Význam fibroblastů asociovaných s nádorem při patogenezi karcinomů v oblasti hlavy a krku

Souhrn

Východiska: Navzdory pokroku v protinádorové terapii jsou spinocelulární karcinomy v oblasti hlavy a krku (head and neck squamous cell carcinoma – HNSCC) stále spojeny s nízkou mírou dlouhodobého přežívání pacientů. Nedávné studie poukazují na to, že nádorové stroma může hrát důležitou roli v patogenezi tohoto maligního onemocnění. Fibroblasty jsou hlavní složkou nádorového mikroprostředí a mohou významně ovlivňovat progresi HNSCC, protože přispívají k významným znakům onkogeneze, jako je zánět, neomezený růst, angiogeneze, invaze, vznik metastáz a rezistence k terapii. Je dobře známo, že nádorové buňky mohou modulovat fenotyp fibroblastů do podoby fibroblastů asociovaných s nádorem (cancer-associated fibroblast – CAF), které následně mohou podporovat růst a šíření nádorových buněk. CAF stimulují progresi nádoru prostřednictvím kontaktů mezi buňkami, remodelace extracelulární matrix a produkce velkého množství signálních molekul a matrixových metaloproteináz. Genetické a epigenetické změny v epiteliálních buňkách tedy pravděpodobně nejsou výlučným faktorem řídícím kancerogenezi HNSCC, jelikož se na tomto procesu mohou významně podílet i negenetické změny v buňkách stromatu. Signály vyvolané buněčným stresem narušují funkční program mnoha buněk, čímž se ve tkáni vytváří oblasti predisponované k maligní transformaci. Koncept „nádorového pole“ (field cancerization) představuje proces aktivního vývoje mezibuněčných interakcí a zpětnovazebných smyček mezi nádorovými a stromálními buňkami. Tento model se jeví jako velice slibný, otvírá nové způsoby studia nádorového onemocnění a může poskytnout nové terapeutické cíle.

Cíl: V tomto přehledovém článku diskutujeme současné poznatky o CAF, jako je jejich buněčný původ, fenotypová plasticita a funkční heterogenita, a podtrhujeme jejich vliv na progresi HNSCC.

Klíčová slova:

dlaždicobuněčné karcinomy hlavy a krku – fibroblasty asociované s nádorem – mikroprostředí nádoru – extracelulární matrix – metastázy nádorů – Angiogeneze

Úvod

Nádory hlavy a krku jsou globálně pátými nejčastěji se vyskytujícím solidními tumory. Převládající formou tohoto onemocnění jsou nádory dlaždicobuněčné (neboli spinocelulární), které představují více než 90 % všech nádorů této oblasti. Spinocelulární karcinomy hlavy a krku (head and neck squamous cell carcinoma – HNSCC) jsou přesněji klasifikovány podle své polohy (nádory dutiny ústní či nosní, orofaryngu, nosohltanu, hrtanu nebo hypofaryngu), TNM (tumor-node-metastasis) stadia a histologického gradingu. Při léčbě nádorů raného stadia (stadium I a II) jsou účinnými přístupy chirurgie a radioterapie, nicméně u 70 % pacientů je diagnostikováno stadium pokročilé, III nebo IV, kde je efektivita uvedených způsobů terapie radikálně nižší [1]. Zatímco u pacientů s I. a II. stadiem je 5leté přežití v rozmezí 70–90 % (nezávisle na lokalizaci tumoru), 50 % pacientů s pokročilejším stadiem karcinomu zemře do 2 let od stanovení diagnózy. U 5 % pacientů dochází po léčbě k rozvoji dalšího primárního nádoru [2]. Špatná terapeutická odpověď pacientů s pokročilými nádory zdůrazňuje urgentní potřebu hlubšího porozumění mechanizmům patogeneze HNSCC. V rámci řešení tohoto závažného klinického problému bylo provedeno mnoho studií zaměřených na poznání vlastností nádorových buněk. S postupem času se však ukazuje, že terapeutická rezistence není pouze inherentní charakteristikou samotných nádorových buněk a klíčovou roli mohou hrát rovněž buňky nádorového stromatu a jejich komunikace s buňkami nádorovými [3]. Tento vliv je natolik zásadní, že v některých případech dochází k reverzi rezistence nádorových buněk, pokud je narušena podpůrná (pronádorová) funkce buněk stromatu [4]. V nádorovém mikroprostředí (tumour microenvironment – TME) se nachází mnoho typů buněk, molekul extracelulární matrix (extracellular matrix – ECM) a signálů, které mohou inhibovat, či naopak podporovat růst nádorů. Zásadní podíl na rozvoji HNSCC má např. infekce virem HPV. Karcinomy pozitivní na HPV jsou lokalizovány zejména v oblasti orofaryngu a vykazují příznivější terapeutickou odpověď na radioterapii. Problematika HPV a jeho vlivu na kancerogenezi HNSCC byla podrobně zpracována např. v článku Rautava et al (2012) [5]. V tomto přehledovém článku jsme se zaměřili na roli fibroblastů asociovaných s nádorem (cancer-associated fibroblast – CAF) v TME HNSCC.

