné mononukleárne bunky ako makrofágy a dendritické bunky, ako aj polymorfonukleárne leukocyty do výsledku zahrnuté neboli. Semikvantitatívne hodnotenie prítomnosti lymfocytov v nádorovej stróme bolo vykonané metódou „percenta stromálnych TIL“ (PST), ktorá je analogická metóde popísanej pri karcinóme prsníka [13]. Percento stromálnych TIL predstavuje percentuálny podiel plochy nádorovej strómy okupovanej lymfocytmi z celkovej plochy nádorovej strómy. Samostatne bol touto metódou hodnotený „invazívny okraj“ nádoru (invasive margin – IM), tj. kompartment nádorovej strómy bezprostredne naliehajúci na ložiská tumoru hraničiace s nenádorovým tkanivom a „centrálna časť“ nádoru (tumor center – TC), tj. kompartment nádorovej strómy naliehajúcej na ložiská tumoru centrálne od invazívneho okraja. Na základe zhody alebo nezhody medzi obidvoma kompartmentmi nádorovej strómy boli jednotlivé karcinómy vo všetkých troch skupinách zaradené do jednej z dvoch podskupín: „PST v IM = PST v TC“ a „PST v IM ≠ PST v TC“. V podskupine „PST v IM = PST v TC“ boli na základe hodnoty PST rozlišované tri kategórie: nádorová stróma s hodnotou PST < 10 % bola hodnotená ako nízke PST, s hodnotou PST 10–49 % ako stredne vysoké PST a s hodnotou PST ≥ 50 % ako vysoké PST. V podskupine „PST v IM ≠ PST v TC“ boli rozlišované dve kategórie: „PST v TC ≥ 10 % / PST v IM 10–49 %“ a „PST v TC 10–49 % / PST v IM ≥ 50 %“. Výsledky príslušných kategórii PST boli porovnávané s hodnotami TPS.

Štatistická analýza

Kontingenčné tabuľky distribúcie jednotlivých typov NSCLC rozdelených podľa hodnoty pozitivity PD-L1 v nádorových alebo imunitných bunkách v kategóriách PST ≥ 10 % a PST ≥ 10 % boli prevedené do podoby mozaikového diagramu. Nulová hypotéza žiadneho vzťahu medzi uvedenými dvoma kategóriami PST bola testovaná Cochranovým-Armitageovým testom trendu, ktorý bol prevedený proti alternatívnej hypotéze, že podiel NSCLC s PD-L1 negatívnymi nádorovými alebo imunitnými bunkami v kategórii PST ≥ 10 % relatívne ku kategórii PST ≥ 10 % bude vyšší. V prípade PD-L1 pozitivity sa očakával obrátený pomer. Hodnota p < 0,05 bola pokladaná za štatisticky významnú. Analyzované dáta boli spracované vo výpočtovom prostredí R, verzia 3.5.0 s použitím knižnice DescTools.

Výsledky

Expresia PD-L1 v analyzovanom súbore NSCLC

Celkovo bolo do tejto štúdie zahrnutých 134 chirurgických resekátov pľúcnych karcinómov. V 87 prípadoch išlo o adenokarcinómy a v 47 prípadoch o skvamocelulárne karcinómy. Z 87 prípadov adenokarcinómov bola expresia PD-L1 v nádorových bunkách zistená v 38 prípadoch (43,7 %) a expresia PD-L1 v TIL v 45 prípadoch (51,7 %). Skupina skvamocelulárnych karcinómov zahrňovala 47 prípadov, pričom pozitívny výsledok expresie PD-L1 v nádorových bunkách bol zistený v 22 prípadoch (46,8 %) a v imunitných bunkách v 27 prípadoch (57,4 %).

Asociácia medzi expresiou PD-L1 a PST v skupine grade 1 a grade 2 adenokarcinómov

Šesťdesiat adenokarcinómov bolo klasifikovaných ako dobre diferencované (grade 1) alebo menej diferencované (grade 2) formy. V 13 prípadoch (26,5 %) bola zistená expresia PD-L1 v nádorových bunkách a v 26 prípadoch (53 %) v TIL.

V podskupine „PST v IM = PST v TC“ bolo 49 prípadov, pričom prevažná časť prípadov (n = 28) patrila do kategórie nízkeho PST. Výsledky sú zhrnuté v tab. 1.

Pri analýze expresie PD-L1 v nádorových bunkách v tejto podskupine bolo zistené, že celková pozitivita je signifikantne vyššia v kategóriách s vyšším stupňom lymfocytovej infiltrácie (p = 0,008) (obr. 1A). V kategórii PST ≥ 10 % boli PD-L1 pozitívne len 4 z 28 prípadov (16,7 %), ale v kategórii PST 1–49 % bola expresia PD-L1 zistená v 7 z 28 prípadov (46,7 %) a v kategórii PST ≥ 50 % v 2 zo 6 prípadov (33,3 %). Stúpajúca hodnota PST nekorelovala signifikantne so stúpajúcou hodnotou celkovej pozitivity PD-L1 imunitných buniek (p = 0,082) (obr. 1B). V kategórii nízke PST bola expresia PD-L1 v TIL zistená v 12 z 28 prípadov (42,9 %), v kategórii stredne vysoké PST v 9 z 28 prípadov (60 %) a v kategórii vysoké PST v 5 zo 6 prípadov (83,3 %).

V podskupine „PST v IM ≠ PST v TC“ bolo identifikovaných 11 adenokarcinómov – v 10 prípadoch patrili do kategórie „PST v TC ≥ 10 % / PST v IM 10–49 %“ s pozitívnym výsledkom PD-L1 v nádorových bunkách aj TIL v 2 prípadoch (22,2 %). V prípade dvoch adenokarcinómov šlo o kategóriu „PST v TC 10–49 % / PST v IM ≥ 50 %“ s výsledkom pozitívnej expresie PD-L1 v nádorových bunkách a TIL s 50 % prípadov. Výsledky sú zhrnuté v tab. 2.

Asociácia medzi expresiou PD-L1 a PST v skupine grade 3 adenokarcinómov

Dvadsaťsedem adenokarcinómov bolo klasifikovaných ako nízko diferencované (grade 3) formy. V 22 prípadoch (81,5 %) bola zistená expresia PD-L1 v nádorových bunkách a v 16 prípadoch (55,5 %) v TIL. Pre všetky prípady v tejto skupine platili kritéria „PST v IM = PST v TC“. Výsledky sú zhrnuté v tab. 1.

Podobne ako v prípade grade 1 a grade 2 adenokarcinómov, aj v prípade nízko diferencovaných adenokarcinómov bolo zistené, že celková pozitivita proteínu PD-L1 v nádorových bunkách je signifikantne vyššia v kategóriách s vyšším stupňom lymfocytovej infiltrácie (p = 0,009) (obr. 2A). V kategórii PST ≥ 10 % bola PD-L1 pozitivita zistená v 2 z 5 prípadoch (40 %), v kategórii PST 10–49 % v 6 zo 7 prípadov (85,7 %) a v kategórii PST ≥ 50 % v 14 z 15 prípadov (93,3 %), pričom v 9 prípadoch išlo o TPS s hodnotou ≥ 50 %. Taktiež v prípade nízko diferencovaných foriem adenokarcinómov nebola zistená asociácia medzi hodnotou PST a celkovou pozitivitou PD-L1 v imunitných bunkách (p = 0,428) (obr. 2B). V kategórii PST ≥ 10 % bola expresia PD-L1 v TIL zistená v 3 z 5 prípadov (60 %), v kategórii PST 1–49 % v 3 zo 7 prípadov (51,7 %) a v kategórii PST ≥ 50 % v 8 z 15 prípadov (53,3 %). Vzťah medzi expresiou PD-L1 v nádorových bunkách grade 3 adenokarcinómov a lymfocytovou infiltráciou strómy je zobrazený na obr. 3.

Asociácia medzi expresiou PD-L1 a PST v skupine skvamocelulárnych karcinómov

Súbor obsahoval 47 prípadov klasifikovaných ako skvamocelulárne karcinómy, pričom pozitivita PD-L1 proteínu v nádorových bunkách bola zistená v 22 zo 47 prípadov (46,8 %) a v TIL v 27 zo 47 prípadov (57,4 %).

V kategórii „PST v IM = PST v TC“ bolo 31 prípadov, z ktorých expresia PD-L1 v nádorových bunkách a v TIL bola zistená v 16 z 31 prípadov (51,6 %). Výsledky sú zhrnuté v tab. 1.