Fibroblasty klidové a aktivované

Fibroblasty jsou buňky mezenchymového původu, které jsou nejhojnějšími buňkami pojivové tkáně a výrazně se podílejí na syntéze i degradaci složek ECM. V důsledku toho jsou fibroblasty zodpovědné za zajištění strukturní integrity většiny tkání. Produkty fibroblastů rovněž spoluvytvářejí bazální membránu, která poskytuje ochrannou bariéru kolem specializovaného epitelu a přispívá k jeho polaritě, funkčnosti a specifičnosti [6]. Prostřednictvím tvorby a remodelace ECM ovlivňují fibroblasty organogenezi a diferenciaci epitelu. V dobře diferencované a intaktní tkáni zůstávají fibroblasty v klidovém, neproliferujícím stavu a obvykle se nacházejí v intersticiálních oblastech mezi vrstvami funkčního parenchymu. Jsou to tenké, protáhlé buňky vřetenovitého tvaru, které nejsou napojeny na bazální membránu, zato však navazují intenzivní kontakt s vlákny ECM. Klidové fibroblasty jsou obecně považovány za quiescentní, mající mírnou metabolickou a transkripční aktivitu [7]. Spolehlivý marker klidových fibroblastů stále chybí, nicméně fibroblastový specifický protein 1 (fibroblast-specific protein 1 – FSP1 alias S100A4) se této definici zřejmě blíží nejvíce [8]. Je ovšem třeba si uvědomit, že FSP1 není zcela specifický pro fibroblasty. Jeho exprese byla nalezena rovněž u prozánětlivé subpopulace makrofágů v játrech [9] a u nádorových buněčných linií epiteliálního původu [10].

Schopnost aktivace klidových fibroblastů byla poprvé pozorována při procesu hojení ran [11] a později v podmínkách, jako je akutní a chronický zánět a tkáňová fibróza [12]. Pokud dojde k poškození tkáně, rezidentní populace fibroblastů je aktivována, proliferuje a migruje do poraněné oblasti v reakci na signalizaci krevních destiček, které uvolňují svůj bioaktivní obsah, např. transformující růstový faktor β1 (transforming growth factor β1 – TGFβ1), růstový faktor odvozený z destiček (platelet derived growth factor – PDGF) a interleukin 1β (IL1β). Bazální membrána je degradována a dochází k rekrutování dalších fibroblastů a zánětlivých buněk [13]. Takto se chovající fibroblasty se obecně považují za „aktivované“. U aktivovaných fibroblastů vzrůstá produkce vimentinu, aktinu a α-aktinu hladké svaloviny (α-smooth muscle actin – α-SMA kódovaný genem ACTA2), což jim umožňuje vyvíjet kontraktilní síly potřebné k uzavření rány [14]. Kontraktilita je zprostředkována fokální adhezí mezi aktivovanými fibroblasty a molekulami ECM. V důsledku aktivované exprese aktinu hladké svaloviny jsou aktivované fibroblasty často pojmenovávány jako myofibroblasty, tedy buňky na pomezí fibroblastů a myoblastů. Fibroblasty odebrané z místa hojící se rány nebo z fibrotické tkáně kultivované v podmínkách in vitro aktivně syntetizují složky ECM a dělí se více než jejich protějšky izolované z nepoškozených tkání. Mezi produkovanými složkami ECM nechybí kolageny typu I, III, IV a V, různé typy lamininů a fibronektin [15].