Celková pozitivita PD-L1 v nádorových bunkách bola v kategóriách PST 1–49 % a ≥ 50 % signifikantne vyššia v porovnaní s kategóriou PST ≥ 10 % (p = 0,028) (obr. 4A). V kategórii PST ≥ 10 % bola expresia PD-L1 v nádorových bunkách zistená v 3 z 11 prípadov (27,3 %), v kategórii PST 10–49 % v 3 zo 6 prípadov (50 %) a v kategórii PST ≥ 50 % 10 zo 14 prípadov (71,4 %). Celková pozitivita PD-L1 v TIL bola v kategóriách PST 1–49 % a ≥ 50 % signifikantne vyššia v porovnaní s kategóriou PST ≥ 10 % (p = 0,025) (obr. 4B). V kategórii PST ≥ 10 % bola zistená expresia PD-L1 len v 3 z 11 prípadov (27,3%), ale v kategórii PST 10–49 % v 4 zo 6 prípadov (66,7 %) a v kategórii PST ≥ 50% 9 zo 14 prípadov (64,3 %). Vzťah medzi expresiou PD-L1 v nádorových bunkách skvamocelulárnych karcinómov a lymfocytovou infiltráciou strómy je zobrazený na obr. 3.

V kategórii „PST v IM ≠ PST v TC“ bolo identifikovaných 19 skvamocelulárnych karcinómov. V 10 prípadoch patrili do kategórie „PST v TC ≥ 10 % / PST v IM 10–49 %“ s pozitívnym výsledkom expresie PD-L1 v nádorových bunkách v 3 prípadoch (30 %) a v TIL v 6 prípadoch (60 %). V 6 prípadoch išlo o kategóriu „PST v TC 10–49 % / PST v IM ≥ 50 %“, pričom expresia PD-L1 v nádorových bunkách bola zistená v 3 prípadoch (50 %) a v TIL v 5 prípadoch (83,3 %). Výsledky sú zhrnuté v tab. 2.

Asociácia medzi expresiou PD-L1 a PST v dezmoplastických oblastiach

Celkovo bolo identifikovaných 30 karcinómov s vysokým stupňom dezmoplázie. Tieto oblasti sa vyznačovali obzvlášť nízkou hodnotou PST a takmer absentujúcou expresiou PD-L1. V 29 prípadoch bola zistená hodnota PST ≥ 10 %, pričom len dve z týchto oblastí (6,9 %) vykazovali pozitivitu PD-L1 proteínu v nádorových bunkách. Jedna dezmoplastická oblasť mala hodnotu PST 10–49 % s negatívnym dôkazom expresie PD-L1. Výsledky sú zhrnuté v tab. 3 a obr. 5 zobrazuje príklady dezmoplastických pľúcnych karcinómov vo vzťahu k lymfocytovej infiltrácii.

Diskusia

Predkladané dáta objasňujú viaceré aspekty nádorového mikroprostredia NSCLC, ktoré by mohli byť využiteľné pri interpretácii klinickej odpovede pacientov s NSCLC liečených imunoterapiou, tj. mohli by mať potenciálne využitie pri jej indikovaní.

V roku 2015 Teng et al [14] navrhli klasifikovať nádorové mikroprostredie na základe prítomnosti expresie PD-L1 a infiltrácii nádorovej strómy T-lymfocytmi na štyri typy – ako nádorové mikroprostredie typu I označili také, v ktorom nádorové bunky vykazujú pozitivitu PD-L1 proteínu, pričom v nádorovej stróme sú prítomné TIL. Takýto stav signalizuje adaptívnu imunitnú rezistenciu a pacienti s týmto typom nádorového mikroprostredia vykazujú najlepšiu klinickú odpoveď pri podávaní inhibítorov imunitných kontrolných bodov. Nádorové mikroprostredie typu II je označované aj ako imunologicky „vypriahnuté“. Je charakterizované kombináciou PD-L1 negatívnych nádorových buniek ako aj nízkou až absentujúcou T-lymfocytovou infiltráciou, čo signalizuje imunologickú „ignoranciu“. Nádorové mikroprostredie typu III je PD-L1 pozitívne, ale stróma nie je infiltrovaná T-lymfocytmi, čo naznačuje onkogénnu stimuláciu expresie PD-L1 v nádorových bunkách. Nádorové mikroprostredie typu IV je bez expresie PD-L1, ale s prítomnosťou TIL, čo naznačuje alternatívne cesty úniku spod imunitného dozoru [14].