Poté, co se rána uzavře, dochází k deaktivaci a masivní apoptóze myofibroblastů. Dlouhodobé přetrvávání myofibroblastů může vést k rozvoji závažných patologických stavů vč. idiopatické plicní fibrózy [16] a nádorů [17]. Mechanizmy podílející se na přetrvávající aktivaci fibroblastů nejsou doposud zcela prozkoumány, nicméně je velmi pravděpodobné, že se tohoto procesu účastní pozitivní zpětná vazba poskytovaná např. biofyzikálními vlastnostmi opravované tkáně. V důsledku zvýšené produkce, ukládání a vzájemné provázanosti ECM proteinů se zvyšuje tuhost ECM v okolí aktivovaných myofibroblastů. Zvýšená tuhost ECM se může podílet na další aktivaci a perzistenci myofibroblastů, což vede k navýšené tvorbě proteinů ECM a opětovnému zvýšení tuhosti ECM za vzniku pozitivní zpětnovazebné smyčky. Během fyziologického hojení ran je tato amplifikační zpětnovazebná smyčka po nějaké době ukončena. Některé studie naznačují, že přežití aktivovaných myofibroblastů závisí na signálech vycházejících z mechanoreceptorů a přenášených signálními drahami reagujícími na mechanickou stimulaci (proces mechanotransdukce). Přerušení mechanotransdukční signalizace u aktivovaných fibroblastů, nikoliv však u neaktivovaných fibroblastů ve zdravé tkáni, vede k indukci apoptózy [18]. Další smyčka pozitivní zpětné vazby může vznikat v signální dráze Twist1-Prrx1-TNC (paired-related homeobox 1; tenascin C). Twist1 a Prrx1 jsou transkripční faktory nezbytné pro vývoj tkání odvozených z mezodermu, které jsou schopny stimulovat přeměnu normálních klidových fibroblastů na fibroblasty aktivované. TNC pak představuje glykoprotein, který se účastní tvorby ECM. Injekce exogenního TNC do místa poranění je schopna indukovat pozitivní zpětnou vazbu mezi Twist1-Prrx1 a TNC a přispívá ke vzniku fibrotické tkáně podobné idiopatické plicní fibróze [19]. Zpětnovazebná smyčka Twist1-Prrxl-TNC může být trvale zapnuta, což vede k patologické aktivaci fibroblastů (obr. 1). Myši postrádající expresi buď TLR4 (toll-like receptor 4), nebo jeho ligandů (např. tenascin C) trpí méně závažnou fibrózou kůže, plic a srdce v důsledku působení bleomycinu [20].

CAF fenotyp

Nádory jsou přirovnávány k ranám, které se nehojí [17], neboť dokážou využít proces hojení ran ke svému prospěchu a ve svém okolí udržovat vysokou míru aktivace fibroblastů. Na rozdíl od procesu hojení rány, ve kterém jsou fibroblasty postupně deaktivovány, zůstávají fibroblasty v TME trvale vystaveny podnětům, které podporují vznik sekrečního fenotypu a fenotypů remodelujících ECM (obr. 2). CAF mohou také získat zvýšenou schopnost autokrinní signalizace a následně vysoce proliferační či migrační fenotyp. Kromě rezidentních tkáňových fibroblastů mohou jako prekurzory CAF sloužit také adipocyty [21], hematopoetické kmenové buňky [22], mezenchymální kmenové buňky odvozené z kostní dřeně [23], buňky epitelů (prostřednictvím epitelo-mezenchymové tranzice – EMT [24,25]) a buňky endotelové (prostřednictvím endotelo-mezenchymové tranzice – EndMT [26]) [27,28]. Aktivované fibroblasty se snadno transdiferencují do chondrocytů, myocytů, adipocytů a endotelových buněk [7].

Definice CAF

Přesná a specifická molekulární definice CAF prozatím neexistuje, což patrně odráží skutečnost, že CAF jsou spíše buněčným stavem než buněčným typem. Většina studií uvádí, že CAF exprimují podobné sady markerů jako myofibroblasty. Nejčastěji využívaným markerem CAF je zřejmě α-SMA, nicméně využívány jsou také další markery jako např. FAP (fibroblast-activation protein), PDGFR-α (platelet-derived growth factor receptor-α) a PDGFR-β. Žádný z těchto markerů ale specificky neoznačuje všechny typy CAF nebo jasně neodlišuje CAF od normálních fibroblastů nebo jiných blízce příbuzných typů buněk [13]. α-SMA je například exprimován rovněž u pericytů a buněk hladké svaloviny, PDGFR-α u astrocytů a PDGFR-β u pericytů a neuronů [13,29]. Vzhledem ke zjevné heterogenitě fibroblastů a jejich různému původu je obtížné rozlišit „pravé“ fibroblasty od buněk podobných fibroblastům. Aby tak bylo možné CAF klasifikovat, musí být použita kombinace několika různých markerů. Například α-SMA-pozitivní CAF mohou být odlišeny od pericytů na základě negativity na NG-2 antigen (neuron glial antigen 2) a RGS5 (regulator of G-protein signaling 5), jelikož pericyty jsou na tyto markery pozitivní [13]. V několika studiích byly identifikovány proteiny, jejichž exprese by měla být specifická pro CAF. Mezi tyto nadějné markery patří asporin [30], kolagen 11α1 (COL11A1) [31] a MFAP5 (microfibrillar-associated protein 5) [32].