Naše zistenia poukazujú na to, že v prognosticky odlišných skupinách adenokarcinómov je zastúpenie uvedených štyroch typov odlišné. V skupine lepšie diferencovaných, grade 1 a grade 2 adenokarcinómov patrilo 28 zo 49 prípadov (57,1 %) do kategórie PST ≥ 10 %. Z týchto 28 adenokarcinómov bola expresia PD-L1 v nádorových bunkách zistená v 4 z nich (16,7 %). V 24 prípadoch (49 %) mali teda pacienti nádorové mikroprostredie typu II s konfiguráciou „PD-L1 negatívny, TIL negatívny (nízky) “, čo by mohlo znamenať, že sú málo vhodnými kandidátmi pre imunoterapeutické postupy.

Pri analýze tejto skupiny adenokarcinómov bolo tiež zistené, že celková pozitivita PD-L1 v nádorových bunkách je vyššia v kategóriách PST 1–49 % a ≥ 50 % v porovnaní s kategóriou PST ≥ 10 % (p = 0,008). To je v súlade s výsledkami viacerých autorov, ktorí upozorňujú na možnú asociáciu medzi expresiou PD-L1 v nádorových bunkách a infiltráciou nádorovej strómy T-lymfocytmi [15–17].

V skupine nízko diferencovaných, grade 3 adenokarcinómov patrilo 15 z 27 prípadov (55,5 %) do kategórie PST ≥ 50 %. Z týchto 15 adenokarcinómov bola expresia PD-L1 v nádorových bunkách zistená v 9 z nich (60 %). V 9 prípadoch mali teda pacienti nádorové mikroprostredie typu I, s konfiguráciu „PD-L1 pozitívny, TIL vysoký“, čo podporuje názor, že by mali byť vhodnými kandidátmi pre imunoterapeutické postupy. Podobne ako v prípade lepšie diferencovaných adenokarcinómov aj v prípade grade 3 foriem bola pozorovaná asociácia medzi expresiou PD-L1 v nádorových bunkách a stupňom infitrácie nádorovej strómy imunitnými bunkami. Celková pozitivita PD-L1 proteínu bola vyššia v kategóriách PST 1-49 % a ≥ 50 % v porovnaní s kategóriou PST ≥ 10 % (p = 0,009).

S ohľadom na expresiu PD-L1 v TIL nebol v žiadnej z uvedených dvoch skupín adenokarcinómov rozdelených na základe stupňa diferenciácie zistený signifikantný vzťah medzi hodnotou PST a pozitivitou PD-L1 v TIL. Celková pozitivita PD-L1 proteínu v nádorových bunkách v nízko diferencovaných adenokarcinómoch bola vyššia než v prípade lepšie diferencovaných formách (81,5 vs 26,5%). Na túto asociáciu medzi expresiou PD-L1 a stupňom diferenciácie adenokarcinómov upozorňujú aj viacerí autori – expresia PD-L1 bola signifikantne asociovaná s nízko diferencovanými, grade 3 adenokarcinómami klasifikovanými ako predominantne solídne a s kratším celkovým prežívaním [18–23].

V skupine skvamocelulárnych karcinómov nebol zistený výrazný rozdiel v zastúpení jednotlivých kategórii PST – 11 prípadov patrilo do kategórie PST ≥ 10 % a 16 do kategórie PST ≥ 50 %. V skvamocelulárnych karcinómoch bola pozorovaná asociácia medzi celkovou pozitivitou PD-L1 v nádorových bunkách a hodnotou PST (p = 0,028). Taktiež v TIL bol podiel PD-L1 pozitívnych prípadov signifikantne vyšší v kategóriách s vyšším PST (p = 0,025).

Počas analýzy jednotlivých karcinómov sme pozorovali, že dezmoplastické oblasti, tj. časti nádoru s výrazným zastúpením nádorovej strómy, sa vyznačujú obzvlášť nízkou hodnotou PST a takmer absentujúcou expresiou PD-L1 v nádorových bunkách – z celkovo 30 identifikovaných dezmoplastických oblastí patrilo 29 z nich (96,7 %) do kategórie PST ≥ 10 %. V nich bola zistená expresia PD-L1 v nádorových bunkách v dvoch prípadoch (6,9 %), pričom išlo o kategóriu TPS 1–9 %. Podobné charakteristiky imunitne „vypriahnutého“ nádorového mikroprostredia bolo pozorované pri analýze metastatických uroteliálnych karcinómov od pacientov liečených atezolizumabom [24]. Mariathasan et al zistili, že migrácia imunitných buniek do nádorového centra je inhibovaná, ak došlo k aktivácii signálnej dráhy TGF-β vo fibroblastoch lokalizovaných peritumorálne. Imunitné bunky, miesto toho aby infiltrovali nádorové centrum, zostali „uväznené“ v nádorovej stróme invazívneho okraja, bohatej na „s nádorom asociovaných fibroblastov“ a na kolagénové vlákna [24]. Aktivácia signálnej dráhy TGF-β však nevedie len k tvorbe mechanickej bariéry v podobe hustej vrstvy kolagénu – táto dráha zohráva významnú úlohu v procese adaptívnej imunitnej odpovede a jej aktivácia vedie k potlačeniu tvorby interferónu-γ, ktorý je zásadným induktorom expresie PD-L1 v nádorových bunkách. TGF-β tiež inhibuje funkciu cytotoxických CD8⁺ T-lymfocytov a indukuje v CD4⁺ T-lymfocytoch expresiu transkripčného faktora FOXP3, čím mení zastúpenie jednotlivých subpopulácii týchto buniek v neprospech Th1 lymfocytov a v prospech regulačných T-lymfocytov [25]. Blokovanie signálnej dráhy TGF-β tak predstavuje perspektívnu komplementárnu terapiu k podávaniu inhibítorov imunitných kontrolných bodov. Odstránenie mechanickej bariéry v podobe kolagénových vláken by umožnilo kontakt imunitných buniek s bunkami nádorovými, ktorý, ako bolo demonštrované, je asociovaný s expresiou prediktívneho markera PD-L1. Nádorové mikroprostredie by sa tak hypoteticky zmenilo z imunitne „vypriahnutého“ typu II na typ I, ktoré vykazuje najvyššiu pravdepodobnosť klinickej odpovede pri podávaní inhibítorov kontrolných bodov. V súčasnosti prebiehajú predklinické štúdie, ktoré testujú kombinovanú terapiu zameranú na blokovanie signálnej dráhy PD-1/PD-L1 spolu s anti-TGF-β terapiou so zatiaľ superiórnymi účinkami oproti monoterapii podávania inhibítorov imunitných kontrolných bodov [24,25].

Záver

Súhrnne, naša štúdia objasňuje mnohé aspekty nádorového mikroprostredia v NSCLC. Expresia PD-L1 má vzťah ku stupňu diferenciácie adenokarcinómov, pričom je vyššia v nízko diferencovaných podtypoch adenokarcinómov grade 3. V skupine adenokarcinómov ako aj skvamocelulárnych karcinómov je celková pozitivita PD-L1 proteínu v nádorových bunkách asociovaná s vyššou hodnotou PST. Expresia PD-L1 v TIL je asociovaná s vyššou hodnotou PST v skvamocelulárnych karcinómoch, ale nie v skupine adenokarcinómov. Dezmoplastické oblasti sa vyznačujú obzvlášť nízkou hodnotou PST a nízkou expresiou PD-L1. Uvedené výsledky majú potenciál pochopiť zložitosť výsledkov liečby pacientov s NSCLC inhibítormi imunitných kontrolných bodov ovplyvňujúcimi signálne dráhy PD-1/PD-L1 a prispieť k zlepšeniu prediktívnej stratifikácie pacientov nielen v rámci existujúcich modalít imunoterapie, ale aj v rámci nových kombinovaných v súčasnosti v klinických štúdiách overovaných postupov.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

prof. MUDr. Lukáš Plank, CSc.

Ústav patologickej anatómie

JLF UK a UN Martin

Kollárova 2

036 01 Martin, Slovenská republika

e-mail: lukas.plank@uniba.sk

Obdržané: 25. 11. 2019

Prijaté: 8. 12. 2019