Aktivace CAF fenotypu

Zásadní otázkou zůstává, kdy se fibroblast stává CAF. Nomenklatura naznačuje, že se CAF nacházejí pouze v nádorové tkáni, nicméně termín CAF by mohl stejně dobře označovat jakýkoli fibroblast s pronádorovou aktivitou. Důkazy pro existenci CAF, jejichž výskyt předchází vznik malignity, byly získány z prsní tkáně zdravých žen. Zatímco fibroblasty získané z prsní tkáně s vysokou mamografickou denzitou podporovaly rozvoj nádorového onemocnění, fibroblasty odvozené z prsní tkáně s nízkou mamografickou denzitou nikoliv. Následné porovnání genové exprese těchto dvou odlišných typů fibroblastů vedlo k identifikaci CD36 jakožto klíčového markeru ve změně fenotypu fibroblastů [33]. CD36 je glykoprotein, který zastává nezastupitelnou roli v transportu mastných kyselin, a to zejména v srdci, kosterním svalstvu a tukové tkáni. Současně ovlivňuje i obsah adipocytů a akumulaci ECM. Zmíněná pozorování naznačují, že aktivace stromálního programu, jež podporuje nádor, může být v onkogenezi časnou událostí [33]. Zajímavou skutečností je, že populace rezidentních tkáňových fibroblastů z různých částí těla a v rámci jednotlivých orgánů mohou mít výrazně odlišnou náchylnost k získání fenotypu CAF [7]. Například fibroblasty vyskytující se v prostatické tkáni potlačovaly maligní přeměnu imortalizovaného epitelu prostaty [34]. Naopak fibroblasty získané z místa perzistentního zánětu, třeba od pacientů s revmatoidní artritidou, vykazovaly často nádor podporující fenotyp [35]. Rovněž v rámci pro-nádorových CAF se mohou vyskytovat různé subpopulace s odlišnými vlastnostmi. Subpopulace orálních CAF s nižším skóre po barvení α-SMA (CAF typu C1) podporovala proliferaci nádorových buněk, ale potlačovala jejich přeměnu v nádorové kmenové buňky. Na druhou stranu, CAF s vyšším skóre α-SMA barvení (CAF typu C2) exprimovaly nižší hladiny BMP4 (bone morphogenetic protein 4), přičemž jejich přítomnost byla spojena s nižší proliferací buněk karcinomu ústní dutiny, zároveň však i s vyšší frekvencí výskytu nádorových kmenových buněk [36].

Doposud není zřejmé, které procesy jsou zásadní pro aktivaci fenotypu CAF. Četné studie ukázaly, že na rozdíl od nádorových epiteliálních buněk jsou změny počtu kopií genů a onkogenní a nádorově supresorové mutace (např. mutace TP53) u CAF poměrně vzácné [29]. Hybatelem fenotypu CAF jsou zřejmě epigenetické změny (tj. metylace DNA, modifikace histonů, změny v expresi nekódujících RNA aj.) a abnormální aktivace či inaktivace některých signálních drah (obr. 1, 3). Například umlčení CBF-1 (C-repeat-binding factor alias RBP-Jκ) kombinované se sníženou expresí funkčního p53 v kožních fibroblastech postačovalo pro aktivaci fenotypu CAF podporujícího indukci nádorů odvozených od keratinocytů. Na snížení exprese p53 se podílel fibroblastový růstový faktor 2 (fibroblast growth factor 2 – FGF2) vylučovaný sousedními epiteliálními nádorovými buňkami [37]. Jak již bylo zmíněno, jako významný aktivátor fenotypu CAF může sloužit také zpětnovazebná smyčka Twist1-Prrxl-TNC (obr. 1) [19], CCN2 alias růstový faktor pojivové tkáně (connective tissue growth factor – CTGF) [38], umlčení exprese TGFβR2 (transforming growth factor-β type 2 receptor) [39], a naopak aktivace faktorů TLR4 [40,41], CCR5 (C-C chemokine receptor type 5) [42,43] a IRF3 (interferon regulatory factor 3) [44]. Prozánětlivý cytokin LIF (leukemia inhibitory factor) se podílí na aktivaci Janusovy kinázy 1 (JAK1) a transkripčního faktoru STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3), čímž aktivuje DNA-metyltransferázy 1 (DNMT1) a DNA-metyltransferázy 3b (DNMT3b) a také hypermetylaci a umlčení některých klíčových regulačních genů. V důsledku těchto procesů LIF zvyšuje kontraktilitu aktomyozinu a umožňuje tak CAF vytvářet cesty skrze ECM, které jsou následně využívány nádorovými buňkami při kolektivní invazi [45,46]. Kromě výše popsaných mechanizmů mohou být normální fibroblasty konvertovány na CAF působením microRNA obsažených v exozomech a mikrovezikulech produkovaných nádorovými buňkami. Tuto konverzi může vyvolat např. miR-214 u nádorů vaječníku a miR-155 u karcinomu pankreatu [47].

CAF v nádorovém mikroprostředí

Vícekrokový proces progrese nádorového onemocnění vyžaduje podporu buněk obsažených ve stromatu. Klidové fibroblasty však na rozdíl od CAF vykazují spíše inhibiční účinky na buněčnou proliferaci a motilitu nádorových buněk [48]. Pokud má tedy vzniknout nádor, TME musí být přeprogramováno na nádorově permisivní fenotyp. Současné studie naznačují, že vytvoření nádorově permisivního prostředí může dokonce předcházet vzniku samotného ložiska nádorových buněk. Signály indukované buněčným a tkáňovým stresem mohou spustit koordinovaný program koevoluce, který umožní zrod a proliferaci nádorových buněk a upevní interakce mezi nádorovými buňkami a mikroprostředím [29]. Komunikace v rámci TME může být významně ovlivňována pomocí exozomů. Exozomy uvolňované nádorovými buňkami nebo jinými buňkami stromatu mohou do stromálních fibroblastů dodávat aktivní růstové faktory a cytokiny, stejně jako funkční fragmenty DNA a kódující a nekódující RNA, a indukovat jejich aktivaci [49–54]. Po přeprogramování klidových fibroblastů na CAF dochází k dynamickým změnám jejich metabolomu a sekretomu, což potencuje trvalou autokrinní aktivaci CAF. Bylo prokázáno, že fenotyp CAF (zejména jeho sekreční vzorce) do značné míry přetrvává při in vitro kultivaci i bez pokračující stimulace CAF nádorovými buňkami [55].

CAF a podpora primárního nádoru

CAF vylučují mnoho růstových faktorů a cytokinů, které mohou podporovat růst nádorových buněk a ovlivňovat ostatní buňky nádorového mikroprostředí. Jako příklad může být uveden růstový faktor hepatocytů (hepatocyte growth factor – HGF), dále pak fibroblastové růstové faktory FGF2 a 7, TGFβ, PDGF, osteopontin, SFRP2 (secreted frizzled-related protein 2), faktor 1 odvozený od stromatu (stromal derived factor1 – SDF-1), vaskulární endotelový růstový faktor A (vascular endothelial growth factor A – VEGFA), interleukin 6 (IL6), interleukin 8 (IL8) a mnoho dalších [7,56]. Bez aktivní tvorby nových krevních cév pro zásobování kyslíkem a živinami nejsou nádory schopny růst. Důležité je proto i pozorování, že faktory produkované CAF podporují angiogenezi a přispívají tak k zajištění růstových požadavků maligních nádorů. Výše uvedený SDF-1 (také známý jako CXCL12) produkovaný fibroblasty stimuluje neovaskularizaci nádoru prostřednictvím náboru progenitorových buněk endotelu [55]. SDF-1 je rovněž ligandem CXCR4 (C-X-C chemokine receptor type 4), který je vysoce exprimován na nádorových buňkách a po aktivaci přímo stimuluje proliferaci nádorových buněk [55]. Alternativně mohou CAF modulovat angiogenezi a průtok krve nádorem také nepřímo, a to pomocí remodelace ECM [57]. Kromě schopnosti vylučovat růstové faktory a podporovat proliferaci nádorových buněk působí CAF také jako promutagenní agens poškozující DNA okolních buněk prostřednictvím produkce reaktivních forem kyslíku [58].

CAF podporují růst nádorových buněk rovněž ovlivněním jejich metabolických drah. Nádorové buňky většinou preferují glukózu jakožto zdroj energie. Samotná glukóza však nedokáže pokrýt jejich potřebu uhlíku, a je proto zřejmé, že nádorové buňky musí využívat i jiné zdroje. Některé nádorové buňky jsou závislé na glutaminu a byla prokázána i konzumace laktátu. V průběhu kancerogeneze se CAF přizpůsobují metabolizmu nádorových buněk a stávají se k nim komplementárními za vzniku metabolické symbiózy. Metabolická symbióza nabízí účinný systém, ve kterém mohou nádorové buňky využívat metabolity produkované fibroblasty. Jedním z typů metabolické symbiózy je situace, kdy dobře okysličené anabolické nádorové buňky konzumují laktát poskytovaný katabolickými fibroblasty, které jsou působením nádorových buněk tlačeny do glykolytického metabolizmu a autofagie (obr. 3). Katabolický a glykolytický fenotyp fibroblastů může být vyvolán např. ztrátou exprese caveolinu-1 (CAV1) [59]. Metabolický posun od oxidativní fosforylace ke glykolýze doprovázený zvýšenou expresí laktátového exportéru MCT4 (monocarboxylate transporter 4) vykazoval rovněž fibroblasty exprimující snížené množství CD36 [60,61]. Metabolická symbióza CAF s nádorovými buňkami se dynamicky vyvíjí v závislosti na množství kyslíku, extracelulární dostupnosti metabolitů a přítomnosti signálních molekul. Metabolická symbióza se tak může vyskytnout i v opačném uspořádání, kde oxidační metabolizmus CAF podporuje růst glykolytických nádorových buněk [62]. Toto je zřejmě případ HNSCC – CAF zde vylučují HGF a stimulují tak glykolytický fenotyp v buňkách HNSCC; buňky HNSCC pak produkují FGF2, jež potencuje využívání laktátu fibroblasty [63].

CAF podporují kancerogenezi také změnou dostupnosti metabolitů v nádorovém mikroprostředí. Například významně ovlivňují biologickou dostupnost tryptofanu a argininu, přičemž hladiny těchto metabolitů jsou klíčové pro aktivitu a funkci T lymfocytů. Metabolická konkurence mezi CAF a buňkami imunitního systému tak může vést ke snížené protinádorové reaktivitě T lymfocytů akumulovaných v nádorech [7]. Přítomnost CAF zároveň zapříčiňuje zvýšenou expresi adhezivních molekul, např. vaskulární intercelulární adhezivní molekuly 1 (vascular cell adhesion molecule 1 – VCAM-1) a intracelulární adhezivní molekuly 1 (intercellular adhesion molecule 1 – ICAM-1), v nádorovém mikroprostředí a dopomáhá tak k rekrutování makrofágů asociovaných s nádorem, které dále přispívají k vytváření nádorově permisivní niky [64]. Vazba makrofágů asociovaných s nádorem na molekuly VCAM-1 nádorových buněk umožňuje přenos signálů, které zajišťují přežití metastazujících buněk karcinomu prsu v plicní tkáni bohaté na leukocyty [65].

CAF a vznik metastáz

CAF v TME nejenže podporují růst nádorových buněk, ale zvyšují také jejich invazivitu. CAF podporují metastazování nádorových buněk prostřednictvím přechodných heterotypických mezibuněčných kontaktů a produkcí parakrinně působících faktorů [66]. CAF zároveň ovlivňují tuhost ECM. U mnoha nádorů je původní tkáň nahrazena hustou ECM bohatou na kolagen, která se podobá jizvě. K tvorbě remodelovaných a nefyziologicky orientovaných kolagenních sítí významně přispívají právě CAF skrze produkci lysyl-6-oxidázy. Mechanická stimulace nádorových buněk pomocí těchto kolagenních sítí hraje významnou roli v aktivaci invazivního programu nádorových buněk [67]. Molekulární signalizace mezi nádorovými buňkami a CAF dále stimuluje migraci obou typů buněk a modifikuje sousední ECM a bazální membránu [68]. Přestavba ECM pomocí matrixových metaloproteináz (matrix metalloproteinases – MMPs) produkovaných CAF je jedním z nejdůležitějších kroků v progresi nádorového onemocnění. Za fyziologických podmínek je udržována rovnováha mezi aktivitou MMP a jejich inhibitorů. Tato rovnováha je v průběhu kancerogeneze posunována směrem k aktivaci MMP. Výsledkem je významná remodelace ECM, která přispívá k angiogenezi a invazivnímu chování nádorových buněk [58]. Při invazi do sekundárních ložisek mohou nádorové buňky migrovat samostatně, je-li u nich aktivován pseudomezenchymální fenotyp, nebo mohou k migraci využívat tažné síly CAF [69]. CAF jsou manipulovány nádorovými buňkami tak, aby se staly invazivními a schopnými remodelace ECM, a právě CAF zřejmě určují směrovost celé migrující metastatické skupiny. Ve srovnání s normálními fibroblasty produkují CAF ECM bohatou na fibronektin s anizotropní orientací vláken, která nádorové buňky navádí k migraci určitým směrem [70]. CAF pro nádorové buňky budují také cestu skrze ECM a zároveň slouží jako generátor tažné síly [69]. U spinocelulárních karcinomů je přenos tažné síly zprostředkován heterofilní adhezí, na níž se podílí N-kadherin na membráně CAF a E-kadherin na membráně nádorových buněk. Tato adheze funguje jako mechanický receptor, který podporuje invazi nádorových buněk spuštěním signální dráhy β-katenin–vinculin a remodelací aktinu v obou typech společně migrujících buněk [71]. CAF exprimující N-kadherin slouží jako pozitivní stimulátor proliferace a migrace nádorových buněk rovněž u melanomu. Buňky melanomu nejsou schopny produkovat IGF-1 (insulin-like growth factor 1) samy, a spoléhají proto na IGF-1 vylučovaný okolními fibroblasty [72]. Bylo též pozorováno, že metastazování nádorových buněk podporuje zvýšená exprese fibroblastového CAV1 [73], zatímco nízká exprese fibroblastového CAV1 napomáhala vzniku metabolické symbiózy u primárních nádorů (obr. 3). Vzhledem k tomu, že zvýšená kontraktilita (potřebná k pohybu buněk) je spíše než pro sekreční CAF charakteristická pro jejich myofibroblastové subtypy [8], mohla by exprese CAV1 potenciálně sloužit jako nová metoda charakterizace fibroblastů. Další subpopulací CAF jsou ty, které exprimují tenascin C a VEGFA. Tyto CAF byly identifikovány jako klíčové mediátory metastazování karcinomu prsu do plic [74]. CAF v metastázách mohou vylučovat interleukin-11, který v nádorových buňkách aktivuje signalizaci GP130-STAT3. Aktivace této dráhy umožňuje přežití nádorových buněk v cílové tkáni, a tím podporuje nádorovou kolonizaci orgánů [75].

Význam CAF u HNSCC

Navzdory intenzivnímu výzkumu jsou přesné mechanizmy kancerogeneze a rozvoje HNSCC doposud poměrně nejasné. Shromážděné důkazy však naznačují, že nestačí sledovat kumulaci onkogenních mutací v samotných nádorových buňkách. Interakce mezi nádorovými buňkami a buňkami stromatu HNSCC mohou totiž dramaticky ovlivnit progresi tumoru. Cílení terapeutického efektu do nádorového stromatu tak může představovat nový způsob, jak efektivně omezit metastazování [76]. Slibným zástupcem terapeuticky cílitelných buněk stromatu jsou CAF, jelikož nádory pozdního stadia HNSCC často obsahují až 80 % těchto buněk [63]. Buňky HNSCC mohou přispívat k vývoji fenotypu CAF prostřednictvím sekrece TGFβ1 či IL1β. Tato aktivita vede k zvýšení produkce HGF a SDF-1 u CAF, což hraje zásadní roli v interakci mezi CAF a buňkami karcinomu dutiny ústní [77]. Některé studie uvádějí, že transdiferenciace fibroblastů na CAF závisí na enzymu NAD (P) H oxidáze 4 (NOX4). Zvýšená exprese NOX4 byla nalezena u mnoha typů nádorů, vč. HNSCC [78]. Rozvoj interakcí mezi buňkami HNSCC a CAF následně indukuje zvýšenou expresi TGFβ, VEGF, TNFα, HGF, IL1α, IL1β, IL6, IL33, CXCL12 a MMPs u obou typů buněk. Zvýšené koncentrace těchto rozpustných faktorů přispívají k růstu, migraci a invazivnímu chování buněk HNSCC. U fibroblastů kultivovaných společně s buňkami HNSCC byly také prokázány zvýšené hladiny fibronektinu, tenascinu C, trombospondinu 1 a latentního TGFβ vázajícího proteinu 2 (latent TGF-beta binding protein 2 – LTBP2) [79]. Faktory vylučované CAF, jako např. karboxypeptidáza E, růstový faktor destiček D (platelet-derived growth factor D – PDGFD), EFEMP1 (EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1), IBP5 a IBP7 (insulin-like growth factor binding proteins), výrazně zvyšovaly signalizaci skrze receptory epidermálního růstového faktoru, receptory inzulínu podobného růstového faktoru a PDGFR nádorových buněk, a tím podporovaly růst nezávislý na ukotvení a expresi markerů nádorových kmenových buněk [80]. Dalším faktorem, který je produktem CAF a může významně ovlivňovat vznik HNSCC metastáz, je BDNF (brain-derived neurotrophic factor). Některé studie naznačují, že signální dráha BDNF-TrkB (neurothrophin receptor B) může být kritickou složkou progrese HNSCC [81]. TrkB indukuje v nádorových buňkách EMT a má klíčovou úlohu v invazivním chování HNSCC [82].

Srovnání sekrečních profilů CAF u karcinomu dutiny ústní a neaktivovaných fibroblastů prokázalo v případě prvně jmenovaných buněk také zvýšenou expresi proteinů podílejících se na organizaci ECM a metabolizmu kolagenu. Exprese N-terminálního propeptidu kolagenu typu I signifikantně korelovala s přítomností vysoce migrujících CAF ve frontální části tumoru a byla spojena s významně zkráceným přežíváním pacientů s karcinomem dutiny ústní [83]. Ve srovnání s nenádorovými fibroblasty exprimují CAF asociované s HNSCC také vyšší hladiny proteinu NAB2 (NGFI-A-binding protein 2) [84] a kolagenu typu COL11A1, který byl v některých studiích označen jako slibný marker CAF [31]. Rovněž se podařilo prokázat, že COL11A1 přispívá ke kancerogenezi HNSCC a může sloužit jako potenciální terapeutický cíl [85]. S progresí HNSCC vzrůstala v CAF rovněž i exprese periostinu [86]. Periostin je sekretovaný protein ECM kódovaný genem POSTN, který mj. umocňuje metastatické schopnosti nádorů HNSCC a podporuje vznik nádorových kmenových buněk. Děje se tak díky vazbě periostinu na PTK7 (protein tyrosine kinase 7) a aktivaci signální dráhy Wnt/β-Catenin. Kombinovaná detekce POSTN a PTK7 může být proto potenciálním prognostickým a diagnostickým ukazatelem a slibným terapeutickým cílem [87]. Další funkční molekulou, která přispívá k udržování populace nádorových kmenových buněk v TME, tentokráte exprimovanou na povrchu CAF, je CD44 [88].

Zásadní význam pro kancerogenezi HNSCC mají rovněž imunomodulační účinky CAF. Některé studie potvrzují, že CAF jsou významnými producenty prostaglandinu E2 (PGE2) [89], který stimuluje buněčnou proliferaci a invazivní chování buněk HNSCC, inhibuje apoptózu a narušuje imunitní dohled [90]. Jelikož buňky HNSCC konstitutivně exprimují PGE2 receptory EP1, EP2 a EP3, může PGE2 také modulovat invazivní vlastnosti samotných nádorových buněk [91]. Změny v expresi genů různých proteinů ECM asociované se signalizací TGFβ a aktivací CAF fenotypu spojují CAF rovněž s únikem nádorových buněk HNSCC imunitnímu systému a selháním imunoterapie [92]. CAF se zřejmě významnou měrou podílí také na vzniku rezistence nádorových buněk vůči cisplatině [93]. Farmakologická inhibice Vps34, klíčového mediátoru autofagie, u CAF dokázala tuto rezistenci opět zvrátit, což naznačuje, že autofagický fenotyp je důležitým rysem CAF. Pomocí sekreční autofagie mohou být ovlivňovány hladiny významných cytokinů v TME. Tímto způsobem je regulována např. hladina interleukinů IL6 a IL8 [94]. Dalším faktorem, kterým se CAF zřejmě podílí na imunomodulaci v TME, může být gelactin 1 (Gal-1). Gal-1 je jedním z 15 evolučně konzervovaných proteinů vázajících β-galactosid, který vykazuje biologicky rozmanité aktivity v patogenezi zánětu a nádorového onemocnění. U Hodgkinova lymfomu zprostředkovává Gal-1 imunosupresi CD8⁺ T lymfocytů [95]. Předpokládá se také, že Gal-1 hraje roli při vytváření imunitní tolerance v těhotenství [96]. Inhibice exprese Gal-1 v CAF také potlačuje tvorbu metastáz karcinomu dutiny ústní [97].

Závěrem lze říct, že se CAF v rámci patogeneze HNSCC podílejí na mnoha kritických bodech nádorové transformace, jako jsou vytváření nádorově permisivní struktury ECM a metabolické a imunitní přeprogramování TME, s dopadem na metastazování a adaptivní rezistenci vůči chemoterapii a radioterapii. Pleiotropní působení CAF na nádorové buňky je pravděpodobně odrazem heterogenity a plasticity jejich populace, s kontextově závislým vlivem na kancerogenezi. Specifické vlastnosti CAF poskytují mnoho cílitelných molekul, které by mohly v budoucnu hrát významnou roli v terapii HNSCC.

Práce na tomto článku byla podpořena projektem AZV 16-29835A.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

doc. RNDr. Michal Masařík, Ph.D.

Ústav patologické fyziologie LF MU

Kamenice 5

625 00 Brno

e-mail: masarik@med.muni.cz

Obdrženo: 18. 6. 2019

Přijato: 9. 9. 2019